Kompendium Internistische Onkologie

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Publiziert am: 25.06.2022

Prädiktive Testung von Tumorgewebe und ihre klinischen Konsequenzen

Verfasst von: Jens Hoffmann

Für eine prädiktive Substanztestung an Tumorgeweben gibt es erste positive Pilotstudien, jedoch fehlt für die derzeit vielversprechendste Technik der 3D-Kulturen noch eine Validierung in prospektiv randomisierten Studien. Retrospektive und prospektive Untersuchungen konnten belegen, dass die Machbarkeit von molekularem Profiling im gehobenen klinischen Routinesetting gegeben ist. Die Frage, ob bzw. inwieweit eine auf Basis derartiger Ergebnisse zusammengestellte (matched) Therapie zu besseren Ergebnissen als Standardtherapie führt, muss als nicht geklärt eingestuft werden. Die bisher einzige prospektiv randomisierte Studie zu dieser Fragestellung verlief negativ. Wenngleich auch vereinzelte einarmige Strategiestudien einen Vorteil für Therapie gemäß molekularem Profiling suggerieren, ist die Datenlage nicht reif genug, um ein derartiges Vorgehen oder eine Kommerzialisierung derartiger Testsysteme außerhalb von klinischen Prüfungen, d. h. für die klinische Routine, zu empfehlen.

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Einleitung und Definitionen
Diagnostik an Tumorgeweben
Bewertung präklinischer Testung in vitro/in vivo
Beispiele für die Integration von Diagnostik und Testung an Tumorgewebekulturen in die klinische Forschung

Einleitung und Definitionen

Tumorgewebe können in der präklinischen Forschung vielfältig eingesetzt werden, und die darauf basierenden Testsysteme lassen sich in 2 Gruppen klassifizieren:

Humane Tumorgewebe/-zellen, die meist aus einem Operationsresektat, aber auch von einer Biopsie oder aus Aszites, Knochenmarkpunktaten oder Pleuraergüssen gewonnen werden
Tumorgewebe, die von Versuchstieren gewonnen werden, in denen die Tumoren spontan entstanden sind bzw. durch genetische Manipulationen, Karzinogene oder Strahlen induziert wurden

Diese Tumorgewebe bilden die Basis für die präklinische Tumorforschung. Auch hier lassen sich verschiedene Kategorien definieren:

Art und Zeitdauer, wie die Tumorgewebe genutzt werden
Art der Kulturbedingungen für die Tumorgewebe (Abb. 1)

Für diagnostische Tests werden die Tumorgewebe ohne weitere Kultivierungsschritte oft vollständig aufgebraucht. Dazu gehören die Bestimmung von Markern mittels Immunhistochemie (IHC), Polymerase-Kettenreaktionen (PCR; „polymerase chain reaction“), Sequenzierungen sowie Proteom- und Metabolomanalysen, aber auch Kurzzeitsensitivitätstestungen. Die Zahl der Testverfahren ist durch die Menge an zur Verfügung stehendem Tumorgewebe häufig stark limitiert.

Um weitere Testungen durchführen zu können, muss das Tumorgewebe in Kultur genommen werden. Dafür wurden seit über 100 Jahren verschiedene Systeme etabliert, die sich grundsätzlich in In-vitro- und In-vivo-Kulturen klassifizieren lassen. Begonnen hat die Forschung in vivo mit der Erzeugung von Tumorgeweben durch:

Parasitäre Noxen und Viren (Ellermann und Bang 1908; Rous 1911; Graffi 1958)
Chemische Substanzen, wie polyzyklische Kohlenwasserstoffe oder Benzpyrene (Kennaway 1924)
Energiereiche Strahlen, wie Röntgenstrahlen und ultraviolette Strahlung (Bloch 1924; Findlay 1979)
Genetische Manipulation zur Aktivierung von Onkogenen, wie SV40 („Simian virus 40“) oder Myc („myelocytomatosis oncogene cellular homolog“) (Brinster et al. 1984; Stewart et al. 1984)

Kurze Zeit später wurden Methoden entwickelt, um diese Tumorgewebe in vivo weiter zu kultivieren, z. B. als Impftumoren, und solche, die ermöglichten, durch In-vitro-Gewebezüchtung humanes Tumorgewebe nahezu unbegrenzt zu vermehren (Bauer 1963).

Die Einführung der immundefizienten Maus durch Rygaard und Povlsen im Jahr 1969 stellte einen weiteren Meilenstein in der Kultivierung von Tumorgeweben dar. Erstmals konnten humane Tumorgewebe auch in vivo kultiviert werden. Diese Technologie wurde in den folgenden Jahren weiterentwickelt:

Humane Xenotransplantate auf Nude- oder Scid-(„severe combined immunodeficient“)Mäusen (Rygaard und Povlsen 1969; Bosma et al. 1983)
Von Patienten abgeleitete Xenografts (PDX; „patient-derived xenografts“) (Fiebig et al. 1984; Naundorf et al. 1992)
Humanisierte Mäuse und PDX (McCune et al. 1988; Goan et al. 1995)

Diese Modellsysteme wurden speziell in den letzten Jahren intensiv weiter verbessert (Hoffmann 2014; Behrens et al. 2016; Klinghammer et al. 2017).

Heutzutage werden Tumorgewebe hauptsächlich als Werkzeug für die Entwicklung von neuen Therapieverfahren und Diagnostika eingesetzt. Mit der Entdeckung molekularer Subklassen von Tumoren und erstmals auch mit der Einführung von gegen molekulare Zielstrukturen gerichteten (targetspezifischen) Therapeutika bekam die Testung von Tumorgeweben eine neue und immens wichtige Bedeutung. Lange Zeit kam die Forschung mit „übersichtlichen“ Tumorgewebspanels zurecht; das bekannteste Beispiel ist das US National Cancer Institute (NCI) 60 Panel (Shoemaker 2006). Wurden damit neue Substanzen lediglich an 1–2 Tumorgeweben (Modellen) pro Indikation getestet, erforderte die oft niedrige Frequenz an Targetmutationen ab dem Jahr 2000 das Screening von vielen Tumorgeweben. Dem wurde in kurzer Zeit Rechnung getragen, und In-vitro- und In-vivo-Tumormodellbanken von oft mehr als 1000 Tumorgeweben angelegt (Abb. 2). Diese Modelle, zusammen mit den dazugehörigen, teilweise im Hochdurchsatz-(„high-throughput“-)Screening erhobenen, genetischen Daten, ermöglichen eine gezielte Prüfung von Substanzen und haben hohe Prädiktivität für nachfolgende klinische Studien erreicht (Gao et al. 2014).

Heutzutage erfordert dies häufig eine frühzeitige begleitende präklinisch-klinische Forschung, für die der Begriff translationale Forschung geprägt wurde. Neben der Tumorzelle als direktes Target für die Therapie wird zunehmend auch die Tumormikroumgebung ein interessantes Target für die Behandlung von Tumorerkrankungen. Erste Erfolge wurden mit der Inhibierung der Tumorangiogenese durch VEGF-(„vascular endothelial growth factor“-)Kinaseinhibitoren, wie Sorafenib bzw. Sunitinib, erzielt (Wilhelm und Chien 2002; Mendel et al. 2003). Lange Jahre waren Versuche, das Immunsystem gegen Tumorzellen zu aktivieren, nahezu erfolglos. Erst die Entdeckung von Immuncheckpoint-Molekülen und die Möglichkeit der genetischen Modifizierung von Immuneffektorzellen brachten in den letzten Jahren einen entscheidenden Durchbruch (Thompson und Allison 1997). Diese Therapien stellten neue Herausforderungen an die Evaluierung von Tumorgeweben und deren Einsatz als Modellsysteme. Neben den Tumorzellen muss in den Geweben (und damit in den Modellen) die Interaktion mit z. B. Endothelzellen und vor allem oft mit humanen Immunzellen reflektiert werden.

Die gewonnenen Erfahrungen durch die Arbeiten mit Tumorgeweben in der präklinischen Grundlagen- und Arzneimittelforschung brachten immer wieder die Frage auf, ob diese Modelle auch für die Planung einer individuellen Therapie von Patienten eingesetzt werden können. Erste Ansätze verfolgten die In-vitro-Sensitivitätsprüfung von isolierten Tumorzellen auf Wachstumshemmung durch die etablierten Therapeutika – ähnlich den Antibiogrammen, die erfolgreich in der Infektionstherapie eingesetzt wurden bzw. werden.

In den folgenden Abschnitten werden die derzeit verwendeten Methoden zur Testung von Tumorgeweben dargestellt und – soweit möglich – bewertet.

Diagnostik an Tumorgeweben

Diagnostische Testung an Tumorgeweben lässt sich in folgende Abschnitte gliedern:

Klinisch-pathologische Diagnostik (darauf wird hier nicht eingegangen)
Spezifische Diagnostik auf Tumormarker, Targetproteine und genetische Marker mit Methoden wie Immunhistochemie (IHC), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH; „fluorescence in situ hybridization“), Polymerase-Kettenreaktion (PCR; „polymerase chain reaction“) und Sequenzierung
Systematische Analyse von größeren Panels von Tumormarkern bzw. Analyse des gesamten Genoms, Transkriptoms, Proteoms oder Metaboloms

Diagnostik von Tumormarkern

Das älteste Beispiel für die erfolgreiche Einführung eines diagnostischen Tests an Tumorgeweben in der Klinik ist die Bestimmung des Östrogenrezeptors (ER; „estrogen receptor“) für die Therapieplanung beim Mammakarzinom mit Tamoxifen (Furr und Jordan 1984). Viele andere diagnostische Tests waren eher für die Prognose der Erkrankung relevant. Ein weiterer Durchbruch war die Entdeckung der wachstumsstimulierenden Funktion des amplifizierten EGFR-2 („epidermal growth factor receptor-2“) (HER-2) in bestimmten Brusttumoren durch Slamon et al. (2001). Die Einführung eines Tests für HER-2-Amplifikation, verbunden mit der Entwicklung des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, stellte einen Meilenstein in der Behandlung von Mammakarzinomen dar.

In den letzten Jahren wurden weitere neue, spezifische Diagnostiktests etabliert, fast immer in Verbindung mit der Entwicklung von targetspezifischen Therapien, von denen einige in Tab. 1 dargestellt sind.

Tab. 1

Diagnostiktests für targetspezifische Therapien (Auswahl)

Tumorbiologie	Target	Testtyp	Indikation	Arzneimittel/Wirkstoffe	Referenz
EGFR-2-Expression	EGFR-2 (HER-2)	IHC, FISH	Mammakarzinom	Trastuzumab Pertuzumab	Slamon et al. N Engl J Med 2001
ER- und PR-Expression	ER, PR	IHC	Mammakarzinom	Antiöstrogene Aromataseinhibitoren GnRH-Agonisten/Antagonisten	Furr und Jordan Pharmacol Ther 1984
CD20-Expression	CD20	IHC, FACS	Lymphome	Rituximab	Davis et al. Clin Cancer Res 1999
EGFR-Signalweg	Ausschluss von KRAS-aktivierenden Mutationen	PCR, Sequenzierung	Kolorektalkarzinom	Cetuximab	Lièvre et al. Cancer Res 2006
BRAF-Mutation	V600E	PCR, Sequenzierung	Melanom	Dabrafenib und Trametinib	Long et al. Lancet Oncol 2016
EGFR	Aktivierende Mutationen	PCR, Sequenzierung	Lungenkarzinom	Gefitinib Erlotinib Afatinib Osimertinib	Massarelli et al. Lung Cancer 2013 Dagogo-Jack et al. JCO Precis Oncol 2018
BCR/ABL-Fusion	BCR/ABL-Fusionsproteine	PCR, Sequenzierung	Chronisch myeloische Leukämie (CML)	Imatinib	Deininger et al. Blood 2005
ROS1-Rearrangements	ROS1-Fusionsproteine	PCR, Sequenzierung	Lungenkarzinom	Crizotinib	Shaw et al. N Engl J Med 2014
NTRK-Rearrangements	TRK-Fusionsproteine	PCR, Sequenzierung	NTRK-Fusionsprotein-positive Tumoren	Larotrectinib Entrectinib	Cocco et al. Nat Rev Clin Oncol 2018
ALK- Rearrangements	ALK-Fusionsproteine	PCR, Sequenzierung	Lungenkarzinom	Crizotinib	Solomon et al. N Engl J Med 2014
RET- Rearrangements	RET-Fusionsproteine	PCR, Sequenzierung	RET-Fusionsprotein-positive Tumoren	Cabozantinib Vandetanib Loxo-292	Subbiah et al. Ann Oncol 2018 Wang et al. J Clin Oncol 2012
FGFR-Rearrangements	FGFR1-4-Fusionsproteine	PCR, Sequenzierung	Urothelkarzinom	Rogaratinib Erdafitinib	Schuler et al. 2019 Siefker-Radtke et al. ASCO 2018

ABL, Abelson murine leukemia viral oncogene homolog; ALK, anaplastic lymphoma kinase; ASCO, American Society of Clinical Oncology; BCR, breakpoint cluster region; BRAF, v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1; CD, cluster of differentiation; EGFR, epidermal growth factor receptor; ER, estrogen receptor; FACS, fluorescence-activated cell sorting; FISH, fluorescence in situ hybridization; FGFR, fibroblast growth factor receptor; GnRH, gonadotropin-releasing hormone; HER2, human epidermal growth factor receptor 2; IHC, immunhistochemie; KRAS, Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog; NTRK, neurotrophic receptor tyrosine kinase; PCR, polymerase chain reaction; PR, progesterone receptor; RET, rearranged during transfection; ROS1, ROS proto-oncogene 1 receptor tyrosine kinase; TRK, tropomyosin receptor kinases

Bewertung dieser Tests

Diese fast ausschließlich mit neuen Arzneimitteln/Wirkstoffen zusammen entwickelten diagnostischen Testverfahren haben oft eine sehr hohe negative Prädiktivität, d. h., Tumoren ohne Expression der Marker sprechen auch nicht auf die Therapie an. Die positive Prädiktivität hingegen variiert häufig. So sprechen nur etwa 50 % der KRAS-(„Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog“-)Wildtyp-(wt-; „wild type“-)Tumoren auf Cetuximab an; auch bei ER-positiven Testergebnissen gibt es eine größere Zahl an ER+ Patientinnen mit Mammakarzinomen, die nicht auf eine Hormontherapie ansprechen. Dagegen ist die positive Prädiktion bei den seltenen Fusionsproteinen sehr hoch; dies erlaubt z. B. die erfolgreiche Durchführung von klinischen Prüfungen in sehr kleinen Patientengruppen. Als Beispiel hierfür seien die in Tab. 1 beschriebenen ALK-(„anaplastic lymphoma kinase“-), RET-(„rearranged during transfection“-) und NTRK-(„neurotrophic receptor tyrosine kinase“-)Inhibitoren genannt. Generell ist diese Form der Testung von Tumorgeweben etabliert und der Nutzen nachgewiesen.

Für die Entwicklung von neuen Arzneimitteln besteht heutzutage immer auch die Frage nach der von begleitenden spezifischen Biomarkertests („companion diagnostics“). Da oft die Targets schon in umfangreichen Panels von Tumorgeweben entdeckt und validiert wurden, können die dafür verwendeten Tests auch sehr gut für die Entwicklung der entsprechenden Biomarker herangezogen werden. Herausforderungen für die Forschung sind noch der Nachweis der Spezifität der Tests und eine einfache Probengewinnung, die Stabilität des Targets im Tumorgewebe garantiert. Da die Entnahme von Tumorgewebe durch Biopsien oft limitiert ist, werden derzeit vermehrt zirkulierende Tumorzellen bzw. Tumor-DNA (Desoxyribonukleinsäure) für solche Tests geprüft (Pantel und Hayes 2018).

Präklinische Testung an Tumorgewebekulturen

In-vitro-Modelle

2D-in-vitro-Modelle

Seit Anfang des 20. Jahrhunderts wurde bereits eine gewisse Zahl an Zelllinien von den verschiedensten Tumortypen etabliert. Diese werden für die Forschung von Zellbanken wie der American Type Culture Collection (ATCC), der European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) oder der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) gesammelt, aufbewahrt und zur Verfügung gestellt. Zelllinien von Tumoren sind heutzutage die am häufigsten genutzten Modelle in der Krebsforschung und haben speziell in den letzten 3 Jahrzehnten entscheidend zum Verständnis der Tumorbiologie und der Entwicklung neuer Therapien beigetragen (Shoemaker 2006). Zelllinien bieten viele Vorteile für die präklinische Krebsforschung, wie einfache Manipulierbarkeit, unbegrenzte Verfügbarkeit und geringe Kosten. Die Tumorzellen wachsen in diesen Modellen auf der Oberfläche von Kulturgefäßen in einer Schicht in 2 Dimensionen, daher der Begriff 2D-in-vitro-Modelle. Testverfahren an 2D-Zellkulturen sind sehr einfach und sowohl manuell als auch automatisiert im Hochdurchsatz-Screen durchzuführen.

Für viele Jahre war eine umfangreich charakterisierte Sammlung von 60 Tumorzelllinien am NCI in Bethesda (NCI60 Panel) der Standard für die Forschung. Millionen von Substanzen wurden an diesem Panel auf Tumorwachstumshemmung getestet und die Daten öffentlich zur Verfügung gestellt (Shoemaker 2006). In den letzten Jahren hat die Zahl der zur Verfügung stehenden Zelllinien enorm zugenommen. Im Cancer Genome Project und in der Cancer Cell Line Encyclopedia wurden mehr als tausend Tumorzelllinien molekulargenetisch charakterisiert. An diesen Zellen wurden neben vielen zugelassenen Arzneimitteln auch neue, experimentelle, targetspezifische Inhibitoren getestet. Die Korrelation der genomischen mit den pharmakodynamischen Daten ermöglichte die Identifizierung von tumorspezifischen Pathways und die Generierung von Algorithmen für eine gezielte Inhibierung des Tumorwachstums basierend auf dem molekulargenetischen Profil des Tumors (Barretina et al. 2012; Garnett et al. 2012; Haibe-Kains et al. 2013). Die Arbeiten dieser Konsortien können derzeit als Grundlage für die individuelle präklinische Testung genutzt werden. Die Herstellung von 2D-Tumorgewebekulturen ist schnell und kostengünstig möglich. Basierend auf den molekularen Daten kann die Prüfung von Standardsubstanzen und targetspezifischen Substanzen eine wichtige Option darstellen, um potenziell unwirksame Arzneimittel/Substanzen zu identifizieren.

Nachteile dieser Technologie sind die schlechten Anwachsraten der Tumorzellen in der 2D-Kultur (nur zwischen 10–50 %) und die hohe Zahl an falsch positiven Ergebnissen, da die Tumorzellen permanent direkt einer hohen Konzentration des Wirkstoffs ausgesetzt sind und das durch den Verlust der Tumorarchitektur und des Tumorstromas („tumor microenvironment“) die Wechselwirkungen mit anderen Zellen sowie auch Transportprozesse und anderes fehlen. Ein weiterer Nachteil ist das häufig klonale Wachstum der Tumorzellen in der 2D-Kultur. Schon nach wenigen Passagen dominieren schnell wachsende Klone die Kultur, und die Tumorheterogenität geht verloren (Kasai et al. 2016).

Durch diese bekannten Nachteile wird die translationale Relevanz dieser Modelle zunehmend infrage gestellt. Zusammengefasst haben die 2D-Gewebekulturen einen wichtigen Beitrag in der Forschung geleistet, werden aber zunehmend durch verbesserte Modellsysteme ersetzt.

3D-in-vitro-Modelle

Die oben genannten Limitationen der 2D-Zellkultur werden zum Teil durch die Kultivierung im 3D-Format überwunden. Die 3D-Kulturen bilden das natürliche Tumorgewebe besser ab, da die Gewebemorphologie und Heterogenität erhalten bleiben. Dies ist eine wichtige Voraussetzung, da speziell die Wechselwirkungen mit der Umgebung die Genexpression und das Zellverhalten beeinflussen (Schmeichel und Bissell 2003; Kenny et al. 2007; Lao et al. 2015). Erste 3D-Kulturen wurden in der Mitte des 20. Jahrhunderts etabliert, um die Organbildung und Tumorentstehung zu modellieren. Durch ihre Komplexität erreichen sie eine wichtige Zwischenstufe vor den Tiermodellen, korrelieren mit den Geweben in vivo und werden in einer Vielzahl von experimentellen Methoden zur Evaluierung von Chemotherapeutika, Strahlentherapie sowie von Antikörpern und Immuntherapeutika eingesetzt (Durand und Olive 2001).

Die sich in vitro herausbildenden organähnlichen Strukturen ermöglichen auch Untersuchungen zur Interaktion von Tumorzellen mit ihrer Umgebung, dem Stroma und dem Endothel, sowie zur Regulation von Wachstum, Invasion, Stoffwechsel und Migration der Tumoren (Pinto et al. 2015; Rodenhizer et al. 2016). Abhängig vom Tumor bilden 3D-Kulturen spezifische Strukturen mit konzentrischen Zelllagen, die, ähnlich zu denen in In-vivo-Tumoren, ab einer Größe von 500 μm eine äußere proliferierende Schicht, eine mittlere Ruheschicht und innere Nekrosen aufweisen. Dies erlaubt auch das Studium der Diffusion von niedermolekularen Wirkstoffen, Antikörpern und Peptiden in die Tumoren (Mueller-Klieser 1984; Rodenhizer et al. 2016). Die Einführung der 3D-Zellkulturen ermöglicht auch zunehmend die Etablierung von bisher sehr schlecht zu kultivierenden Tumoren, unter anderem von Prostatakarzinomen, Sarkomen oder Glioblastomen (Gao et al. 2014; Hubert et al. 2016; Calandrini et al. 2021). Tumoren, die zunächst erfolgreich in vitro kultiviert wurden, können nachfolgend aber auch für die Etablierung von Maus-Xenograft-Modellen genutzt werden (Schütte et al. 2017).

Für die individuell prädiktive Testung ist vor allem die Etablierung von durchsatzfähigen Proliferationstests mit 3D-Zellkulturen von Bedeutung (Boehnke et al. 2016). Während es sich für einige Tumoren (unter anderem Kolon, Pankreas, Lunge) sehr leicht umsetzen lässt, bereiten andere Tumorarten noch Probleme (van de Wetering et al. 2015; Huang et al. 2015; Hubert et al. 2016; Broutier et al. 2017; Seidlitz et al. 2019).

In Bezug auf das patientenindividuelle Screening werden erste, begleitend zu klinischen Prüfungen, präklinische Studien durchgeführt, um diese Methode dafür zu validieren (Vlachogiannis et al. 2018; Lee et al. 2018; Sachs et al. 2018). In einer aktuellen Metaanalyse wurden insgesamt 17 Studien ausgewertet, in denen die Therapie-Testung mittels 3D-Kulturen als potentielle prädiktive Biomarker für die Behandlung von Patienten geprüft wurde. Die Auswertung ergab allerdings nur eine geringe Prädiktivität der Therapietestung in 3D-Kulturen von soliden Tumoren. So wurde nur in 5 der 17 Studien eine statistisch signifikante Korrelation für die 3D-Kultur basierte Substanztestung mit einem klinischen Ansprechen gefunden, mit einer Sensitivität von 0,81 (95 % CI 0.69–0.89) und Spezifität von 0,74 (95 % CI 0.64–0.82; Wensink et al. 2021). Für Leukämien haben zwei parallel durchgeführte Studien eine bessere Prädiktion nachgewiesen. So wurde in 54 % von 146 Patienten durch eine auf in vitro Substanztestung basierte Behandlung eine Verlängerung des progressionsfreien Überlebens um das ≥1,3-fache bestätigt. In 21 % der Patienten wurde sogar ein aussergewöhnliches Therapieansprechen („disease-specific exceptional response“) beobachtet (Kornauth et al. 2022). In einer zweiten Publikation wurden ähnliche Studienergebnisse berichtet (Malani et al. 2022).

Zusammenfassend fehlt für solide Tumore, trotz vieler zum Teil noch laufender Studien, immer noch eine abschließende Validierung der Testmethodik (Letai et al. 2022). Einen Durchbruch bei der prädiktiven In-vitro-Therapietestung gab es hingegen bei den Leukämien mit ersten vielversprechenden Studienergebnissen (Kornauth et al. 2022; Malani et al. 2022).

Organotypische Kulturen von Tumorschnitten als In-vitro-Modell

Eine einfache Methode der Tumorkultivierung in vitro basiert auf der Herstellung von ca. 1–2 mm starken Tumorschnitten. Diese werden nachfolgend in ein Kulturmedium transferiert und in Petrischalen oder Kulturplatten inkubiert. Dies ermöglicht sowohl das Studium von Tumorphysiologie als auch das von Zellproliferation, Zelltod, Substanzaufnahme, Verteilung, Gen- und Proteinexpression. Verschiedene Studien an Kopf- und Halstumoren, Magen- und Mammakarzinomen sowie anderen wurden dazu durchgeführt (van der Kuip et al. 2006; Estes et al. 2007; Milani et al. 2010; Gerlach et al. 2014; Koerfer et al. 2016). Ein großer Nachteil dieser Methode sind die limitierte Verfügbarkeit an Tumorgewebe, die Heterogenität, die begrenzte Vitalität und die fehlende Möglichkeit der Gewebeexpansion. Üblicherweise können solche Gewebeschnittkulturen nur für wenige Tage am Leben erhalten werden.

Zusammengefasst ist diese Methode nur für Kurzzeitstudien für eine limitierte Zahl an Substanzen einsetzbar, sehr schwer zu validieren und deshalb für den Routineeinsatz zur individualisierten Behandlungsplanung nicht geeignet.

Organ auf dem Chip-Modelle

Ein Hauptproblem der gegenwärtigen Gewebekulturen ist das Fehlen einer Mikrogewebestruktur und auch einer zirkulierenden Nährstoffversorgung. Deshalb wird versucht, dieses Problem durch eine Gewebekultur in kleinen Kammern (Mikrokammern) mit angeschlossenen Pumpen, die permanent Nährstofflösungen durch die Kammern zirkulieren lassen, zu umgehen (Esch et al. 2015). Diese komplexen Systeme kommen einem natürlichen Organ sehr nahe und werden deshalb auch als Organ-auf-dem-Chip-(„Organ-on-chip“-)Modelle bezeichnet (Capulli et al. 2014). Diese Modelle ermöglichen ein besseres Wachstum der Gewebe sowie eine Modellierung pharmakokinetischer Prozesse, wie Aufnahme (Absorption), Verteilung und Biotransformation, in einem komplexen System. Mithilfe von Technologien aus der Computerchipherstellung ist es heute möglich, komplexe Gewebe-Gewebe-Verbünde (z. B. von intestinalen Organen) zu etablieren (Kasendra et al. 2018). Neben der Generierung von physiologisch-anatomischen Geweben auf dem Chip kann die Technologie auch für die Untersuchung pathologischer Veränderungen, wie z. B. der Tumorentstehung bzw. -proliferation, verwendet werden (Ingber 2016).

Vor kurzem wurden bereits erste Anwendungen für eine Substanztestung beschrieben. Lanz et al. (2017) haben ein Brustkrebsmodell auf einem Chip etabliert, das ein Screening von bis zu 50 Substanzen an organtypischen 3D-Brustkrebskulturen in einer extrazellulären Matrix ermöglichen soll. Bisher wurden allerdings nur 2 von Patienten abgeleitete Tumoren untersucht, sodass eine Validierung noch aussteht. Der von den Autoren vorgeschlagene Arbeitsablauf könnte aber in Zukunft eine Möglichkeit für die prädiktive Testung darstellen. Hassell et al. (2018) beschreiben ein alveolär-kapilläres Lungenmodell, in dem implantierte Lungenkarzinomzellen ein invasives Tumorwachstum zeigen, das dem im Patienten sehr nahekommt. Auch das Ansprechen auf eine Therapie unterscheidet sich deutlich von anderen Zellkulturen und entspricht eher der klinischen Situation. Mit diesem Modell soll es sogar möglich sein, den Einfluss der Atmung auf das Therapieansprechen zu evaluieren.

Neben Epithel- und Endothelzellen können auch weitere Gewebezellen in diese Modelle integriert werden, wie z.B. zirkulierende Immunzellen, Bindegewebszellen und neuronale Zellen, um ein besseres Wachstum der Gewebe und eine parallele Modellierung physiologischer, pharmakologischer und pharmakokinetischer Prozesse in einem komplexen System zu ermöglichen (Achyuta et al. 2013; Benam et al. 2016; Yang et al. 2018).

Tumor- und Organ-auf-dem-Chip-Modelle haben das Potenzial, einige der Limitationen bisheriger Zellkulturen zu überwinden, aber die Applikationen sind alle noch in der Entwicklung. Abb. 3 stellt den Arbeitsablauf einer 2D- oder 3D-Zellkultur oder Tumor-auf-dem-Chip-basierten personalisierten Substanztestung einer PDX-(„patient-derived xenograft“-)basierten gegenüber. Diese Testmodelle könnten aufgrund reduzierter Materialanforderung und wesentlich verkürzter Zeitdauer einen Beitrag für die Planung einer personalisierten Behandlung leisten.

In-vivo-Modelle

In den vorherigen Abschnitten wurden bereits die enormen Fortschritte der In-vitro-Technologien beschrieben, die sicherlich in absehbarer Zeit erlauben werden, den Einsatz von Tiermodellen zu reduzieren bzw. diese ganz einzusparen.

In-vivo-Tumormodelle wurden über viele Jahre intensiv sowohl in der Grundlagenforschung als auch für die Entwicklung neuer Therapien verwendet. Zunächst wurden für die Forschung ausschließlich Maus- bzw. Rattentumoren eingesetzt. Erst ab 1960 erlaubte die Entdeckung von immundefizienten Mäusen die Xenotransplantation von humanen Tumorgeweben auf Mäuse und Ratten. Für die Xenotransplantation wurden neben humanen Tumorzelllinien bald Patiententumorgewebe verwendet – die „patient-derived xenografts“ (PDX) (Fichtner et al. 2008; DeRose et al. 2011; Klinghammer et al. 2015). Neben diesen erlaubte die Entdeckung von gentechnologischen Verfahren in den 1980er-Jahren die Generierung von gentechnisch veränderten Mäusen. Diese wurden und werden sehr intensiv sowohl zur Untersuchung von genetischen Ursachen für die Krebsentstehung als auch zur Targetvalidierung genutzt. Zur Entwicklung und zum derzeitigen Stand und zur Verwendung von In-vivo-Modellen wird auf entsprechende Übersichtsartikel verwiesen (Behrens et al. 2016; Fichtner et al. 2017; Klinghammer et al. 2017; Meehan et al. 2017).

Von den In-vivo-Modellen kommen ausschließlich PDX für eine prädiktive Testung infrage. Dafür gibt es bereits einige Beispiele (Stebbing et al. 2014; Izumchenko et al. 2017). Trotz vieler positiver Ergebnisse steht die finale Validierung der Übertragbarkeit von PDX-Daten auf Patienten in Phase-III-Prüfungen noch immer aus.

„Patient-derived xenografts“-(PDX-)in-vivo-Modelle

Izumchenko et al. (2017) berichteten über erste Studien, in denen von Patienten etablierte PDX-Modelle für ein Substanzscreening genutzt wurden, um eine individuelle Behandlungsstrategie für Patienten zu entwickeln. Tumoren von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung wurden als Xenografts etabliert und mit diesen Wirkstoffe in verschiedenen Kombinationen getestet. Basierend auf den Ergebnissen wurden für Patienten individuelle Behandlungsoptionen aufgestellt. In über 85 % der Patienten wurde mit diesen prospektiv geplanten Behandlungen partielles Ansprechen erreicht.

Viele weitere anekdotische Berichte beschreiben ebenfalls eine sehr gute Korrelation zwischen dem Ansprechen von Patienten und dem PDX-Modell unter anderem für Kolonkarzinome und Sarkome (Fichtner et al. 2004; Stebbing et al. 2014); jedoch bleibt die individuelle Behandlungsplanung mithilfe von PDX-Modellen eine Herausforderung, die auch nur in einzelnen Fällen mit Erfolg zum Einsatz kommen wird (Byrne et al. 2017). So bleibt Patienten oft nicht die Zeit, um auf die Ergebnisse zu warten, und Patienten müssen mit den etablierten Arzneimitteln (SoC; „standard of care“) behandelt werden. Weitere Probleme sind die enorm hohen Kosten für diesen Ansatz, die fehlende Validierung in Phase 3, die eine Anerkennung und Kostenerstattung durch Krankenkassen bisher nicht ermöglicht, sowie das regulatorische Umfeld in Deutschland oder Österreich, das eine Off-Label-Nutzung der identifizierten Substanzen vielfach nicht erlaubt oder erschwert.

Ein Ansatz wäre die prospektive Etablierung von PDX von Hochrisikopatienten mit z. B. genetisch prädisponierten Tumoren und der nachfolgenden Testung von infrage kommenden Wirkstoffen, um nach Versagen der Standardtherapie eine rationale Folgetherapie anbieten zu können. Alleine die Etablierung eines solchen Modells dauert jedoch 1–3 Monate und die Prüfung von Wirkstoffen oft nochmals so lange. Zu dieser Zeitlimitierung – viele Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren benötigen eine Therapieentscheidung innerhalb von 4 Wochen und können nicht auf die Etablierung eines PDX-Modells oder sogenannten Avatars warten – kommen noch variierende Anwachsraten, die speziell bei Brust- und Prostatakarzinomen unter 5–10 % liegen, die eine breitere Anwendung verhindern.

Bisher noch nicht diskutiert, stellt auch die intratumorale Heterogenität eine Herausforderung für solche Testverfahren dar. So wurden kürzlich von einem Patienten mit fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom 7 Tumormodelle aus verschiedenen Regionen des Tumors etabliert. Die nachfolgende Substanztestung ergab erhebliche Unterschiede in der Sensitivität der einzelnen Modelle gegenüber targetgerichteten Therapien wie z. B. Sorafenib und Everolimus (Hoffmann et al. unpublizierte Daten). Die nachfolgenden Untersuchungen von Genexpression und Mutationen können nur zum Teil die unterschiedlichen Ansprechraten erklären und verdeutlichen, wie variabel die Ergebnisse einer prädiktiven Substanztestung sein können.

Ein kürzlich vorgestellter Ansatz von Girotti et al. (2016) beruht auf der Transplantation von zirkulierenden Tumorzellen in immundefiziente Mäuse. Die so etablierten PDX können für eine Substanztestung eingesetzt werden. Speziell für Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung, bei denen eine wiederholte Gewebeentnahme nicht möglich ist, könnte diese Technologie zum Einsatz kommen.

Humanisierte Mausmodelle

Eine der Limitationen/Nachteile von PDX-Modellen ist das Fehlen eines funktionellen Immunsystems in immundefizienten Mausstämmen. Zusammen mit den humanen tumorassoziierten Stromazellen bilden diese eine Tumormikroumgebung („microenvironment“), die für die Kontrolle des Wachstums der Tumoren von großer Bedeutung ist. Speziell das Immunsystem steht in den letzten Jahren im Fokus der Suche nach neuen Behandlungsoptionen für Tumoren. Die Entdeckung der Immuncheckpoints CTLA-4 („cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen-4“) und PD-L1 („programmed death-ligand 1“), begleitet von der Entwicklung von potenten Inhibitoren, haben einen Boom in dieser Forschungsrichtung ausgelöst (Thompson und Allison 1997).

Da immuntherapeutische Forschung Modelle mit funktionellen Immunzellen erfordert, erlebten zunächst die „alten“ syngenen Maustumormodelle ein Revival. Da Mäuse aber nur begrenzt das humane Immunsystem abbilden, wurde mit der Etablierung von Mäusen mit einem humanen Immunsystem begonnen (Shultz et al. 2012). Mittlerweile wurden mehrere Methoden zur Generierung von Mäusen mit einem humanen Immunsystem beschrieben, die im Wesentlichen auf 2 Methoden in Anlehnung an die Transfusions- und Transplantationsmedizin beruhen:

Transplantation von reifen Immunzellen (T-Zellen oder peripheren mononukleären Blutzellen [PBMC]) auf hoch immundefiziente Mäuse (Amadori et al. 1996)
Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSC) auf immundefiziente „knochenmarkablatierte“ Mausstämme, oftmals unterstützt durch Expression von spezifischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren (Greiner et al. 1998)

Die Transplantation der humanen Immunzellen führt zu einem Anwachsen („engraftment“) der Zellen im Knochenmark und in der Milz der Mäuse. Werden PBMC transplantiert, können bereits nach einigen Tagen zirkulierende, funktionelle T- und B-Zellen im Blut nachgewiesen werden. Nach der Transplantation von Stammzellen dauert es jedoch bis zu 3 Monaten, bis funktionelle Immunzellen im Blut nachgewiesen werden (Abb. 4).

Erfolgt im Gegensatz die Transplantation der PBMC auf Mäuse, denen bereits ein humaner Tumor transplantiert worden war (Xenografts), steht ein funktionelles humanes System für die präklinische Prüfung von Immuntherapien zur Verfügung. Voraussetzung ist allerdings eine gewisse Kompatibilität der jeweiligen Spender. Diese Testsysteme haben ihre Eignung bei der Entwicklung von bispezifischen Antikörpern mit T-Zell-Aktivierung bereits erfolgreich bewiesen und könnten auch für die individuelle Therapieprädiktion eingesetzt werden (Schlereth et al. 2005). Voraussetzung ist allerdings, dass neben den Tumoren auch hämatopoetische Zellen (PBMC bzw. Stammzellen) zur Verfügung stehen.

Um diese Modelle weiter zu verbessern, werden humane fötale Leber- und Thymuszellen kotransplantiert. Dies erlaubt eine T-Zell-Reifung im autologen Gewebe (Karpel et al. 2015). In Deutschland sind solche Studien aus gesetzlichen Gründen nicht möglich. Kürzlich beschriebene humanisierte BLT-(„Bone marrow-liver-thymus“-)Modelle sollen die Expansion humaner Immunzellen erlauben, ohne dass diese ihre Funktionalität verlieren, was bei einer Ex-vivo-Expansion sehr häufig der Fall ist (Smith et al. 2016).

Bewertung präklinischer Testung in vitro/in vivo

Eine bewertende Übersicht in Bezug auf die aktuelle Anwendbarkeit von In-vitro-/In-vivo-Testsystemen für die Prädiktion ist in Tab. 2 gegeben.

2D-Zellkulturen sind ein gutes Werkzeug für die Forschung, aber sehr limitiert für die Prädiktion von Therapieansprechen einsetzbar.
3D-Zellkulturen bilden die Morphologie des Tumors sehr gut ab und sind aufgrund der guten Anwachsraten derzeit die beste Methode für prädiktive Studien.
PDX bilden den Tumor am besten ab, sind jedoch wegen hoher Kosten, geringerer Anwachsraten und langer Zeitdauer nur für spezielle Ansätze (Hochrisikopatienten) zu empfehlen.
Alle anderen Technologien („Organ auf dem Chip“ und humanisierte Mäuse) sind noch im Forschungsstadium.

Tab. 2

Bewertung der präklinischen Testsysteme für den Einsatz in Forschung, Entwicklung und personalisierter Onkologie

	Testsystem	Anwendbarkeit für die Prädiktion
		Hochdurchsatz-Screening	Biomarkerforschung	Toxikologie Bewertung	Individuelle Therapieplanung
In vitro	Zelllinien (2D)	+++	++	+	–
	3D-Zellkulturen	++	++	+	++
	Gewebeschnitte	–	++	+	+
	Organ auf dem Chip	+	+++	+++	+++
In vivo	PDX	–	+++	+++	+++
In vivo	Humanisierte PDX	–	+++	+++	+++

D, dimensional; PDX, patient-derived xenograft

Beispiele für die Integration von Diagnostik und Testung an Tumorgewebekulturen in die klinische Forschung

Seit einigen Jahren werden größere Tumormodellbanken für das Screening von neuen Substanzen eingesetzt (2D-, 3D-Zellkulturen, PDX). Derartige präklinische Studien, in denen zwischen 5–50 verschiedene Tumormodelle verwendet werden, erlauben eine erste Vorhersage über die zu erwartenden Effekte in Patienten und werden deshalb auch als präklinische Phase-II-Studien bezeichnet (Hoffmann et al. 1999; Barretina et al. 2012; Garnett et al. 2012; Amendt et al. 2014; Fritsch et al. 2014; Gao et al. 2015). Fritsch et al. (2014) zeigten, wie ein translationales Screening in 2D-Zellkulturen die Entwicklung eines Kinasehemmers bei der Identifizierung des optimalen Patientenkollektivs unterstützt.

Einige Untersucher zeigten nahezu parallel, wie prädiktiv z. B. eine Substanztestung in größeren PDX-Kohorten sein kann (Bertotti et al. 2011; Amendt et al. 2014; Bertotti et al. 2015; Schütte et al. 2017). Während die Gruppe um Bertotti et al. (2011) ihre PDX-Modelle zur Aufklärung von Resistenzmechanismen nutzten, identifizierten Schütte et al. (2017) neue Biomarker für die Vorhersage des Ansprechens auf Cetuximab. Bertotti et al. (2015) zeigten in ihrer Studie, dass z. B. in Cetuximab-resistenten kolorektalen Tumoren ohne Mutationen in den 4 bekannten Onkogenen KRAS, NRAS („neuroblastoma RAS viral oncogene homolog“), PI3K („phosphoinositide-3-kinase“) und BRAF („v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1“) eine HER-2-Amplifikation für die Resistenz verantwortlich ist und der Einsatz eines HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitors in Kombination mit einem Antikörper, wie Lapatinib mit Pertuzumab, eine Behandlungsoption darstellen könnte. Bei einer angenommenen Frequenz von 5 % der Patienten mit Kolorektalkarzinomen mit HER-2-Amplifikation wären das allein in den USA mit insgesamt 1.177.556 derartigen Patienten immerhin ca. 60.000 Patienten, für die diese Kombination eine Behandlungsoption darstellen könnte (Sartore-Bianchi et al. 2016). In der HERACLES-Studie wurden 914 Patienten mit Kolorektalkarzinom getestet und 27 mit HER-2-amplifizierten Tumoren identifiziert. Eine Behandlung mit der beschriebenen Kombination führte in 59 % der intensiv vorbehandelten Patienten zu einer vorübergehenden Kontrolle der Erkrankung (Sartore-Bianchi et al. 2016). Aufgrund der niedrigen Frequenz an HER-2-Amplifikationen wäre dieser Resistenzmechanismus in den wenigen bisher etablierten Kolorektalkarzinomzelllinien sehr wahrscheinlich nicht aufgefallen. Die Studie mit dem großen Panel an PDX demonstriert daher sehr gut das translatorische Potenzial von präklinischen Studien mit diesen Modellen für biomarkerbasierte Behandlungsindividualisierung (Bertotti et al. 2015).

Studien mit PDX-Modellen sind nicht unproblematisch. Sie erfordern sowohl hoch spezialisierte Labore, Personal als auch Software und sind dementsprechend teuer. So wurden in der Vergangenheit meist 5–10 Mäuse pro Gruppe getestet, was enorme Kosten verursachte und die Zahl der Studien limitierte. Diese Probleme führten dazu, dass in den letzten Jahren einige Gruppen versucht haben, begleitend zu klinischen Prüfungen, präklinische Studien mit einer Maus pro Gruppe durchzuführen. Migliardi et al. (2012) und Murphy et al. (2016) waren die ersten, die eine solche Studie mit einem 1x1x1-Design beschrieben. Dieser Ansatz wurde in großen Screeningstudien getestet und validiert (Gao et al. 2015). Damit wurde ein neuer Standard für PDX-Versuche gesetzt. Diese Ansätze erlauben die präklinische Bestimmung von Ansprechraten auf neue Therapien bzw. Therapiekombinationen in heterogenen Patientenpopulationen in einem der klinischen Phase II ähnlichen Design mit vertretbaren Kosten (oft weniger als 5–10 % der Kosten für eine klinische Prüfung).

Wird dieses präklinische Studiendesign an eine Phase-II-Prüfung adaptiert, kann man bei einer Wahrscheinlichkeit für einen Typ-I-Fehler (α) = 0,05 und einer Power von 0,8 mit einer Ablehnungshypothese von (p0) = 0,1 und einer Annahmehypothese von (pn) = 0,25 mit 33 PDX-Modellen eine relevante und robuste Aussage erhalten, ob z. B. ein neuer Wirkstoff in einer Patientenpopulation aktiv ist (Fleming 1982).

Trotz dieser vielen positiven Ergebnisse steht die finale Validierung der Übertragbarkeit von PDX- Daten auf Patienten in Phase-III-Prüfungen noch immer aus.

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