Biomarker der internen Exposition gegenüber toxikologisch relevanten Kontaminanten in Lebensmitteln

Die aussagekräftige Risikobewertung von Inhaltsstoffen und Kontaminanten in Lebensmitteln erfordert eine quantitative Aussage über das Gefährdungspotenzial (engl. hazard) der Substanz – idealerweise einen abgeleiteten Wert für die akzeptable bzw. tolerierbare tägliche Aufnahmedosis (ADI bzw. TDI) oder eine Wirkdosis aus einer tierexperimentellen Langzeitstudie im Fall von gentoxischen Kanzerogenen. Diese Dosis wird bei der Risikobewertung der realen Expositionsdosis des Menschen gegenübergestellt (ohne Exposition gibt es kein Risiko). Klassisch werden Expositionsdaten aus Gehaltsdaten der Substanz in Lebensmitteln und den Verzehrsdaten dieser Lebensmittel erhoben. Idealerweise muss dazu eine valide analytische Methode für alle relevanten Lebensmittelmatrizes etabliert sein, und es muss für die relevanten Lebensmittel ein entsprechend großer, aktueller und möglichst repräsentativer Datensatz erhoben worden sein. Bei den Verzehrsdaten werden zurzeit in Deutschland üblicherweise die Daten der Nationalen Verzehrsstudie II (NVS II) verwendet. Sie wurden zwischen November 2005 und Januar 2007 erhoben und sind mit einem Alter von nun mehr als 10 Jahren nur bedingt aktuell. Aus beiden Datensätzen lässt sich mit modernen statistischen Verfahren, die sowohl die Variationen bei den Gehaltsdaten als auch bei den Verzehrsdaten berücksichtigen, ein Bild der Verteilung der Exposition innerhalb einer Bevölkerungsgruppe erstellen („populationsbezogene Expositionsschätzung“). Die Risikobewertung nimmt dann insbesondere auf die mittlere Exposition sowie die hohe Exposition (95. Perzentile) Bezug [1].

Ein vergleichsweise neuer Ansatz zur Ermittlung der Exposition bei der Lebensmittelsicherheit ist die Bestimmung der sogenannten internen Exposition. Dabei wird angestrebt, die tatsächliche aufgenommene Dosis der betreffenden Substanz durch eine Analyse von Körperflüssigkeit(en) eines Menschen (Blut, Urin, ggf. Speichel, Muttermilch und andere Matrizes) zu ermitteln. Dies ist für viele Substanzen erst durch die rasante technologische Entwicklung der analytischen Verfahren in den letzten 20 Jahren möglich geworden.

Nach Erläuterung von grundlegenden Aspekten bei der Ermittlung der internen Exposition beschäftigt sich dieser Artikel schwerpunktmäßig mit potenziell gentoxischen und kanzerogenen Kontaminanten in Lebensmitteln. Für diese besonders problematischen Substanzen gilt grundsätzlich das Minimierungsprinzip (ALARA: „As Low As Reasonably Achievable“). Sie werden gegenwärtig nach dem Margin-of-Exposure(MoE)-Konzept bewertet [2]. Der MoE-Wert ist eine dimensionslose Zahl, die das Verhältnis einer Wirkdosis im Tierversuch zur Expositionsdosis beim Menschen angibt. Mit diesem Konzept wird versucht, das Ausmaß möglicher Risiken verschiedener gentoxischer Kanzerogene vergleichend darzustellen unter der Annahme, dass der Kurvenverlauf der Beziehung zwischen krebsauslösender Wirkung und Dosis bei verschiedenen Substanzen vergleichbar ist. Daten zur internen Exposition können dabei helfen, die relevante Exposition gegenüber der Ursprungssubstanz bzw. ihrer gentoxischen Metaboliten genauer zu erfassen und so zu einer verbesserten Risikobewertung beizutragen.

Sollte die Ermittlung der tatsächlich aufgenommenen Dosis durch eine Analyse von Körperflüssigkeit für eine konkrete Substanz möglich sein, würden sich zahlreiche Vorteile gegenüber der externen Expositionsschätzung ergeben:

Ob eine Bestimmung der internen Exposition für eine bestimmte Substanz tatsächlich möglich bzw. sinnvoll ist, hängt jedoch von zahlreichen Bedingungen ab:

Der Faktor Zeit ist in Bezug auf zwei Fragen sehr wichtig. Erstens: Wie schnell wird die betrachtete Substanz nach der Aufnahme vom Körper wieder ausgeschieden? Die allermeisten Inhaltsstoffe bzw. Kontaminanten, die wir mit Lebensmitteln aufnehmen, werden im Körper schnell verstoffwechselt und/oder wieder ausgeschieden. Die interne Exposition nach einmaliger Aufnahme besteht also möglicherweise nur kurz: Die Konzentrationen in Blut und Geweben steigen bis zu einem Maximalwert an und fallen anschließend kontinuierlich ab. So lässt sich beispielsweise die Cumarinaufnahme in den ersten Stunden nach Verzehr von zimthaltigen Lebensmitteln sehr gut durch die Messung seines Hauptmetaboliten 7‑Hydroxy-Cumarin im Blut verfolgen, erfordert aber mehrere Blutentnahmen. Der Metabolit wird jedoch im Urin ausgeschieden; seine Quantifizierung im über 8 h gesammelten Urin ist ein gutes Maß für die insgesamt aufgenommene Cumarinmenge [3]. Eine Messung im Morgenurin des nächsten Tages würde jedoch keine Exposition mehr nachweisen können, wenn die Mahlzeit mit Zimt am Mittag des Vortages verzehrt wurde. Für das individuelle Monitoring der Cumarinexposition würde nur die Komplettsammlung des Urins über 8 h nach Verzehr ein valides Ergebnis bei der Biomarkermessung ergeben. Mit Blick auf den Einsatz in großen Studien (z. B. Nationale Kohorte) würde die Analyse von 7‑Hydroxy-Cumarin nur im 24-h-Sammelurin sinnvoll sein, um ein aussagekräftiges Ergebnis für die allgemeine Exposition gegenüber Cumarin in einer Bevölkerungsgruppe erhalten zu können.

Die zweite Frage beim Faktor Zeit ist die nach dem Zeitfenster, innerhalb dessen ein möglicher toxischer Effekt auftreten kann. Mit Blick auf mögliche perakute oder akute Effekte, die innerhalb von Minuten bis Tagen auftreten können, wäre ein Monitoring der Exposition, die diesen Effekt auslöst, noch relativ einfach mit einer Studie zu realisieren. So hat das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) zur Frage der relativen Bioverfügbarkeit von Cyanid (Blausäure) nach Verzehr von Lebensmitteln mit cyanogenen Glykosiden (bittere Aprikosenkerne, Cassava [Maniok], Leinsamen und Persipan) eine Studie durchgeführt, bei der die nach Verzehr gemessenen Spitzenspiegel im Blut große Unterschiede zwischen den genannten Lebensmitteln zeigten [4]. Bei möglichen subchronischen und chronischen Effekten ist es jedoch oft schwieriger, die über eine deutlich längere Zeitspanne relevante Exposition zu erfassen, beispielsweise mit Blick auf epidemiologische Studien zu möglichen Krankheitsursachen. Eine einfache Bestimmung, z. B. durch eine Blutentnahme, ist nur bei Substanzen möglich, die eine extrem lange Halbwertszeit (im Bereich von Jahren) haben und im Körper des Menschen akkumulieren. Dies sind insbesondere manche Schwermetalle und persistente organische Verbindungen wie Dioxine und polychlorierte Biphenyle (PCBs). Mit Blick auf gentoxische Kanzerogene, die üblicherweise eine kurze biologische Halbwertszeit haben, eröffnet sich mit dem Nachweis von Addukten im Körper jedoch eine weitere Möglichkeit, eine Exposition im mittelfristigen Bereich nachzuweisen.

Fremdstoffe können reaktiv sein oder durch den Stoffwechsel in reaktive Metaboliten umgewandelt werden. Zum Teil bilden diese kovalente Bindungen mit zellulären Makromolekülen, z. B. RNA, DNA und Proteinen, oder sie werden zu sog. Mercaptursäuren (Infobox 1) detoxifiziert. Diese werden im Harn ausgeschieden und können mit Hilfe chromatographischer und massenspektrometrischer Methoden quantifiziert werden. Sie sind als Biomarker der effektiven Dosis nutzbar, um z. B. eine kurzfristige Exposition zu untersuchen. Die aus der Reaktion von elektrophilen Metaboliten und DNA, RNA oder Proteinen resultierenden Modifikationen (Addukte) können ebenfalls quantifiziert und als Biomarker der effektiven Dosis verwendet werden. Sie geben die interne Belastung über einen Zeitraum von Tagen bis hin zu mehreren Wochen wieder, da die Addukte in den Makromolekülen akkumulieren, bis sie durch Abbau (Proteine) oder Reparatur (DNA) wieder entfernt werden. In diesem Zusammenhang haben DNA-Addukte als Biomarker eine direkte, biologisch plausible Beziehung zur Gentoxizität. Trotzdem sind entsprechende Studien im Rahmen des Humanbiomonitorings vergleichsweise selten, weil DNA vom Menschen meist nicht in ausreichender Menge zur Verfügung steht [5]. Die effektive Dosis wird deswegen durch die Quantifizierung von substanzspezifischen Proteinaddukten (Infobox 2) in Hämoglobin (Hb) oder Serumalbumin (SA) bestimmt, die für die Analyse der Adduktbelastung beim Menschen besonders geeignet sind. Beide Proteine sind in relativ großen Mengen (ca. 150 mg Hb/ml Vollblut, ca. 45 mg SA/ml Serum) verfügbar. Die meisten Proteinaddukte sind chemisch stabil und werden nicht durch physiologische Reparaturmechanismen entfernt. Ferner reflektieren sie die interne Exposition gegenüber elektrophilen Verbindungen über einen relativ langen Zeitraum hinweg, der durch die Lebensdauer der Erythrozyten (120 Tage) und die Halbwertszeit von SA (t_1/2 = 20 Tage) bestimmt wird.

Für Langzeitstudien, beispielsweise zur Krebsentstehung, ist jedoch der genannte Zeitrahmen von Wochen bis Monaten zu kurz, um eine verlässliche Antwort auf die Frage nach der kumulativen Exposition über einen Zeitraum von Jahren oder sogar Jahrzehnten zu erhalten. Hier gibt es nur die aufwendige und bisher kaum genutzte Möglichkeit, Adduktbestimmungen in regelmäßigen Abständen zu wiederholen. Möglicherweise ist ein solcher Aufwand nicht nötig, wenn die Gehalte eines problematischen Inhaltsstoffes in den Lebensmitteln im Mittel konstant bleiben und sich individuelle Verzehrgewohnheiten nicht ändern. Bisher gibt es keine aussagekräftigen Untersuchungen dazu, wie individuell stabil ein Adduktlevel für bestimmte Inhaltsstoffe über einen längeren Zeitraum im Vergleich zu seiner Variabilität in der Bevölkerung ist.

Analytische Techniken zur Adduktquantifizierung wurden zunächst zur Überwachung der beruflichen Exposition gegenüber vermutlich kanzerogenen Arbeitsstoffen, z. B. zu Ethylenoxid [6] und Anilin [7], entwickelt. Die Ständige Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe (MAK-Kommission) der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) hat für die Konzentrationen von Proteinaddukten einiger Industriechemikalien Referenzwerte abgeleitet. So wurden gesundheitsbezogene Parameter, z. B. Biologische Arbeitsstoff-Referenzwerte (BAR-Werte), für die Auswertung von Biomonitoringergebnissen für Addukte von Acrylamid (50 pmol/g Hb), Acrylnitril (10 pmol/g Hb), 1,2-Epoxypropan (10 pmol/g Hb), 4‑Aminobiphenyl (nach Freisetzung aus Hb, 15 ng/l) und 4,4’-Methylendianilin (nach Freisetzung aus Hb, <5 ng/l) bestimmt [8]. Allerdings orientieren sich die BAR-Werte an der Hintergrundbelastung von Proteinaddukten in einer Referenzpopulation, die den entsprechenden Substanzen beruflich nicht ausgesetzt ist. Somit kann man vom Verhältnis zwischen gemessenen Adduktspiegeln und BAR-Werten nicht unmittelbar auf ein Gesundheitsrisiko schließen.

Die Ableitung der äußeren Exposition durch die Messungen eines Biomarkerspiegels ist in einigen Fällen häufig verwendeter Industriechemikalien möglich, weil eine Datenbasis zur inhalativen Exposition am Arbeitsplatz und der Höhe der Adduktkonzentrationen im Blut vorhanden ist. Diese sog. Expositionsäquivalente für krebserzeugende Arbeitsstoffe (EKA-Werte) erlauben es, die Höhe der äußeren Exposition gegenüber den krebserregenden Substanzen aus den Werten der Hb-Adduktspiegel abzuschätzen. Dies bezieht sich auf eine ausschließlich inhalative Stoffaufnahme während 40 h/Woche am Arbeitsplatz. So gibt es EKA-Werte für die Addukte von Acrylamid und Acrylnitril, aber auch für andere kanzerogene Arbeitsstoffe, bei denen die Raumluftkonzentration mit denen im Harn ausgeschiedenen Mengen der Stoffe oder eines ihrer Metaboliten korreliert werden [8].

Im Bereich der Lebensmitteltoxikologie ist die in der Arbeitsmedizin etablierte Vorgehensweise zur Bestimmung der internen Exposition wenig verbreitet. Das hat mehrere Gründe. Zum einen sind in der Nahrung, einer äußerst komplexen Mischung von Substanzen, nur vergleichsweise wenige Inhaltsstoffe toxikologisch relevant. Diese sind in der Regel nur in geringen Mengen vorhanden, sodass Biomarkeranalysen auch mit der heutigen Technik an die Grenzen des Machbaren stoßen. Zum anderen schwankt die individuelle Exposition aufgrund der Variation der Gehalte von Inhaltsstoffen im Lebensmittel und der Variation des Verzehrs über die Zeit. Es ist daher eine Herausforderung, mögliche Zusammenhänge zwischen der Aufnahme einzelner toxikologisch relevanter Lebensmittelkontaminanten und gesundheitlichen Risiken zu erforschen. Dabei kann die Bestimmung von Proteinaddukten als Biomarker der Exposition gegenüber toxikologisch relevanten Lebensmittelkontaminanten nützlich sein. Beispiele für solche Substanzen sind Acrylamid, Aflatoxin B₁ und Glycidol.

Bisher wurden nur wenige Korrelationen zwischen der durch Biomarker beschriebenen internen Exposition gegenüber einzelnen gentoxischen Substanzen in Lebensmitteln und spezifischen Ätiologien beschrieben. Das ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass das relative Risiko der Krankheitsinzidenz in nur wenigen Fällen mit der Exposition gegenüber einzelnen Substanzen korreliert. Es ist vielmehr wahrscheinlich, dass die interne Exposition gegenüber der Gesamtheit aller elektrophilen Verbindungen, dem sog. Exposom, und der sich daraus ergebenden globalen toxischen Belastung die Ätiologie von Tumoren sowie kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen beeinflusst [26]. In diesem Sinne wäre es angebracht, die effektiven Dosen einer größeren Anzahl von elektrophilen Verbindungen, z. B. durch Proteinadduktkonzentrationen, zu bestimmen. Erste Proof-of-Principle-Studien konzentrieren sich auf die Addukte einzelner Aminosäurehotspots in Hb (das N‑terminale Valin) oder SA (Cystein 34). Li et al. beschrieben ein massenspektrometrisches Verfahren zur Detektion von Addukten des Cystein 34 in SA aus humanen Blutproben [27], während Carlsson et al. eine Strategie für die Untersuchung unbekannter Hb-Addukte unter Verwendung eines modifizierten Edman-Abbaus für das N‑terminale Valin entwickelten [28]. Ein grundsätzliches Problem dieser Ansätze besteht darin, dass unterschiedliche nukleophile Aminosäurereste in einem Protein mit unterschiedlichen Klassen von Elektrophilen reagieren. Somit ist die Bestimmung der Exposition gegenüber allen elektrophilen Verbindungen durch eine ausgewählte Technik der Adduktisolierung nicht möglich. Der Edman-Abbau zur Analyse von Addukten am N‑Terminus des Hb bietet sich an, da dies die Methode mit der größten Verbreitung ist [29].