Rev Med Chile 2010; 138: 543-550

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

 

Polimorfismos del gen del receptor de muerte celular programada 1 (PDCD1) y diabetes tipo 1 en población Chilena

Programmed cell death 1 (PDCD1) gene polymorphisms and type 1 diabetes in Chilean children

 

SYLVIA FLORES R.^1a, MEGAN BEEMS^1b, AMAYA OYARZÚN A.^1c, ELENA CARRASCO P.^2d, FRANCISCO PÉREZ B.^1ac

¹Laboratorio de Genómica Nutricional. Departamento de Nutrición. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. ²Unidad de Diabetes. Hospital San Juan de Dios. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. ^aBiotecnólogo. ^bBachiller. ^cBioquímico Phd. ^dNutricionista, Msc.

Dirección para correspondencia

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Background: Programmed cell death 1 (PDCD-1) immune-receptor is a key element in the negative regulation of peripheral tolerance in T cells. Several polymorphisms of this gene have been described and it is linked with susceptibility to autoimmune diseases like Lupus and Multiple Sclerosis. Aim: To analyze four gene polymorphisms of PDCD-1 gene and explore its possible contribution as a susceptibility gene for type 1 diabetes (T1D). Patients and Methods: We analyzed 160 cases with T1D of recent diagnosis aged 9.5 ± 3.3 years and 160 control children aged 10.7 ± 3.1 years. Four genetic variants of PDCD-1 gene were studied (PD1.2; PD1.5; PD1.6 and PD1.9) by polymerase chain reaction and restriction enzymes. Autoantibodies GAD65 and anti-IA-2 were also measured in all studied children. The comparison of allelic and genotypic frequency and consistency with respect to Hardy-Weinberg equilibrium test were analyzed using Chi-square and Fisher exact test. Results: No differences between cases and controls were observed for PDCD1.2; PDCD1.5 and PDCD1.9 polymorphisms. PDCD1.6 polymorphism (carriers of allele A) had a higher frequency in the control group (0.794 versus 0.644, p < 0.017). There was no particular association of these polymorphisms with anti- GAD65 and anti-IA-2 antibodies among patients with T1D. Conclusions: Only PDCD1.6 polymorphism showed differences between T1D cases and controls. Possibly, none of these genetic variants of PDCD1 has a relevant role as a marker for T1D in the Chilean population.

(Key words: Diabetes mellitus; Genetic; Human; PDCD-1 protein; Polymorphisms; Type 1.)

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La diabetes mellitus tipo 1 (DM1) constituye el trastorno endocrino-metabólico más frecuente en la infancia y adolescencia, caracterizado por la incapacidad del páncreas de producir insulina, lo que confere a esta enfermedad características únicas entre las patologías crónicas infantiles. Su etiología es extremadamente compleja, donde intervienen factores ambientales que interaccionan con componentes de predisposición genética que desembocan en un irreversible ataque de origen autoinmune contra las células productoras de insulina, ubicadas en el islote pancreático¹. Dentro de los factores ambientales fguran infecciones virales^2,3, toxinas y dieta⁴, entre otros, conduciendo de alguna manera aún desconocida a la ruptura de la tolerancia autogénica normal.

En relación a los factores genéticos, el sistema mayor de histocompatibilidad (MHC) es el candidato principal, desde hace tres décadas, debido al papel central que juega justamente en el proceso de tolerancia autogénica. Sin embargo, no constituye un marcador absoluto de la enfermedad, lo que ha generado una intensa búsqueda de nuevos genes o regiones génicas candidatas^5-7.

Actualmente, la búsqueda de genes candidatos está dirigida hacia el descubrimiento de nuevas regiones génicas de susceptibilidad a DM1. En este sentido, se han identifcado dos regiones que son objeto de amplias investigaciones. La variante PTPN₂₂ del gen que codifca para la proteína tirosina-fosfatasa (LYP) como nuevo factor de susceptibilidad a DM1 actuando también a través de la regulación de la respuesta del linfocito T⁸ y los genes que codifcan para los receptores de muerte celular programada 1 (PDCD1) dada su infuencia en el reconocimiento de estructuras que regulan negativamente la relación entre la célula presentadora del antígeno (APC) y el linfocito T⁹.

Las moléculas de muerte celular programada (PDCD1) pertenecen a la familia de receptores CD28 y son expresadas en las células activadas T, B y mieloide¹⁰. Se ha postulado que PDCD1 juega un importante rol en la inducción y/o mantención de la tolerancia periférica. Por medio de la interacción con sus ligandos (PDL1 y PDL2), PD-1 inhibe la estimulación antigénica de las células T y B. Los li-gandos PD-Ls pertenecen a la familia B7 y pueden ser expresados tanto en órganos linfoides, como no linfoides. El balance de señales inhibitorias (PDCD1 y CTLA-4) y de estimulación (B7) provee a las interacciones en la superfcie celular de los linfocitos T y células presentadoras de antígenos de los mecanismos cruciales de la homeostasis celular para el mantenimiento de la tolerancia periférica¹¹. La disrupción de este delicado balance puede conducir al quiebre de la auto-tolerancia y por lo tanto generar un desbalance conducente a la patogénesis de las enfermedades autoinmunes.

El gen humano para PDCD1 está localizado en el cromosoma 2q37 y se han identificado varios polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) asociados con desórdenes autoinmunes tales como: lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoidea (AR), tiroiditis y DM1 entre otras^12,13. En el caso de LES, los estudios realizados en Suecia muestran asociación del polimorfismo PDCD1 con manifestaciones renales del LES¹⁴. También se ha descrito asociación en población China¹⁵. Estudios en Taiwán muestran una asociación positiva¹⁶ y otra negativa para LES¹⁷. Este fenómeno también se observó en una cohorte poblacional multiétnica conformada por caucásicos, asiáticos, hispano y afroamericanos en Estados Unidos de Norteamérica (USA)¹⁸ y en un estudio multi-poblacional europeo¹⁹, efecto similar se ha observado en población mexicana²⁰. El estudio realizado en población española, mostró resultados contradictorios^21,22. En AR, los hallazgos son similares en cuanto a asociación positiva en población de Taiwán²³, y negativa en japoneses²⁴. También se han descrito otras asociaciones de estos polimorfismos con: espondilitis anquilosante en coreanos²⁵, encefalomielitis autoinmune²⁶, enfermedad hepática autoinmune^27,28 y cirrosis biliar²⁹.

En ratas NOD el polimorfismo en PDCD1 y su ligando PD-L1 se asocia con diabetes autoinmune³⁰. El modelo knock out para PDCD1^-/- mostró una fuerte polarización hacia la respuesta Th1, autoinmunidad acelerada e infiltración de islotes³¹. Los estudios realizados en pacientes con DM1 han mostrado resultados negativos en población francesa³² y otros que sugieren un papel positivo del gen PDCD1 con susceptibilidad a la DM1 en población danesa³³ y japonesa^34,35. El propósito de este estudio fue analizar cuatro polimorfismos del gen PDCD-1 y explorar su posible contribución como gen de susceptibilidad a la diabetes tipo 1 (DM1) en la población Chilena.

Pacientes y Métodos

Los casos con DM1 correspondieron a niños y adolescentes menores de 15 años con diagnóstico reciente de la enfermedad (definido como evento ocurrido en las 3 semanas previas al ingreso al estudio), provenientes de diversos centros hospitalarios de la Región Metropolitana (Hospitales San Borja-Arriarán, Exequiel González Cortés y San Juan de Dios). Ciento sesenta pacientes con DM1 fueron incorporados al estudio. El grupo control estuvo formado por 160 niños aparentemente sanos, sin antecedentes familiares de diabetes u otras enfermedades autoinmunes (datos obtenidos mediante encuesta familiar). Las características clínicas de ambos grupos de niños se presentan en la Tabla 1. Los niños controles fueron contactados de tres colegios de Santiago (comunas de Quinta Normal, Independencia y Macul), fueron incorporados al azar en un llamado abierto y voluntario realizado en cada colegio por intermedio de los centros de padres respectivos por lo que estimamos que son comparables en términos de su estatus socio-genético respecto de los casos con DM1. En todos los casos y controles se analizó la frecuencia de cuatro polimorfismos para el gen PDCD1 y un perfil de auto-anticuerpos anti-GAD65 y anti-IA-2. El protocolo de esta investigación fue aprobado por los comités de ética respectivos y todos los pacientes, controles o sus padres o tutores entregaron su consentimiento por escrito.

Extracción de ADN y determinación de polimorfismos PDCD1

El ADN genómico se extrajo a partir de una muestra de sangre periférica (3 ml) utilizando técnicas estándares de lisis celular (Winkler, Santiago, Chile). Los polimorfismos PDCD1 se determinaron mediante la utilización de partidores específi-cos de acuerdo a la Tabla 2. Cada reacción de PCR fue realizada en 25 µL de solución conteniendo 5 pmoles de cada par de partidores, 50 ng de ADN de cada una de las muestras, 200 µM de cada dNTP y 0,5 U de Taq-Polimerasa. La reacción de PCR se estandarizó en un período de 3 minutos a 95°C para la activación de la enzima, seguido de 35 ciclos que consistieron en un período de denaturación del ADN a 95°C por 15 segundos, un período de unión de los partidores a 64°C (PD 1,5; PD 1,2), 54°C (PD 1,9), 56°C (PD 1,6) y por 15 segundos y un período de extensión de la polimerasa a 72°C por 15 segundos. Para realizar el PCR se ocupo un Termociclador Biometra^R (Alemania). Para llevar a cabo el análisis mediante fragmentos de restricción (RFLP) se tomaron 6 µL de cada producto de PCR que fue incubado a 37°C durante 1 hora con 0,5 U de la endonucleasa de restricción apropiada para cada polimorfismo. El producto de digestión fue visualizado en gel de agarosa al 2%.

Análisis serológico de anticuerpos

Los anticuerpos anti-GAD65 y anti-IA2 fueron determinados mediante inmunoensayo enzimático (ELISA) con el uso de kits comerciales (Medizym® Diagnostic, Berlin, Alemania). La detección de anticuerpos se llevó a cabo de manera semi-cuantitativa tomando como referencia el valor de 5 UI/mL para GAD65 y 10 UI/mL para IA2. Aquellas muestras con un título mayor o igual a dicho valor fueron consideradas muestras positivas. Se obtuvo una sensibilidad y especficidad del 92,3% y 98,6% para anti-GAD65 y de 75% y 98% para anti-IA-2. Todos los valores se encuentran dentro de los rangos esperados para un ELISA de acuerdo al programa DASP (Diabetes Antibody Standardization Program)³⁶.

Estadística: Tanto el análisis de las frecuencias alélicas y genotípicas en el estudio caso-control, como el porcentaje de autoanticuerpos entre los pacientes diabéticos y el grupo control se analizaron con la prueba estadística de c² mediante el software SHEsis, el cual también se utilizó para determinar el equilibrio de Hardy-Weinberg en el estudio caso-control (p value < 0,05 fue considerado como estadísticamente significativo).

Resultados

La Tabla 3 muestra la distribución de todos los polimorfismos PDCD1 analizados en este estudio. El análisis del polimorfismo PDCD1.2 no mostró diferencias relevantes al comparar pacientes con DM1 y controles. La frecuencia de la combinación A/A para esta variante genética fue prácticamente nula en la población analizada. Además, la distribución de este polimorfismo no se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg. En relación al polimorfismo PDCD1.5 de acuerdo al p-value global, se observaron diferencias significativas al comparar casos con DM1 y controles (p = 0,004), con una mayor frecuencia del genotipo C/C en controles (0,231 versus 0,169).

El polimorfismo PDCD1.6 mostró diferencias significativas al comparar casos con DM1 y controles, indicando una posible asociación del genotipo G/G con DM1 (0,356 versus 0,206, p = 0,004). Finalmente, el polimorfismo PDCD1.9 no mostró diferencias significativas al comparar casos con DM1 y controles, la frecuencia del genotipo T/T fue nula en los dos grupos y esta variante no se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg.

Los resultados de la Tabla 4 muestra que los haplotipos CCGA (12,2 %; OR = 1,859) y TTGG (19,6 %; OR = 2,362) son bastante más frecuentes en la población con DM1 generando los más altos OR, en ambos casos estos haplotipos podrían llegar a constituirse en marcadores de predisposición para la enfermedad. Las combinaciones haplotípicas TTGA, TCGA y TCGG mostraron los valores más bajos de OR, baja frecuencia en el grupo con DM1 y por lo que podrían plantearse como posibles haplotipos de protección.

Discusión

La DM1 es una enfermedad en la que inter-actúan factores genéticos y ambientales. Desde el punto de vista inmunológico ha sido descrita como eminentemente autoinmune, aunque los mecanismos de origen apoptótico cada día adquieren mayor relevancia en su etiología. Desde el punto de vista de la distribución de los auto-anticuerpos, nuestros resultados mostraron que más de la mitad de los pacientes diabéticos estudiados presentaron al menos uno de los dos anticuerpos cuantificados (GAD65 e IA-2), mientras que en el grupo control la presencia de dichos anticuerpos fue prácticamente nula. Estos resultados no son sorprendentes, puesto que desde hace tiempo se conoce que la presencia de una batería de anticuerpos como: GAD65, IA2 e IAA se manifestan en el inicio de la DM1 y se han asociado con un mayor riesgo para desarrollar esta patología³⁶.

Dado el importante rol que manifiestan tanto la molécula PD-1 como CTLA-4 en la regulación negativa de la proliferación de células T, estos inmuno-receptores han sido objeto de innumerables estudios con el fin de establecer su relación con patologías de origen autoinmune^12,37. Considerando que estas proteínas son una señal muy relevante en los procesos de regulación negativa de las células T¹¹, se han realizado múltiples análisis genéticos que evidencian la asociación de varios polimorfismos en las proximidades del gen PDCD-1³⁸ dentro de los cuales figuran los polimorfismos PDCD 1.2, PDCD 1.5, PDCD 1.6, PDCD 1.9, como locus importantes de asociación con enfermedades autoinmunes, y en particular con DM1 en distintas poblaciones a nivel mundial.

En este sentido, nuestro estudio mostró que los polimorfismos PDCD 1.5 y PDCD 1.6 tienen una asociación cruda mayor que los polimorfismos PDCD 1.2 y PDCD 1.9 con DM1. Sin embargo, ningún polimorfismo en forma individual alcanzó un nivel de relevancia como para ser considerado un marcador genético de la DM1. Lo anterior, re-afirma una vez más el hecho de que los factores de riesgo genéticos descritos hasta la fecha en la DM1 no son absolutos, se distribuyen heterogéneamente entre las distintas poblaciones, probablemente debido a la activa participación de factores ambientales en la etiología de la enfermedad^3,4.

En base a los análisis realizados en este estudio, podemos decir que nuestros resultados genéticos se acercan más a los obtenidos en población europea que a los observados en población asiática, lo cual guardaría cierta concordancia con los datos de composición poblacional actual que indican que nuestra población esta compuesta principalmente por individuos de ascendencia caucásica. No obstante, se debe considerar que el tamaño muestral es aún pequeño para realizar consideraciones mayores. Los datos de frecuencias polimórficas para el gen PDCD1 analizadas en este estudio no mostraron una especial distribución en la población con DM1, sugiriendo que este marcador de susceptibilidad tiene un efecto nulo o muy pequeño en nuestra población.

Existen evidencias que establecen que el gen PDCD1 y sus moléculas ligando son un eficiente regulador negativo de la activación del linfocito T¹³, además se ha planteado que esta molécula o sus ligandos podrían ser considerados como un marcador de "agotamiento" de células T, es decir, perdida de regulación negativa, hiperactivación y alteración apoptótica de la célula T alterada³⁹. Se ha observado que al bloquear la interacción del receptor PD-1 con su ligando PD-L1 existe una reversión del fenotipo "agotado". Esto se llevo a cabo administrando anticuerpos anti-PD-L1, lo que resultó en la reactivación de las células T, aumentando la producción de citoquinas, su proliferación y su actividad citotóxicas³⁹.

Recientemente, se ha demostrado que alteraciones intestinales estarían asociadas a pacientes con DM1 o a individuos en riesgo de desarrollar ésta enfermedad. Esta nueva forma de visualizar la enfermedad le da un énfasis particular a las células T, las cuales cumplirían un papel central en el equilibrio de tolerancia. La concepción de un "intestino perforado" dentro del marco de esta patología permitiría una mayor exposición del sistema inmune intestinal a ciertos antígenos comunes, que en presencia de una microbiota alterada reduciría la auto-tolerancia mediada por las células T reguladoras^40,41. En este nuevo escenario, los estudios dirigidos a la caracterización de polimorfismos funcionales en la célula T adquieren un a relevancia fundamental.

Agradecimientos: Los autores agradecen la colaboración de todos los niños y sus familias participantes en este estudio. A los Hospitales San Juan de Dios, San Borja-Arriarán y a la Fundación de Diabetes Juvenil de Chile.

 

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Recibido el 4 de enero de 2010, aceptado el 21 de abril de 2010.

Esta investigación fue financiada con los proyectos FONDECYT 1060790 y ENLACE 09/07 de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile.

Correspondencia a: Francisco Pérez Bravo. Laboratorio de Genómica Nutricional Departamento de Nutrición. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Avda. Independencia 1027 Santiago, Chile. e-mail: fperez@med.u Chile.cl