In der Histopathologie werden krankhafte oder anlagebedingte Veränderungen des Gewebes auf feinstruktureller Ebene untersucht. Bevor aber eine Gewebeprobe feingeweblich beurteilt werden kann, muss sie einen komplexen Prozess durchlaufen. Dieser ganze Prozess wird unter dem Terminus „Histotechnik“ subsumiert und hat in den letzten Jahren eine weitgehende Standardisierung erfahren. Nicht zuletzt im Zuge der Qualitätssicherung und Zertifizierung ist dies ein wichtiger und notwendiger Schritt. Der Prozess, an dessen Ende ein guter histologischer Schnitt steht, besteht aus vielen Einzelschritten, von denen jeder für das Gelingen wichtig ist. Es soll im Folgenden der Weg von der Biopsie bis zum fertigen Schnitt aufgezeigt werden.
Die Histologie wird allgemein als die mikroskopische Strukturlehre belebten Gewebes verstanden. Die Lehre des menschlichen Gewebes stellt ein Untergebiet der anatomischen Lehre dar. In der Histopathologie werden krankhafte oder anlagebedingte Veränderungen des Gewebes auf feinstruktureller Ebene untersucht. Dabei kommt der Kenntnis des „Normalbefundes“ der Haut, insbesondere im Lichte der durchaus sehr unterschiedlichen Präsentationsformen in Abhängigkeit der anatomischen Lokalisation große Bedeutung zu.
Bevor aber eine Gewebeprobe feingeweblich beurteilt werden kann, muss sie einen komplexen Prozess durchlaufen, der über weite Strecken durch medizinisch-technisches Personal betreut wird. Dieser ganze Prozess wird unter dem Terminus „Histotechnik“ subsumiert und hat in den letzten Jahren eine weitgehende Standardisierung erfahren. Nicht zuletzt im Zuge der Qualitätssicherung und Zertifizierung ist dies ein wichtiger und notwendiger Schritt. Dennoch kommen nach wie vor Präparate zur Beurteilung, deren Qualität eine sachgerechte Beurteilung nicht zulässt.
Der Prozess, an dessen Ende ein guter histologischer Schnitt steht, besteht aus vielen Einzelschritten, von denen jeder für das Gelingen wichtig ist. Es soll im Folgenden der Weg von der Biopsie bis zum fertigen Schnitt aufgezeigt werden. Hinsichtlich des sehr komplexen Hintergrundes der einzelnen Arbeitsgänge muss dabei auf die im Literaturverzeichnis genannte weiterführende Spezialliteratur verwiesen werden. Leider sind die meisten maßgeblichen Lehrwerke zu diesem Gebiet in englischer Sprache abgefasst. Nicht alle Labormitarbeiter können eine englische Färbeanweisung verstehen und umsetzen. Deshalb werden hier nicht nur die Grundlagen der Technik dargestellt, sondern auch bewährte Arbeitsanleitungen in Kurzform angefügt und gezielte Hinweise zur Fehlervermeidung gegeben. Diese Färbeanleitungen sind alle bei uns getestet worden und finden ihre Anwendung in unserer täglichen Routine. Unsere Laborleiterin Frau Jutta Schröder, der ich an dieser Stelle sehr herzlich danken möchte, hat sie beigesteuert.
Ablauf der Gewebebearbeitung im Hinblick auf die feingewebliche Untersuchung
Fixierung
Unter Fixierung wird die Haltbarmachung einer Gewebeprobe verstanden. Insbesondere sollen die obligat ex vivo ablaufenden autolytischen Prozesse blockiert werden. Es steht eine Vielzahl unterschiedlicher Fixierungsmethoden zur Verfügung. Die Art der Gewebefixierung hat großen Einfluss auf die Gewebetextur und damit auf die Qualität der feingeweblichen Untersuchung. Nicht nur sollen die Ultrastruktur der Proteine im Hinblick auf immunhistochemische Untersuchungen bestmöglich erhalten bleiben, auch die DNA oder RNA soll möglichst unfragmentiert erhalten bleiben, um aussagekräftige Ergebnisse zum Beispiel in der PCR-Untersuchung zu erzielen.
Als Mittel der Wahl hat sich in der Dermatopathologie eine neutral gepufferte 4%ige Formalinlösung durchgesetzt. Für Formalin existieren gute Entsorgungswege und Recyclingmöglichkeiten. Das Ergebnis einer guten Fixierung ist eine Funktion der Zeit und des zu fixierenden Gewebevolumens sowie der Gewebeart. Des Weiteren ist ein ausreichendes Vorhandensein des Fixativums entscheidend für das Ergebnis.
Es kann nicht genug betont werden, dass das Volumenverhältnis von zu fixierendem Gewebe zu Formalin 1:5 bis 1:10 betragen sollte. Immer wieder erreichen uns große Nachexzisionspräparate, die unter fast vollständiger Verdrängung der Fixierlösung nahezu das ganze Volumen des Einsendegefäßes ausmachen. Makropathologisch wird eine Unterfixierung durch Blutaustritt in flüssiger Form sowie die lachsrote Farbgebung des Koriums identifiziert. Auch weisen diese Proben eine ungewöhnlich weiche Konsistenz auf. Eine ausreichende Fixierung liegt vor, wenn das Gewebe etwas grau verfärbt ist und Blutbestandteile nicht mehr leuchtend rot gesehen werden. Diese visuelle Kontrolle ist sehr wichtig, um vor dem Zuschneiden noch nicht genügend fixiertes Gewebe aus dem Prozess zu entfernen und es einer Nachfixierung zuzuführen. Schlecht fixiertes Gewebe wird auch schlecht eingebettet und kann anschließend nicht ordentlich geschnitten und gefärbt werden. Mikroskopisch kann eine durch autolytische Prozesse bedingte artifizielle Veränderung bei Unterfixierung des Gewebes zu einer deutlich eingeschränkten Beurteilbarkeit führen.
Die Fixierung und die nachfolgende Paraffineinbettung führen zu einem Volumenverlust des Gewebes von bis zu 33 %. Die Kenntnis dieser Tatsache sollte jeden Versuch, aus Messungen an histologischen Präparaten abrechnungsrelevante oder forensisch wichtige Exzisatgrößen zu kontrollieren, im Vorhinein absurd erscheinen lassen.
Vorbereiten des Gewebes zur Entwässerung und Paraffineinbettung („Zuschneiden“)
Das Hauptziel des sogenannten Zuschneidens der im Labor eingegangenen Gewebeproben besteht darin, eine senkrecht zur Hautoberfläche verlaufende Schnittebene zu schaffen. Gerade in der Haut ist die senkrecht zur Oberfläche gelegte Schnittführung wichtig, um vergleichbare Verhältnisse zu erzielen. Dabei wird die Schnittebene nach makroskopischer Beurteilung des Gewebes an der diagnostisch relevanten Stelle erstellt. Bei sehr kleinen Läsionen kann es sinnvoll sein, die Zuschneideebene bewusst etwas außerhalb der Läsion zu wählen, um nicht im Rahmen des sogenannten Anschneiden des Blockes die Läsion sogleich zu „opfern“, sondern in sie „rein zu kommen“.
Standardmäßig werden spindelförmige Skalpellexzisate in Abhängigkeit von der Biopsieintention zugeschnitten:
Bei Totalexzisaten (z. B. Tumorchirurgie) wird üblicherweise im 90°-Winkel quer zur Längsachse der Spindel zugeschnitten. Damit wird der knappere seitliche Schnittrand dargestellt und die Totalität einer Exzision kann zuverlässig und unter Maßangabe der Distanz vom Schnittrand zum Tumorgewebe (wo gefordert) erfolgen.
Nicht so bei spindelförmigen Probeexzisionen bei entzündlichen Dermatosen: Hier wird üblicherweise parallel zur Spindellängsachse zugeschnitten, um möglichst viel diagnostisch verwertbares Substrat darzustellen.
Eine weitere wichtige Aufgabe des Zuschneidens ist, gegebenenfalls die Voraussetzungen für die möglichst vollständige Darstellung der Exzisionsrandbezirke zur mikroskopischen Schnittrandkontrolle von Tumorexzisionen zu schaffen.
Verständlicherweise erwarten Operateur und Patient vom Histologen eine verbindliche Aussage, ob eine örtliche Totalexzision eines Tumors vorliegt oder nicht. Umso wichtiger ist es, beim Operateur ein Verständnis für die Möglichkeiten und Grenzen der histologischen Randbeurteilung zu wecken und Klarheit über die Vor- und Nachteile der einzelnen Zuschneidetechniken zu erzielen. Klarheit muss auch darüber bestehen, dass die Randdarstellung bei einem zerrissenen torquierten Exzisionspräparat nur noch sehr bedingt möglich ist.
Zuschneidetechniken für die Beurteilung der Schnittränder mittels Schnittrandkontrolle
Insbesondere die einfache Randbeurteilung von spindelförmigen Hautexzidaten geht von gewissen geometrischen Grundannahmen aus. In einer Spindel ist der Abstand vom Tumorgewebe zu den seitlichen Schnitträndern in der Regel geringer, als der Abstand zu den Spindelspitzen. Diese Annahme erlaubt eine Beurteilung der Totalität an einem Querschnitt durch die Spindel.
Bei Abtragungsbiopsaten oder auch bei Shave-Exzisaten ist diese geometrische Voraussetzung nicht gegeben. Nicht selten kann deshalb bei dieser Entnahmetechnik eine Randbeurteilung, wenn überhaupt, nur mit Vorbehalt erfolgen.
Für die Randdarstellung in fadenmarkierten Exzisaten kommen 2 Hauptprinzipien zur Anwendung: Parallelschnitte durch ein Exzisat und mikrographisch kontrollierte Schnittrandkontrolle.
Parallelschnitte durch ein Exzisat (sog. Brotlaibtechnik)
Die meisten Tumorexzisionen aus der Haut sind oval bis rundbogig und überschreiten einen Durchmesser von 4 cm nicht. Vom Operateur wird das Exzisat an einem Punkt, bei den häufig elliptischen Exzisaten meist an einem Ende, mit einem Faden markiert. Zum Zuschneiden wird im Histolabor eine Skizze angefertigt (Abb. 1), auf der die Position des Fadens markiert ist und dann wird das Gewebe auf beiden Seiten mit je einer Farbe markiert (z. B. Blau und Gelb.).
Abb. 1
a Darstellung der seriellen Aufarbeitung von Hautexzisionen bis etwa 3 cm Durchmesser; b Darstellung der seriellen Aufarbeitung von Hautexzisionen über 3 cm Durchmesser (Brotlaibtechnik)
×
Auch die Farbmarkierung wird auf der Skizze eingetragen und dann wird das Gewebe wie ein Brotlaib in möglichst dünne Scheiben geschnitten. Ist das Gewebestück größer als 4 cm, wird es in der Mitte längs geteilt und jede Seite wiederum wie ein Brotlaib aufgeschnitten (Abb. 1). Jede dieser Scheiben ist gekennzeichnet (z. B. A, B, C, usw.). Die so eingebetteten Stücke ergeben eine Perlschnur-ähnliche genaue Darstellung der Resektionsränder. Der Vorteil dieser Methode beruht darauf, dass durch die Farbmarkierung exakt der jeweilige Resektionsrand und die Entfernung des letzten Tumorzellkomplexes davon dokumentiert werden kann. Damit kann den Anforderungen einer Qualitätssicherungsvereinbarung problemlos entsprochen werden. Auch nach Jahren kann der Histologe z. B. einer Gutachterkommission den Untersuchungsgang eindeutig belegen. Es entstehen keine verdrehten zerrissenen oder sonst in irgendeiner Weise unrealistischen Randdarstellungen, die eine klare Randbewertung fraglich erscheinen lassen können.
Der Nachteil der Brotlaibtechnik ist, dass eben keine lückenlose, sondern eine punktuelle Resektionsranddarstellung erfolgt, bei der die Punkte im Durchschnitt etwa 2 mm auseinanderliegen. Dieser Nachteil kann gemindert werden, indem man in Ebenen, in denen der Tumor nahe an die Resektionsränder heranreicht, Nachschnitte anfertigt und so in diesen Bereichen dem Ideal der lückenlosen Randdarstellung näher kommt.
Lückenlose Randdarstellung durch Zuschnitt („Tübinger Torte“ oder „Flundertechnik“)
Bei der sog. Tübinger Torte – anzuwenden für große Exzisate – wird parallel zu den Exzisionsrändern ein etwa 2 mm breiter Randstreifen entfernt und in schneidbare Segmente unterteilt. Diese Segmente werden in einer Skizze bestimmten Lokalisationen zugeordnet und vom äußeren Exzisionsrand her geschnitten. Die Basis wird ebenfalls großflächig abgetrennt und auch von der Abtragungsseite her geschnitten (Abb. 2).
Abb. 2
Lückenlose Randdarstellung von Hauttumoren nach Breuninger (1998)
×
Bei der Flundertechnik – anzuwenden für kleine Exzisate – wird der zentrale Tumor herausgeschnitten und getrennt bearbeitet. Exzisionsbasis und äußere Randzone werden als zusammenhängendes Stück so eingebettet, dass die äußeren Seiten auf die Basis herab gebogen und so in eine schneidbare Ebene gebracht werden (Abb. 2).
Im Krankenhauskontext sind diese Verfahren ideal, da das Zuschneiden unmittelbar nach der Gewebeentnahme am Nativmaterial erfolgen kann. Das noch weiche elastische Gewebe kann auf Kork aufgespannt und applaniert werden. In der Praxis muss jedoch bedacht werden, dass hier in der Regel bereits fixiertes Gewebe bearbeitet wird und damit gebogene Gewebestücke entstehen, die nach dem Einbetten in Paraffin eine Gummi-ähnliche Konsistenz mit beachtlicher Elastizität aufweisen. Es ist erfahrungsgemäß sehr schwierig, solche rundbogigen Gewebestücke im Paraffinblock in eine Ebene zu orientieren. Immer wieder passiert es, dass diese Gewebestücke nicht plan angeschnitten werden. Da die Ränder nicht farbig markiert werden können, kann der Histologe im Nachhinein nur sehr schwer feststellen, ob der gesamte Rand geschnitten wurde und in welcher Tiefe eventuell in diesem Segment Tumorgewebe vorhanden war. Torquierte und tangential geschnittene Randsegmente sind je nach Beschaffenheit des Operationspräparates praktisch unvermeidlich und für jeden Zweitbegutachter offensichtlich. Nur wenn ein Operationspräparat die prototypisch idealen, in Abb. 2 dargestellten Konturen hat, kann mit einer „lückenlosen Randkontrolle“ gerechnet werden. Ansonsten wird auch dieses Verfahren einen mehr oder weniger guten Kompromiss darstellen.
Die eigentliche Moh´sche Chemochirurgie spielt in der Dermatochirurgie heute eine untergeordnete Rolle. Verbreitet findet die sogenannte zwei-zeitige Slow-Mohs-Chirurgie Anwendung, wobei die Schnittränder üblicherweise in konventioneller Vorgehensweise (Formalin-Fixierung; Paraffin-Einbettung) aufgearbeitet werden. Der Defektverschluss oder eine Nachexzision erfolgen wenige Tage nach der Primärexzision und nicht in der gleichen Sitzung.
Gewebeeinbettung
Das Ziel der Gewebeeinbettung ist der Erhalt eines schneidbaren Blockes, bestehend aus dem zu untersuchenden Gewebe und dem Einbettmedium. Das Schneiden fällt umso leichter, je gleichmäßiger die Dichte zwischen Gewebematerial und Einbettmedium gewählt wird. Dabei kommt üblicherweise Paraffin – oder seltener Kunststoff – zur Anwendung.
Dem Gewebe soll unter möglichst gutem Erhalt der zellulären Strukturen Wasser entzogen und durch das Einbettmedium ersetzt werden. Die Standardeinbettung in Paraffin erfolgt in 3 Schritten. Zunächst wird das Gewebe einer Überschussmenge Alkohol (meist 3 Stufen Isopropylalkohol in steigender Konzentration) ausgesetzt. Idealerweise wird das Gewebswasser dabei weitestmöglich durch Alkohol ersetzt. Da sich Paraffin nicht sehr gut mit Alkohol mischt, wird danach in einer Zwischenstufe der Alkohol gegen eine Überschussmenge Lösungsmittel (meist Xylol) ausgetauscht. Dieses Lösungsmittel wird nachfolgend durch eine Überschussmenge Paraffin substituiert und so wird eine möglichst vollständige Durchtränkung des Gewebes mit Paraffin erreicht. In modernen Einbettautomaten wird dieser Prozess durch schonenden Einsatz von Wärme sowie alternierendem Unter- und Überdruck beschleunigt.
Für die Gewebeeinbettung sollten beste Xylol- und Isopropylalkoholqualitäten verwendet werden und die Lösungsmittel nach einem festen Plan getauscht werden. Leider sind die Lösungsmittel auch renommierter Hersteller nicht selten z. B. durch Wasserbeimengung verunreinigt, was zu schlechter Gewebeentwässerung und minderwertigen Paraffinblöcken führt. Bei wiederholt schlechten Ergebnissen empfiehlt sich eine externe Kontrolle der Lösungsmittelqualität durch ein anerkanntes chemisches Analyselabor.
Die heute gebräuchlichen Einbettsysteme arbeiten fast ausnahmslos geschlossen, d. h. ohne Außenluftbelastung. Man unterscheidet zwischen Einkammersystemen, bei denen die Lösungsmittel und das Paraffin alternierend in eine Kammer mit den Gewebeproben gepumpt werden, und Mehrkammersystemen, in denen das Gewebe nacheinander in verschiedene Bäder verbracht wird. Einkammersysteme sind komfortabel in der Handhabung, brauchen aber zusätzlich Lösungsmittel zum Spülen der Schlauchsysteme. Zudem kann es durch geringe Verstopfung der Durchflüsse zur Durchmischung und dadurch zum vorzeitigem Verbrauch der Lösungsmittel kommen, was dann wiederum zu schlechten Einbettergebnissen führt. Mehrkammersysteme sind sehr zuverlässig, benötigen aber eine etwas größere Standfläche.
Ausblocken
Das in Paraffin eingebettete Gewebe wird aus der Einbettschale entnommen und mit der anzuschneidenden Fläche nach unten in ein zuvor mit etwas flüssigem Paraffin gefülltes Förmchen verbracht. Das Gewebe wird in der Form mit einer Pinzette vorsichtig ausgerichtet und diese Form anschließend mit flüssigem Paraffin aufgefüllt. Die Einbettschale wird abschließend oben aufgelegt. Nach Erkalten des ganzen Blockes auf einer Kühlfläche oder im Gefrierschrank kann die Einbettschale mit dem anhaftenden Paraffinblock entnommen werden.
Es ist wichtig, bei diesen Arbeitsabläufen auf peinliche Sauberkeit am Arbeitsplatz zu achten. Es muss unbedingt vermieden werden, dass Gewebefragmente einer bearbeiteten Probe an der Pinzette hängen bleiben und damit ihren Weg in die nächste Kapsel finden. Gerade, wenn in kurzer Abfolge mehrere Proben fragmentierten Gewebes bearbeitet werden, besteht diese Gefahr. Ein solcher Ausblockfehler kann bei der histologischen Beurteilung leicht zu Fehldiagnosen führen. Auch eine molekularpathologische Untersuchung kann auf diese Weise fehlerhafte Resultate liefern.
Für gute und korrekte Ausblockergebnisse ist ein hohes Maß an Standardisierung innerhalb des jeweiligen Labors empfehlenswert. Oft wird bereits beim Zuschneiden die Gewebefläche, auf die ausgeblockt werden soll, z. B. mit Hämalaun markiert. Jedes Labor pflegt hier seine eigene, nicht selten sehr ausgeklügelte Form der Kommunikation zwischen Zuschneiden und Ausblocken.
Schneiden
Beim Ausblocken wird versucht, unmittelbar in der Ebene der ersten Anschnitte die gesamte Fläche des Gewebes möglichst nahe an der Oberfläche zu platzieren. Auf diese Weise wird auf dem Mikrotom nach kürzestem Anschnitt bereits ein vollständiger Schnitt erzielt. Trotzdem geht hier immer eine kleine Menge des Gewebes verloren, bis der erste, über die gesamte Gewebefläche plane Anschnitt gelingt. Deswegen kann es beim Zuschneiden von sehr kleinen Läsionen ratsam sein, die Zuschnittebene nicht direkt mittig durch die Läsion zu legen, sondern leicht parazentral zuzuschneiden, um durch die ersten Anschnitte erst in die Läsion zu kommen.
Ein planer Schnitt wird dann im warmen Wasserbad ausgebreitet. Der Schnitt schwimmt oben auf und verliert durch die hier erfolgte Ausdehnung seine feinen Stauchfalten, die durch das Schneiden entstehen. Diese Gewebeschnitte werden auf Objektträger aufgezogen und für mindestens 10 min auf eine Wärmeplatte (Strecktisch) gegeben, damit die Gewebeschnitte auf dem Objektträger gut anhaften.
Ein regelmäßiges Reinigen des Wasserbades ist unabdingbar. Nur so kann verhindert werden, dass Anschnitte einer bereits bearbeiteten Probe versehentlich auf dem Objektträger der nächsten Probe zu liegen kommen. Dieser Fehler ergibt „floater“ und kann zu Fehldiagnosen führen. Das Anfertigen von Stufenschnitten schafft in derartigen Situationen Klarheit.
Färben
Die allermeisten Standardfärbungen in der Dermatopathologie erfolgen in einer wässrigen Phase. Daher muss das lipophile Einbettmedium Paraffin jetzt wieder, in Umkehrung der Einbettung, durch Xylol entfernt werden. Danach wird das Gewebe entsprechend über eine absteigende Alkoholreihe in eine wässrige Phase zurückversetzt, damit die verschiedenen Färbungen durchgeführt werden können.
Färbungen
„Nichts ist so beständig wie der Wandel“. Dieses Zitat wurde von Heraklit von Ephesus geprägt. Erstaunlich wenig hat sich jedoch im Bereich der Standardfärbungen der Dermatopathologie gewandelt. Das Färben von Gewebestrukturen mittels Hämatoxylin im heutigen Sinne wurde von Böhmer bereits im Jahre 1865 beschrieben.
Im Folgenden werden die in der Dermatohistologie gebräuchlichen Färbungen mit ihren Einsatzschwerpunkten und anschließend ihre Bedeutung für die Routine dargestellt. Für einige der hier angegebenen Färbungen finden Sie am Ende des Kapitels eine Färbeanleitung.
HE-Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung)
Der auf den Objektträger aufgezogene 2–3 μm dicke Gewebeschnitt ist von grauweißer Farbe und lässt keine zellulären Strukturen erkennen. Mittels verschiedener Farbstoffe welche Affinitäten zu unterschiedlichen pH-Werten im Gewebe oder zu unterschiedlichen chemischen Strukturen aufweisen, versucht man den zellulären Aufbau sichtbar zu machen. Die gebräuchlichste Färbung der Routine ist die Mischfärbung Hämatoxylin und Eosin, kurz HE-Färbung. Viele Gebrauchslösungen von Hämatoxylin sind verfügbar. Für die Haut hat sich bei uns besonders eine kommerzielle Zubereitung von Hämatoxylin nach Gill (Merck 5174) bewährt.
Die Gebrauchslösung von Eosin kann in ihrer Brillianz durch den Zusatz von Phloxin gesteigert werden. (Eosinlösung 100 ml, Phloxinlösung 10 ml, 95 % Äthylalkohol 780 ml, Eisessig 4 ml.) Der kationische Metallkomplexfarbstoff Hämatoxylin färbt nach Aufarbeitung zu Hämalaun anionische Biopolymere (DNS im Zellkern, RNS und Glykosaminoglykane) blau, das anionische Eosin färbt kationische Proteine, vorwiegend Zytoplasma und Faserstrukturen, rot. Nach guter Gewebeeinbettung und in ausreichend dünnen Schnitten, zeigt die gut differenzierte HE-Färbung eine erstaunliche Fülle von Strukturen (Abb. 3).
Abb. 3
Ein Gewebeschnitt, von links nach rechts: Ungefärbt, nur mit Hämatoxylin gefärbt, nur mit Eosin gefärbt, mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt
×
So können nicht nur Kernstrukturen und Zytoplasmabeschaffenheit sichtbar gemacht werden, man kann auch interstitielle Muzineinlagerung zumindest vermuten, Amyloid in typischer Lagerung (z. B. makulöse Amyloidose) gut ausmachen, Kollagen von glatter Muskulatur durch unterschiedliche Rot-Intensität unterscheiden und auch reichlich vorhandene Pilze sowie Leishmanien sehen. Die HE-Färbung hat sich weltweit als Standardfärbung der Histopathologie durchgesetzt.
PAS-Färbung
Hier wird durch Perjodsäure Glykogen oxidiert. Die dabei entstehenden Aldehyde reagieren mit Fuchsin-Schwefelsäure, dem sog. Schiff'schen Reagenz zu einem roten Farbniederschlag. Dieser hebt sich von der blauen Gegenfärbung deutlich ab. In der Dermatohistologie wird die PAS-Färbung hauptsächlich zur Darstellung von Pilzelementen verwendet, die sich aufgrund ihres Glykogengehaltes deutlich rot anfärben. Da die Reaktion eines Organismus auf Pilzbefall sehr durch den individuellen Immunstatus bestimmt ist, sieht der Dermatohistologe immer wieder Fälle, in denen klinisch nicht vermutete Pilzinfektionen die Krankheitsursache sind. Man ist also gut beraten, wenn man in der Histologie nicht tumorbedingter Hautkrankheiten von Fußschweiß bis Haarausfall neben der HE-Färbung eine PAS-Färbung mitlaufen lässt.
Eisenfärbung
Beim Hämoglobinabbau im Gewebe zu Hämosiderin und als Fremdkörpereinsprengung kommt Eisen in der Haut vor und muss hier vor allem von dem ähnlich bräunlichen Melaninpigment unterschieden werden. Der im Hämosiderin enthaltene Ferritinkomplex reagiert mit Ferrocyanidkalium und bildet einen blauen Niederschlag. Gegengefärbt wird mit Kernechtrot.
Elastika/van Gieson-Färbung
Mit Orcein werden die elastischen Fasern braunschwarz, mit Pikrofuchsin nach van Gieson das Kollagen leuchtend rot gefärbt. Zur differenzierteren Beurteilung des elastischen Fasergerüstes empfiehlt es sich, nur die Orceinfärbung durchzuführen, da die Kollagenanfärbung sonst die Elastika-Färbung teilweise optisch überdeckt.
Giemsa-Färbung
In Schnitten, die heute meist mit aus fertigem Giemsa-Farbpulver angesetzter Gebrauchslösung gefärbt und differenziert werden, stellen sich die Zellkerne mit besonders plastischer Chromatinzeichnung dar, weshalb diese Färbung für die Morphologie von Lymphomen eingesetzt wird. Auf der anderen Seite färbt sich eine Vielzahl von Bakterien und größeren Parasiten, vor allem Leishmanien, mit der Giemsa-Färbung. Die Bedeutung dieser Färbung schwindet dort, wo eine gut differenzierte HE-Färbung dünner Paraffinschnitte praktiziert wird. Dann wird die Giemsa Färbung vor allem zur Darstellung der Zytoplasmagranulierung von Mastzellen verwendet.
Gramfärbung
Kationisches Crystalviolet wird in der initialen Phase der Färbung von Bakterien aufgenommen. Die sog. Gram-negativen Bakterien geben aufgrund ihrer dünneren, weniger stabilen Lipidkapsel bei der nachfolgenden Entfärbung das blaue Crystalviolet wieder ab und werden mit der Gegenfärbung, z. B. Fuchsin rot d. h. „Gram negativ“.
Ziehl-Neelsen-Färbung (modifiziert)
Die Ziehl-Neelsen-Färbung wird zur Darstellung von Mykobakterien eingesetzt. Es wird zunächst mit Karbolfuchsin eine globale Färbung vorgenommen. In den durch eine dicke Lipidkapsel geschützten Mykobakterien widersteht diese Färbung der nachfolgenden Entfärbung des übrigen Gewebes, welches dann mit Methylenblau zart blau angefärbt wird, während die Mykobakterien das strahlend rote Karbolfuchsin zurückhalten. Dieser scheinbar einfache Prozess ist in der Anwendung äußerst heikel, da die Einfärbung mit Karbolfuchsin sehr aggressiv unter Erwärmung vorgenommen werden muss. Umso schwieriger ist die nachfolgende Entfärbung unter Erhalt der Gewebestruktur. Es besteht daher in den Labors eine generelle Tendenz, die Färbung mit Karbolfuchsin nicht ausreichend aggressiv vorzunehmen, um nachher bei der Entfärbung keine allzu großen Schwierigkeiten zu haben und einen schönen blauen Schnitt mit gutem Gewebeerhalt zu präsentieren. Dabei kommt es dann leicht vor, dass Mykobakterien nicht angefärbt sind und übersehen werden. Das andere Extrem ist ein durch Einbrennen von Karbolfuchsin und nachfolgende massive Entfärbung völlig zerstörter Schnitt. Viele Modifikationen des Färbeverfahrens versuchen dieser Schwierigkeiten Herr zu werden. Eine Möglichkeit ist im Anhang angegeben.
Es ist unbedingt notwendig mit jeder Mykobakterienfärbung stets eine Positivkontrolle durchzuführen. Insbesondere die erregerarmen Erscheinungsformen der Mykobakteriose, sei es nun die Lepra, die atypische Mykobakteriose oder auch der Lupus vulgaris, erfordern vom Histologen viel Zeit beim Durchmustern zahlreicher Schnitte. Gerade bei der Lepra, deren klinische Diagnose hierzulande oft nicht gelingt, ist der Histologe manchmal der einzige, der den entscheidenden Hinweis zu geben vermag. Gelegentlich ist es ein einziges Mykobakterium in einem Nerven, welches den entscheidenden diagnostische Hinweis liefert. Nachdem auch der molekularbiologische Nachweis der Mykobakterien im Gewebe noch sehr problematisch ist, geht an der morphologischen Diagnose derzeit kein Weg vorbei. Die Darstellung säurefester Stäbchen ist eine der wichtigsten Sonderfärbungen im dermatohistopathologischen Labor. Daran ändert auch die Möglichkeit Mykobakterien mit dem Fluoreszenzfarbstoff Auramin/Rhodamin anzufärben nichts. In einem Fluoreszenzpräparat mit wenigen Erregern gibt es immer einzelne positive filamentäre Artefakte, die Mykobakterien vortäuschen. Nur bei Vorhandensein zahlreicher Erreger taugt diese Färbung.
Masson-Fontana-Färbung
Melanin kann aus Silbernitrat metallisches Silber reduzieren, welches sich als schwärzlicher Niederschlag darstellt. Dies ist wichtig bei der Bestimmung bräunlicher Pigmentablagerungen in der Haut und bei der Beurteilung von Hypopigmentierungen.
Kossa-Färbung
Solide Kalziumsalze bei metastatischer oder dystrophischer Kalzinose werden durch die Kossa-Färbung dargestellt. Auch hier handelt es sich um eine Ausfällung metallischen Silbers aus Silbersalz.
Warthin-Starry-Färbung
Versilberungstechnik vor allem empfohlen für Spirochäten (auch für Borrelien) und für Bartonella. Die Färbung ist technisch außerordentlich anspruchsvoll und enthält bei nicht optimaler Ausführung schwärzliche Artefakte, die die Beurteilung massiv erschweren und nur schwer von angefärbten Erregern zu unterscheiden sind. Die Warthin-Starry-Färbung wird zunehmend durch erregerspezifische immunhistochemische Reaktionen abgelöst.
Methenamin-Silberfärbung nach Gomori (Modifiziert nach Grocott)
Diese ebenfalls schwer zu handhabende Versilberung wird für die Darstellung von Pilzelementen, vor allem bei Organmykosen und sog. tiefen Mykosen der Haut empfohlen, wo sie der PAS-Färbung gelegentlich überlegen sein soll. Auch hier sieht man eine Vielzahl von artifiziellen Silbersalzablagerungen auf dem Schnitt, welche den Wert dieser Färbung in der Routine einschränken.
Kongorot/Crystalviolett/Thioflavin-Färbung
Kongorot ist die klassische, allgemein akzeptierte Färbung für Amyloid im fixierten und paraffineingebetteten Gewebe. Amyloid färbt sich rot und erscheint im polarisierten Licht grün. Crystalviolet ist eine weitere Methode der Amyloidanfärbung in paraffineingebettetem Gewebe. Amyloid stellt sich hier rot-violett dar. Thioflavin-Färbung und Betrachtung der Grünfluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop ist die einfachste, wenn auch nicht spezifische Darstellung von Amyloid. Bei allen positiven Darstellungen von Amyloid im Gewebe muss die Art des Amyloids durch eine entsprechende immunhistochemische Untersuchung bestimmt werden.
entparaffinieren > absteigende Alkoholreihe > aqua dest
2.
einstellen der Schnitte in 25 % Giemsalösung 60 ml konzentrierte Giemsalösung + 240 ml Pufferlösung nach Weise immer frisch und erst kurz vor dem Färben ansetzen!!! (Lösung kann nur einmal verwendet werden)
20 min
einstellen der Schnitte in essigsaures aqua dest mehrmals auf und ab bewegen 1 ml Eisessig + 300 ml aqua dest (immer frisch ansetzen!!!)
3 sec
3.
einstellen der Schnitte in 96 % Alkohol 2 × auf und ab bewegen
3 sec
4.
einstellen der Schnitte in eine Küvette mit 100 % Alkohol um die Differenzierungsreaktion zu stoppen. Nach den 15 min soll die Schnittfarbe lichtblau-rosa sein
Modifizierte ZN-Färbung nach Kinyoun (Positivkontrolle mitführen)
Schritt
Technisches Vorgehen
Zeit
1.
entparaffinieren in einem Gemisch aus Xylol + Erdnussöl im Verhältnis 2:1 (wöchentlich erneuern)
bei 37 °C über Nacht
2.
100 % Alkohol gut spülen (Alkohol muss an den Objektträgern glatt ablaufen). Keine Fetttröpfchen mehr sichtbar !!!
5 x wechseln
3.
wässern
fließend 10 min
4.
Schnitte gut abtropfen lassen
5.
einstellen in vorgewärmte (60 °C in der Mikrowelle) filtrierte Carbolfuchsinlösung in den Brutschrank (60 °C). Lösung alle 2 Wochen erneuern!!!
90 min
6.
Küvette aus dem Brutschrank nehmen und Schnitte für 10 min in warmer Carbolfuchsinlösung belassen → auf keinen Fall länger!!! (Lösung kühlt sich bei Raumtemperatur langsam ab)
10 min
7.
Carbolfuchsin-Küvette mit Schnitten für 5 min in ein Glasgefäß mit eiskaltem Wasser stellen → auf keinen Fall länger!!!
5 min
8.
Schnitte aus der Lösung nehmen und in Glasküvette mit lauwarmem Wasser kurz wässern, damit sich die überschüssige rote Farbe vom Glas des Objektträgers löst
9.
mit kaltem Wasser fließend wässern
10 min
10.
differenzieren in 25 % H2SO4 (Farbe der Schnitte schlägt von rot nach gelb um)
ca. 2 sec
11.
Schnitte in Wasserküvette auf- und ab bewegen (Schnitte färben sich hierbei wieder rosa bis rot)
12.
anschließend fließend wässern
10 min
13.
gegenfärben mit Löfflers Methylenblaulösung (Merck) 40 ml Methylenblaulösung + 40 ml 96 % Alkohol eintauchen. Lösung alle 2 Wochen erneuern!!!
ganz kurz
14.
spülen in 96 % Alkohol (Schnitte müssen eine lichtblaue Farbe haben)
2 x 1 min
15.
spülen in 100 % Alkohol
2 x 5 min
16.
Xylol → eindecken
Nach dem Eindecken müssen Sie das Kontrollpräparat mikroskopisch auf angefärbte Erreger durchmustern. Sollten Sie keine säurefesten Stäbchen finden, müssen Sie die Färbung mit neuen Schnitten und Kontrollpräparat wiederholen
entparaffinieren > absteigende Alkoholreihe > aqua dest
2.
aqua dest
6 x wechseln in 10 min
3.
einstellen in Fontanasche Lösung Immer frisch ansetzen! (Küvette mit Alufolie umwickeln, da die Reaktion im Dunkeln + bei Raumtemperatur ablaufen muss)
24 h
4.
aqua dest
6 x wechseln in 10 min
5.
5 % Natriumthiosulfatlösung
3–5 min
6.
fließend wässern
15 min
7.
Kernechtrotlösung
15 min
8.
spülen in aqua dest
ganz kurz
9.
zum Trocknen in den Brutschrank stellen
10.
Xylol → eindecken
Ergebnis:
Argentaffine Substanzen (eventuell in Abstufungen)
schwarz
Kerne
rot
Fontanasche Lösung
Zu 60 ml einer 5 % Silbernitratlösung gibt man mit einer Pipette 1 kleinen Tropfen Ammoniak
Methenamin-Gebrauchslösung 60 sec bei 450 W in der Mikrowelle mit zugeschaltetem Drehteller (immer frisch ansetzen) 2 ml 5 % Boraxlösung + 25 ml aqua dest + 25 ml Methenamin-Stocklösung in Coplin Mikrowelle -Küvette. Nach den 60 sec noch 10-15 sec in der warmen Lösung belassen. Die Schnitte sollten dann eine goldgelbe Anfärbung zeigen
60 sec
8.
spülen in aqua dest (6 x wechseln)
je 1 min
9.
0,1 % Goldchloridlösung (Lösung in einer Braunglasflasche aufbewahren. Nur zum Färben in eine Küvette geben, danach wieder zurückgießen. Lösung kann mehrmals verwendet werden)
5 min
10.
spülen in aqua dest
11.
2 % Natriumthiosulfatlösung
1–2 min
12.
fließend wässern
5 min
13.
Schnitte gegenfärben mit Lichtgrüngebrauchslösung
3–5 sec
14.
Abspülen der Schnittpräparate in 96 % Alkohol (2 x wechseln)
15.
aufsteigende Alkoholreihe, Xylol → eindecken
Ergebnis:
Pilze
scharf schwarz abgesetzt
Muzin
innere Anteile altrosa
Innere Bereiche der Hyphen
altrosa
Hintergrund
blass-grün
Lösungen:
Methenamin Stocklösung
5 ml 5 % Silbernitratlösung
100 ml 3 % Methaninlösung (3 g Hexamethylentetramin + 97 ml aqua dest)
5 % Boraxlösung
12,5 g Di-Natriumtetraborat
237,5 ml aqua dest
Lichtgrünlösung
Stocklösung: 0,2 g Lichtgrün + 100 ml aqua dest + 0,2 ml Eisessig
Gebrauchslösung: 15 ml Stocklösung + 75 ml aqua dest
Weiterführende Literatur
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