Ohne histo- bzw. zytomorphologische Diagnose eines Tumors sollte kein Behandlungskonzept festgelegt werden. Die Morphologie dient der histologischen Klassifikation (Typing, TNM) und der Bestimmung des Malignitätsgrades (Grading, G). Relevante klinische Informationen zum Krankheitsbild, die genaue Entnahmelokalisation sowie eine präzise Fragestellung sind für die Durchführung einer pathologischen Befundung selbstverständlich. Während für den intraoperativen Schnellschnitt entnommenes Gewebe unverzüglich und ohne Fixativ in die Pathologie überführt wird, soll das übrige Gewebe normalerweise unmittelbar nach der Entnahme in 4 %iges gepuffertes Formalin überführt werden. Eine Fixierung von 24 h ist anzustreben und ist die Voraussetzung für die sich oftmals anschließende Darstellung von Proteinen mittels Immunhistochemie. Obwohl mit einer guten diagnostischen Treffsicherheit behaftet, sollte der präoperativen Stanzbiopsie mit ausreichender Fixierung der Vorzug vor dem intraoperativen Schnellschnitt gegeben werden, wenn es darum geht, die genaue histologische Tumorentität zu bestimmen. Nach dem Ausgangsgewebe kann man zwischen Karzinomen (epitheliale maligne Tumoren), Sarkomen (mesenchymale maligne Tumoren), malignen Lymphomen (maligne Geschwülste des lymphoretikulären Systems) sowie Leukämien differenzieren. Für jeden Organtumor ist von der WHO eine relevante histologische Klassifikation mit klaren Definitionen und detaillierten Klassifikationsprinzipien festgelegt worden. Es wird allgemein empfohlen, im Interesse der internationalen Zusammenarbeit und Vergleichbarkeit, einen Tumor nach der WHO-Klassifikation zu diagnostizieren. Da sich Tumoren der gleichen histologischen Klassifikation biologisch sehr unterschiedlich verhalten können, müssen histologische Parameter, die auf eine geringe Differenzierung und damit erhöhte Aggressivität hinweisen, erfasst werden. Das Grading, als Festlegung des Differenzierungsgrads eines Tumors, gibt dem Kliniker hierfür Hinweise auf die einzuschlagende Therapie und die damit verbundene Prognose des Patienten. Insgesamt gilt der Grundsatz, dass je höher der Differenzierungsgrad (von G1 nach G4) ist, desto höher ist auch der Malignitätsgrad. Je größer die Malignität ist, desto größer sind die Aggressivität, die Wachstumsgeschwindigkeit und die Metastasierungshäufigkeit. In neuerer Zeit wird das rein morphologische Grading durch moderne molekulare Untersuchungen ergänzt; diese liefern weitere Hinweise auf die Prognose bzw. mögliche therapeutische Angriffsziele. Neben diesen Faktoren wird am Tumorresektat, nach der histologischen Aufarbeitung der Randbezirke des Tumors, noch eine Aussage zum Vorhandensein von Residualtumor, sog. R-Klassifikation, im Organismus getroffen. Die Einteilung R0 bedeutet, dass kein Residualtumor nachweisbar ist, während R1 einen mikroskopischen und R2 einen makroskopischen Tumorrest anzeigt. In manchen Organsystemen, wie dem Rektum und dem Pankreas, wird die R-Klassifikation noch durch die CRM-(„circumferential resection margin“-)Angabe komplettiert. Dieser Wert beschreibt im metrischen Maß den Abstand des Tumors zum Resektionsrand. Im Allgemeinen wird der CRM als positiv gewertet (CRM+), wenn Tumoranteile ≤1 mm an den Resektionsrand heranreichen. Dabei ist es irrelevant, wie die Tumorzellen dahin gelangt sind; es werden sowohl Satellitenknötchen, Lymphknotenmetastasen, Tumorgefäßeinbrüche oder ein Wachstum per continuitatem berücksichtigt. In den letzten Jahren werden immer mehr neue Techniken der Molekularpathologie eingesetzt, um eine noch höhere diagnostische Präzision zu erreichen. Das Ergebnis dieser genetischen Untersuchung hilft dem Kliniker schlussendlich, präzisere Aussagen für sein therapeutisches Handeln zu liefern. Dabei ist die Molekularpathologie als Teilgebiet der Pathologie zu definieren und hilft, tumoröse, infektiologische, hereditäre und andere Erkrankungen genotypisch zu charakterisieren.
Biopsie, Präparateherstellung und histopathologische Bewertung
Die histomorphologische Diagnose maligner Tumoren ist auch beim heutigen Stand der bildgebenden Verfahren und biochemischer Methoden immer noch die zuverlässigste und sicherste und zudem vergleichsweise preisgünstige diagnostische Methode. Die pathohistologische Diagnostik bei bösartigen Tumoren ist nicht nur für die Erstdiagnose unabdingbar, sondern auch im Rahmen der Nachsorge bei Auftreten von Rezidiven oder Metastasen. Die Histomorphologie dient der histologischen Klassifikation (Typing) und der Bestimmung des histologischen Malignitätsgrads (Grading) eines Tumors. Außerdem spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Tumorausbreitung und bildet die Grundlage des Staging.
Die histologische Diagnose wird anhand von Gewebeproben gestellt, die durch Punktion, Exzision, Resektion bzw. Exstirpation gewonnen werden.
Im Hinblick auf die diagnostische Aussagekraft ist die ideale Biopsie die sog. Biopsie in toto (totale Biopsie, Exzisionsbiopsie). Hierbei erfolgt die komplette Entfernung der Läsion, beispielsweise mit einer Polypektomieschlinge oder durch die totale Exzision eines Hauttumors. Nur an totalen Biopsien schließen negative Befunde die Diagnose Malignität aus, an allen anderen (Teil- oder Inzisions-)Biopsien beweisen sie nichts.
Suspekte Lymphknoten, insbesondere auch bei klinischem Verdacht auf ein Lymphom, sollten total biopsiert werden, ebenso frühe Tumorstadien (Carcinoma in situ, T1 und T2) der Mamma, der Mundhöhle und des Gastrointestinaltrakts.
Feinnadeln mit einem Außendurchmesser bis zu 1,0 mm dienen der Gewinnung von partiellen Biopsien. Hierbei liegt naturgemäß die Rate des „sampling errors“ recht hoch, besonders bei fokalen Läsionen. So liegt die feinnadelbioptische Fehlerquote bei umschriebenen Läsionen der Leber bei etwa 40 %, diffuse Gewebsprozesse werden demgegenüber in mehr als 80 % richtig erfasst. Blinde Biopsien sollten deshalb nur bei Verdacht auf diffuse Prozesse (wie Hepatitis oder Colitis ulcerosa) durchgeführt werden.
Herdförmige Läsionen machen gezielte Biopsieverfahren unter radiologischer Kontrolle (Ultraschall, Bildwandler, CT, NMR) erforderlich, um die Rate der falsch negativen Diagnosen zu reduzieren.
Eine Sonderform der Punktionsverfahren ist die Feinnadelaspirationsbiopsie, bei der entweder perkutan oder nach Thorako- oder Laparatomie mit Feinnadeln Material gewonnen wird, das dann auf Objektträgern wie Blut ausgestrichen wird (Aspirationszytologie, s. Abschn. 1.2).
Für eine Untersuchung durch den Pathologen ist es wichtig, dass repräsentatives Gewebe in möglichst ausreichender Menge gewonnen wird. Eine genaue Angabe der Entnahmelokalisation sollte neben einer kurzen Anamnese und der klinischen Verdachtsdiagnose nicht fehlen. Eine präzise klinische Fragestellung ist obligatorisch.
Mögliche Fehlerquellen, die unter Umständen Fehlbefundungen zur Folge haben können, liegen in einer zu geringen entnommenen Gewebemenge. Außerdem kann die Biopsie aus nekrotischen Herden eine Gewebszuordnung unmöglich machen. Auch unzureichende Weiterverarbeitung oder entnahmebedingte Artefakte sind weitere Möglichkeiten, die die histopathologische Diagnostik erschweren können (Tab. 1).
Tab. 1
Mögliche Ursachen von Fehlbefunden
Vorgehen
Zweck
Fehlermöglichkeiten
1. Schritt
Gewebsentnahme
Punktion, Exzision, Resektion, Exstirpation: Gewinnung einer ausreichenden Menge repräsentativen Gewebes in gutem Erhaltungszustand
• Gewebsentnahme nicht aus dem Krankheitsherd selbst, sondern aus seiner Umgebung
2. Schritt
Gewebsfixierung
Gewebekonservierung (Unterbrechung von Autolyse und Fäulnis), Vorbereitung zur weiteren Bearbeitung; zumeist Formalin (als 4 %ige wässrige Lösung von Formaldehyd)
• Unterlassen der Fixierung oder ungeeignete Fixierungslösung
• Zu lange oder zu kurze Fixierung
• Zu hohe oder zu niedrige Formalinkonzentration
• Zu wenig Fixierungsflüssigkeit (empfohlen wird 1 Teil Gewebe in 10 Teilen Flüssigkeit)
• Diffusionshindernisse (Organe mit dicker Bindegewebskapsel, muskelstarke Hohlorgane)
3. Schritt
Versand zum Pathologen
Jedes operativ entfernte Gewebe muss in seiner Gesamtheit der pathologischen Untersuchung zugeführt werden
• Verzögerter oder fehlerhafter Versand
Ordnungsgemäßer Versand
• Versandbehälter und Untersuchungsantrag nicht sorgfältig beschriftet
4. Schritt
Makroskopische Beurteilung durch den Pathologen
Beurteilung von Größe, Form, Konsistenz, Beschaffenheit und Gewicht des eingesandten Gewebes
• Entnahme ungeeigneter, nicht repräsentativer Gewebeproben
Makropräparation
Entnahme repräsentativer Gewebeproben für die histologische Untersuchung
Mikroskopische Begutachtung, Erstellen eines Befundes
In Zusammenschau mit der Makroskopie und dem klinischen Befund: Typing, Grading, Staging, R-Klassifikation
• Sorgfalt und Erfahrung des Pathologen nicht gegeben
Fixierung
Die Weiterverarbeitung des Gewebes beginnt mit der Fixierung, die der Konservierung dient und das Gewebe besser präparierbar macht. Am gebräuchlichsten ist 4 %iges Formalin, wobei im Einzelfall Speziallösungen zur optimalen Gewebsfixierung erforderlich sein können. Unfixiertes Gewebe ist für intraoperative Schnellschnitte, bestimmte enzymtechnische, biochemische und manchmal (Absprache vor der Entnahme) immunhistochemische Untersuchungen erforderlich. Zu beachten ist, dass Formalin bei der Fixierung chemisch verbraucht wird, deshalb werden ein Verhältnis von 10 Teilen der Lösung auf 1 Teil Gewebe und die Verwendung von gepuffertem Formalin empfohlen.
Makroskopische Begutachtung
Ist das Gewebsmaterial beim Pathologen angekommen, erfolgt nach ausreihender Fixierung (6–24 h) zunächst die makroskopische Begutachtung. Repräsentative Gewebeproben werden für die histologische Untersuchung entnommen. Danach erfolgt die Einbettung und Färbung, wobei auch heute noch der konventionell gefärbte Paraffinschnitt in 90–95 % der Fälle zur Diagnose führt. Die Wahl der Färbung richtet sich nach Fragestellung und Materialart. Die Hämatoxilin-Eosin-(HE-)Färbung ist Standard und wird bei Bedarf durch Spezialfärbungen ergänzt (z. B. EvG-[Elastika-van-Gieson-]Färbung, Berliner-Blau-Färbung, PAS-[„periodic acid-Schiff“-]Reaktion, Versilberung, Immunhistochemie), gegebenenfalls werden anschließend noch molekulare Verfahren wie die Sequenzierung oder die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung angeschlossen.
Intraoperative Schnellschnittuntersuchung
Ein weiteres Verfahren der histopathologischen Diagnostik stellt die intraoperative Schnellschnittuntersuchung dar. Sie kann für 3 unterschiedliche Fragestellungen eingesetzt werden: zum einen zur histologischen Diagnostik eines bisher nicht verifizierten Tumors, zur Abklärung der Tumorausbreitung im Sinne eines intraoperativen Staging und zur Sicherstellung der In-sano-Resektion. Prinzipiell sollte der Schnellschnitt nur dann eingesetzt werden, wenn sich durch die pathomorphologische Diagnose intraoperative Konsequenzen ergeben oder ein intraoperatives Staging notwendig ist. Allgemein gilt, dass bei der Schnellschnittuntersuchung morphologische Limitationen aufgrund der fehlenden Fixierung und des Einfriervorgangs des Gewebes bestehen.
Während ein Schnellschnitt zur Verifizierung eines bestimmten Tumors heute nur noch selten angewandt wird, erlaubt das Verfahren beim intraoperativen Staging die Möglichkeit, Resektabilität und damit Kurabilität zu beurteilen.
Die Schnellschnittuntersuchung beruht auf einem Gefrierschnittverfahren. Nach Schockeinfrierung des Gewebes in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis werden mittels eines Kryostatmikrotoms 5–10 μm dicke Schnitte angefertigt und sofort HE-gefärbt.
Selbst bei großer Erfahrung ist die Fehlerquote der Schnellschnittuntersuchung jedoch größer als bei der herkömmlichen Paraffinschnittdiagnostik. Die Nachteile des Schnellschnitts engen seine prinzipielle Bedeutung jedoch nicht ein, wenn insbesondere 3 wichtige Kautelen beachtet werden:
Anamnese, Lokalisation und alle klinischen (Vor-)Befunde sollten bekannt sein.
Der Befunder sollte ausreichende Erfahrung auf dem Gebiet der Schnellschnittdiagnostik besitzen.
Die Diagnose „maligne“ nur dann gestellt werden, wenn keinerlei Zweifel besteht.
Der Einsatz von Schnellschnitten in der Tumorchirurgie erfordert deshalb eine enge Kooperation des Pathologen mit dem Kliniker. Dieser Dialog kann beispielsweise in präoperativen Besprechungen (Tumorboards) bestehen, in denen das chirurgische Vorgehen unter Einbeziehung aller klinischen Befunde erörtert wird. Dem Pathologen ist dann die Anamnese oder die besondere Problematik eines Patienten bekannt, eine Tatsache, welche die hohe Treffsicherheit von über 95 % der intraoperativen Schnellschnittdiagnostik mitbegründet.
Fehlerquellen sind zumeist der Methode selbst nicht anzulastende Faktoren, wie z. B. nicht geeignetes nekrotisches Gewebe, eine zu geringe Gewebemenge oder Schwierigkeiten bei Problembefunden, insbesondere im Bereich der Knochen- und Weichteiltumoren und bei lymphoretikulären Neoplasien. Bei allen Schnellschnittuntersuchungen gilt im Zweifelsfall die Devise: lieber keine schnelle Diagnose als eine falsche. Der präoperativen Stanzbiopsie mit Fixierung sollte, wann immer möglich, der Vorzug gegeben werden, wenn es darum geht, die genaue histologische Tumorentität zu bestimmen. Dies ermöglicht die bestmögliche exakte Diagnosestellung, eine fundierte interdisziplinäre präoperative Fallbesprechung und eine optimale Planung des operativen Vorgehens.
Gelegentlich soll mit einer Schnellschnittuntersuchung auch nur die Frage beantwortet werden, ob für eine später durchzuführende Diagnose am Paraffinmaterial ausreichend Gewebe gewonnen wurde, sowohl was die Vitalität als auch die Menge des Tumorgewebes betrifft.
Zytologie
Wird bei der pathohistologischen Untersuchung der Gewebsverband in seiner Gesamtheit beurteilt, dient die zytodiagnostische Untersuchung dem Nachweis von Tumorzellen, die mit verschiedenen Methoden gewonnen werden können. Bei der Aspirationszytologie werden Ausstriche von Feinnadelpunktionen aus Mamma-, Pankreas-, Leber-, Schilddrüsen- oder Lymphknotengewebe untersucht; die Ausstriche der Exfoliativzytologie stammen aus Sekreten, Körper- bzw. Spülflüssigkeiten (Sedimentausstriche nach Zentrifugation) oder der Bürstung von Schleimhäuten. Material für die Imprintzytologie wird durch Abklatschen oder Ausstreichen von frischem, endoskopisch oder chirurgisch entnommenem Gewebe gewonnen, das primär histologisch – also im Gewebsverband – untersucht werden sollte.
Die Präparate werden durch Lufttrocknung (Blut- und Knochenmarkausstriche) oder durch Behandlung mit bestimmten Fixierungslösungen aufgearbeitet. Flüssigkeiten (Ergüsse, Urin, Sekrete, Spülflüssigkeiten) werden zentrifugiert und danach ausgestrichen. Die wichtigsten zytologischen Standardfärbungen sind die Giemsa-Färbung oder die Methode nach Pappenheim (kombinierte May-Grünwald-Giemsa-Färbung). Die Papanicolaou-Färbung hat sich bei Präparaten mit Schleimbeimengungen bewährt und findet heute fast nur noch in der gynäkologischen Zytologie Verwendung. Sputumproben oder Knochenmarkbröckel können wie Gewebe für die histologische Untersuchung eingebettet werden.
Der Nachweis von malignen Zellen stellt die wichtigste Aufgabe der Zytodiagnostik dar. Die bei der Beurteilung von bösartigen Veränderungen wichtigsten allgemeinen Kriterien werden deshalb im Folgenden kurz aufgezählt:
Maligne Zellen besitzen in der Regel einen vergrößerten Kern, der stärker angefärbt ist (Hyperchromasie).
Starke Größenunterschiede der einzelnen Kerne (Anisokaryose) und eine Verdickung der Kernmembran sind ebenfalls Kennzeichen von Malignität.
Die Nukleolen innerhalb der deformierten Zellkerne sind vermehrt und weichen hinsichtlich ihres Aussehens und Anfärbbarkeit (starke Basophilie) vom Normalen ab.
Atypische Mitosen können zu Mehrkernigkeit führen.
Da die Zellkerne im Gegensatz zum Zytoplasma stärker an Größe zunehmen, ist die Kern-Plasma-Relation in malignen Zellen zugunsten des Kerns verschoben.
Bei starken Größenunterschieden (Anisozytose) zeigt das Zytoplasma von Tumorzellen eine starke Basophilie und unter Umständen atypische Plasmastrukturen.
Lassen sich die oben beschriebenen Veränderungen in kleineren Zellverbänden (sog. Clustern) beobachten und findet sich zusätzlich eine irreguläre Zellanordnung mit nicht voneinander abgrenzbaren Zellgrenzen und überlappenden Zellen, dann gelten diese Befunde in ihrer Zusammenschau als sehr stark hinweisend auf Malignität.
Zytodiagnostische Untersuchungen werden am häufigsten an der Portio vaginalis im Rahmen der sog. Vorsorgezytologie durchgeführt und dienen als Screeningtool für Frauen ab dem 20. Lebensjahr. Die Bewertung der zytologischen Befunde erfolgt seit dem 1. Juli 2014 nach der Münchner Nomenklatur III, die den Pap-Befund in 6 Klassen (0–V) einteilt (Tab. 2).
Tab. 2
Münchner Nomenklatur III zur Bewertung der zytologischen Früherkennungsuntersuchung
Ggf. zytologische Kontrolle wegen auffälliger Anamnese (zytologischer/histologischer/kolposkopischer/klinischer Befund)
II
Befunde mit eingeschränkt protektivem Wert
II-p
Plattenepithelzellen mit geringgradigen Kernveränderungen als bei CIN 1, auch mit koilozytärem Zytoplasma/Parakeratose
Ggf. zytologische Kontrolle unter Berücksichtigung von Anamnese und klinischem Befund (evtl. nach Entzündungsbehandlung und/oder hormoneller Aufhellung; in besonderen Fällen additive Methoden und/oder Kolposkopie)
II-g
Zervikale Drüsenzellen mit Anomalien, die über das Spektrum reaktiver Veränderungen hinausreichen
Ggf. zytologische Kontrolle in Abhängigkeit von Anamnese und klinischem Befund (evtl. nach Entzündungsbehandlung; in besonderen Fällen additive Methoden und/oder Kolposkopie)
II-e
Endometriumzellen bei Frauen >40. Lebensjahr in der zweiten Zyklushälfte
Klinische Kontrolle unter Berücksichtigung von Anamnese und klinischem Befund
III
Unklare bzw. zweifelhafte Befunde
III-p
CIN 2/3/Plattenepithelkarzinom nicht auszuschließen
Weiterführende klinische Diagnostik, ggf. mit histologischer Klärung
III-x
Zweifelhafte Drüsenzellen ungewissen Ursprungs
Weiterführende Diagnostik (z. B. fraktionierte Abrasio; ggf. additive Methoden/Differenzialkolposkopie)
IIID
Dysplasiebefunde mit größerer Regressionsneigung
IIID1
Zellbild einer leichten Dysplasie analog CIN 1
Zytologische Kontrolle in 6 Monaten, bei Persistenz >1 Jahr: ggf. additive Methoden/Differenzialkolposkopie
IIID2
Zellbild einer mäßigen Dysplasie analog CIN 2
Zytologische Kontrolle in 3 Monaten, bei Persistenz >6 Monate: Differenzialkolposkopie, ggf. additive Methoden
IV
Unmittelbare Vorstadien des Zervixkarzinoms
Differenzialkolposkopie und Therapie
IVa-p
Zellbild einer schweren Dysplasie/eines Carcinoma in situ analog CIN 3
IVa-g
Zellbild eines Adenocarcinoma in situ
IVb-p
Zellbild einer CIN 3, Invasion nicht auszuschließen
IVb-g
Zellbild eines Adenocarcinoma in situ, Invasion nicht auszuschließen
V
Malignome
Weiterführende Diagnostik mit Histologie und Therapie
V-p
Plattenepithelkarzinom
V-g
Endozervikales Adenokarzinom
V-e
Endometriales Adenokarzinom
V-x
Andere Malignome auch unklaren Ursprungs
Durch die diagnostischeZytologie, die bei manifesten klinischen Erscheinungen zum Einsatz kommt und nicht der Vorsorge dient, soll in erster Linie geklärt werden, ob benigne oder maligne Zellen nachweisbar sind. Möglichst selten sollte die Beurteilung „Verdächtig, aber nicht beweisend für Malignität“ verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist besonders die Feinnadelpunktion von Mamma, Prostata, Schilddrüse und Pankreas sowie die Bronchialzytologie zu nennen. Die Punktion von sog. kalten Knoten der Schilddrüse dient der Abgrenzung von entzündlichen zu tumorösen Veränderungen und ist ein relativ komplikationsarmes Verfahren mit einer hohen diagnostischen Ausbeute. Allerdings gilt es hierbei zu beachten, dass teilweise nicht die Dignität geklärt werden, sondern lediglich eine Empfehlung für oder gegen eine weitere histologische Abklärung ausgesprochen werden kann. Das Resultat „benigne Zellen“ in der Zytologie sollte auch immer im Hinblick auf Fehlerquellen hinsichtlich des Punktionsverfahrens beleuchtet werden, z. B. Verfehlen der Läsion. Falls eine konkrete Diagnose nicht erbracht werden kann, muss eine weitere Abklärung erfolgen.
Insgesamt gilt für die Zytologie der gleiche Grundsatz wie bei der histologischen Untersuchung, eine enge Zusammenarbeit zwischen Kliniker und Pathologen ist unerlässlich, um eine präzise diagnostische Aussage machen zu können.
Die Zytologie ist keine „Ersatzhistologie“, eine parallele Anwendung beider Verfahren bildet die Basis einer sinnvollen Diagnostik. Die Antwort auf die Frage „Histologie oder Zytologie?“ sollte deshalb lauten „Zytologie und Histologie!“, da die zytologische Untersuchung zwangsläufig immer eine geringere Zuverlässigkeit aufweist. So kann beispielsweise allein zytologisch fast nie zwischen In-situ- oder fortgeschrittenen Karzinomen unterschieden werden; eine sinnvolle Therapieplanung würde deshalb die histologische Untersuchung erfordern.
Typing, Grading und Staging
Klassifikation (Typing)
Wie einleitend erwähnt, ist es die Hauptaufgabe des Pathologen, den Tumor hinsichtlich des histologischen Tumortyps (Typing) und des Malignitätsgrades (Grading) zu charakterisieren. Der Tumortyp und sein Malignitätsgrad geben dem Kliniker nicht nur Hinweise auf die zu wählende Therapie, sondern ermöglichen Aussagen über die Prognose.
Die histologische Artdiagnose liefert die erste Unterteilung der verschiedenen möglichen Tumorarten eines Organs. Dabei wird das Aussehen des Tumors mit dem Normalgewebe verglichen, um Ähnlichkeiten oder Unterschiede vom Zelltyp und in der Struktur zu erkennen.
Nach dem Ausgangsgewebe kann man zwischen Karzinomen (epitheliale maligne Tumoren), Sarkomen (mesenchymale maligne Tumoren), malignen Lymphomen (maligne Geschwülste des lymphoretikulären Systems) sowie Leukämien differenzieren. Hinzu kommen seltene Tumorarten wie die dysontogenetischen Tumoren (Teratome, Hamartome, Choristome, embryonale Restgewebstumoren und embryonale Tumoren [Nephroblastome, Neuroblastome, Medulloblastome, Retinoblastome, embryonale Rhabdomyosarkome, Hepatoblastome]).
Der Vergleich des Tumors mit dem Normalgewebe führt zur Bezeichnung Plattenepithel-, Adeno- oder Übergangszellkarzinom bei den malignen epithelialen Tumoren, die mehr als 90 % aller Malignome ausmachen. Bei den Sarkomen spricht man – ebenfalls vom Ausgangsgewebe ausgehend – von Osteo-, Chondro- und Fibrosarkomen.
Es können sich Probleme ergeben, wenn ein Tumor mehrere verschiedene Differenzierungen aufweist oder sein histogenetischer Ursprung nicht mehr eindeutig erkennbar ist; in diesen Fällen erfolgt die Klassifikation nach unterschiedlichen Regeln:
1.
nach der überwiegenden, vorherrschenden Differenzierung,
2.
unbeschadet der Quantität nach den am höchsten differenzierten Strukturen oder
3.
unbeachtet der Quantität nach den am wenigsten differenzierten (bösartigsten) Strukturen.
Eine generelle Regel kann jedoch nicht angegeben werden. Deshalb ist von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für jeden Organtumor eine histologische Typisierung mit klaren Definitionen und detaillierten Klassifikationsprinzipien festgelegt worden. Diese WHO-Klassifikationen definieren die Tumorentitäten in den verschiedenen Organsystemen und illustrieren sie anhand von farbigen (Muster-)Abbildungen. Es wird im Interesse der internationalen Vergleichbarkeit allgemein empfohlen, einen Tumor stets nach der aktuellen WHO-Klassifikation zu diagnostizieren.
Werden die dort angegebenen Klassifikationsprinzipien streng befolgt, besteht ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit einer – ggf. auch von mehreren Pathologen gestellten – Diagnose. Diskrepanzen ergeben sich zumeist aus der Tumorheterogenität. Da der Tumor örtlich wechselnde histologische Bilder zeigen kann, besteht die Gefahr, dass in einer kleinen Gewebeprobe nicht alle Differenzierungen erfasst sind. Die Tumorheterogenität kann bei verschiedenen Tumoren sehr unterschiedlich ausgeprägt sein.
Das Magenkarzinom und das Pankreaskarzinom gelten als Prototypen von genetisch besonders heterogenen Tumoren, was sicherlich ein Teilaspekt der schlechten Prognose dieser Tumoren darstellt.
Grading
Da sich Tumoren der gleichen histologischen Klassifikation biologisch sehr unterschiedlich verhalten können, müssen histologische Parameter berücksichtigt werden, die auf eine geringe Differenzierung und damit erhöhte Aggressivität hinweisen. Das Grading als Festlegung des Differenzierungsgrads eines Tumors gibt dem Kliniker weitere Hinweise auf die Prognose des Patienten und die zu wählende Therapie.
Das Grading wird aufgrund histologischer und zytologischer Kriterien durchgeführt. Dabei bedient man sich neben dem Vergleich des Tumors mit dem Ausgangsgewebe bestimmter semiquantitativer Methoden. So gehen die Zahl der Mitosen pro Gesichtsfeld, die Ausprägung der Drüsenbildung (Mamma-, kolorektales Karzinom) und die Zellkerngröße und -anfärbbarkeit mit in die Bestimmung des Differenzierungsgrads ein.
Ist beispielsweise bei einem Adenokarzinom des Kolorektums die Ähnlichkeit mit der normalen Schleimhaut bzw. drüsige Differenzierung sehr ausgeprägt, liegt ein gut differenziertes Karzinom vor (G1); wächst das Tumorgewebe jedoch nur noch wenig drüsig und eher solide, wird von einem schlechten Differenzierungsgrad (G3) gesprochen. Bei intermediären Tumoren diagnostiziert man mäßige oder mittlere Differenzierung (G2). Mit G4 werden völlig undifferenzierte Tumoren bezeichnet.
Die WHO-Klassifikation für kolorektale Karzinome untermauert diesen Grundsatz noch numerisch und stuft Karzinome mit einer Drüsenbildung von 95 % als G1, Karzinome mit Drüsenbildung von 50–94 % als G2 und Karzinome mit Drüsenbildung von 0–49 % als G3 ein.
Bei manchen Organtumoren, besonders bei solchen des Gastrointestinaltrakts, werden G1 und G2 (höhere und mittlere Differenzierung) als niedriger Malignitätsgrad („low grade“) und G3 und G4 (schlechte bis keine Differenzierung) als hoher Malignitätsgrad („high grade“) zusammengefasst (Abb. 1). Auch gibt es Ansätze, das rein morphologische Grading durch moderne molekulare Untersuchungen zu ergänzen. So wird empfohlen, das Adenokarzinom des Kolorektums nur dann als „high grade/hoher Malignitätsgrad“ einzustufen, wenn neben der entsprechenden Morphologie der Tumor molekularpathologisch keine Mikrosatelliteninstabilität aufweist. Hintergrund ist die Erkenntnis, dass mikrosatelliteninstabile Tumoren selbst bei schlechter Differenzierung eine günstigere Prognose aufweisen als mikrosatellitenstabile.
Abb. 1
Prinzipien des (molekularen) Grading: „Wie ähnlich sieht der Tumor dem Ausgangsgewebe aus“ am Beispiel eines Adenokarzinoms. Für manche Entitäten, wie hier für das kolorektale Adenokarzinom dargestellt, wird empfohlen, das morphologische Grading durch ein molekulares zu ergänzen. So zeigen MMRD kolorektale Karzinome trotz eines ungünstigen Grading (G3, G4) meist eine gute Prognose und werden deshalb als „low grade“ eingestuft. MMRP „mismatch repair proficient“, MMRD „mismatch repair deficient“, MSI „Mikrosatelliten“
×
Insgesamt gilt der Grundsatz, dass je schlechter der Differenzierungsgrad (von G1 nach G4) ist, desto höher ist der Malignitätsgrad. Je höher der Malignitätsgrad ist, desto größer sind die Aggressivität, die Wachstumsgeschwindigkeit und die Metastasierungshäufigkeit. Für viele Organtumoren gilt deshalb, dass G3- und G4-Tumoren zum Zeitpunkt der Diagnose meist weiter fortgeschritten sind als G1- und G2-Tumoren.
Wie bei der histologischen Klassifizierung (Typing) gibt es auch für das Grading organspezifische Unterschiede, die einer allgemeingültigen und vergleichbaren Anwendung bedürfen. Die UICC (Union Internationale Contre le Cancer) hat hierfür auf der Basis der oben genannten Gradingstufen (G1–G4) für jeden Organtumor Vorschläge herausgegeben, denen unbedingt gefolgt werden sollte.
Staging
Um die individuelle Situation eines Tumorpatienten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose oder Therapiebeginn exakt zu beschreiben, ist neben der Tumorart und -differenzierung vor allem das Ausmaß der anatomischen Ausbreitung von entscheidender Bedeutung.
Die anatomische Tumorausbreitung wird mit dem sog. Staging angegeben; in Kombination mit Typing und Grading bildet es die Grundlage einer histologie- und stadiengerechten Krebstherapie. Man unterscheidet je nach dem Zeitpunkt, an dem das Staging durchgeführt wird, das präoperative Staging, das Indikation und Wahl einer Therapie entscheidend mitbestimmt. Kommt es zu einem chirurgischen Eingriff, wird ein intraoperatives Staging durchgeführt, wobei mit Schnellschnitten die Tumorausdehnung abgeklärt werden kann.
Schließlich wird ein postoperatives Staging durchgeführt, das die pathohistologische Aufarbeitung des resezierten Tumorgewebes umfasst. Das postoperative Staging bestimmt die Indikation zu weiteren therapeutischen Maßnahmen (adjuvante Therapieformen bei kurativer Resektion oder additive Therapie bei R1- oder R2-Resektion) und beeinflusst die durchzuführende Tumornachsorge. Des Weiteren kann die Prognose des einzelnen Patienten durch die Bestimmung der anatomischen Ausbreitung abgeschätzt werden. Der Vergleich der Behandlungsergebnisse eines größeren Patientengutes, bei dem ein exaktes Tumortyping, -grading und -staging durchgeführt wurde, bildet darüber hinaus die wichtigste Grundlage prognostischer Studien.
In internationaler Übereinkunft, die besonders auf die Bemühungen der Union Internationale Contre le Cancer (UICC) zurückgeht, wird die anatomische Ausbreitung einer Tumorerkrankung mittels folgender 3 Kriterien bestimmt:
1.
Kontinuierliche lokale Tumorausbreitung im Entstehungsort: T („tumor“):
Größe und Ausdehnung (welche Organteile sind betroffen, Organgrenzen überschritten, angrenzende Strukturen infiltriert?).
2.
Regionäre lymphogene Metastasierung: N („nodes“):
Erfassung von Metastasen in regionären Lymphknoten, d. h. in diejenigen Lymphknoten, die dem Organ oder Organabschnitt nächstgelegen sind und bei einer Radikaloperation mit entfernt werden können. Weiter entfernt gelegene Lymphknoten werden als Fernmetastasen bezeichnet.
3.
Fernmetastasen: M („metastases“):
Hierzu zählen Metastasen jenseits der regionalen Lymphknoten, Metastasen in serösen Höhlen (Peritoneal- und Pleurakarzinose) und hämatogene Metastasen.
Stadiengruppierung
Erfolgte für einen resezierten Tumor ein Staging nach dem TNM/pTNM-System, kann nun versucht werden, TNM/pTNM-Kategorien mit ähnlicher Prognose zusammenzufassen. Diese Stadien, die aus den zahlreichen pTNM-Kombinationsmöglichkeiten entstehen, werden mit römischen Ziffern bezeichnet und teilweise mit den Zusatzbezeichnungen a und b in Unterstadien eingeteilt. Bei einigen Organtumoren werden zusätzliche Parameter zur Stadieneinteilung herangezogen, so der Differenzierungsgrad bei Knochen-, Weichteil-, Prostata- und Gehirntumoren. Alter und histologischer Tumortyp werden bei der Stadieneinteilung des Schilddrüsenkarzinoms berücksichtigt. Lymphome, wie der Morbus Hodgkin, werden nach Organbefall eingeteilt, das Vorhandensein bestimmter klinischer Symptome zusätzlich bewertet.
Allgemein wird das Carcinoma in situ als Stadium 0 bezeichnet. Werden Fernmetastasen gefunden, spricht man vom Tumorstadium IV.
Eine Stadieneinteilung ohne Angaben zur pT- und/oder pN-Kategorie ist möglich, gilt aber nur für nicht resezierte Tumoren.
Zur Kennzeichnung von speziellen Fällen in der TNM-(pTNM-)Klassifikation sollten zusätzliche Symbole benutzt werden. „a“ wird dann dem TNM vorangestellt, wenn die Befunde anhand einer Autopsie erhoben wurden. „(m)TNM“ bedeutet, dass multiple Primärtumoren in einem anatomischen Bezirk gefunden wurden. Das „y“ wird gewählt, um anzuzeigen, dass die Klassifikation während oder nach einer initialen multimodalen Therapie (Radio- und/oder Chemotherapie) erfolgt ist. Schließlich wird die TNM-Klassifikation durch ein „r“ ergänzt, wenn nach einem krankheitsfreien Intervall ein Rezidivtumor auftritt. Diese beiden Buchstaben werden der Klassifikation als Präfix vorausgestellt.
Die Tumorausbreitung kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten und mit unterschiedlichen Methoden bestimmt werden. So unterscheidet man eine klinische Klassifikation (TNM), die auf den Befunden beruht, die vor einer Behandlung erhoben wurden, aufgrund der körperlichen Untersuchung, von bildgebenden Verfahren, Biopsien oder endoskopischen Untersuchungen. Zur Kennzeichnung der verwendeten diagnostischen Methode und damit der Diagnosesicherheit bzw. Zuverlässigkeit kann man den TNM-Kategorien den C-Faktor hinzusetzen („certainty“). Mit C1 werden diagnostische Standardmethoden bezeichnet (Inspektion, Palpation, Standardröntgenaufnahmen). C2 wird verwendet, wenn speziellere diagnostische Methoden verwendet wurden (Sonografie, CT, NMR, Angiografie, Biopsie, Zytologie). Mit C3 werden Befunde klassifiziert, die anhand einer chirurgischen Exploration mit Biopsie erhoben wurden. Schließlich versieht man diagnostische Ergebnisse mit C4, wenn sie aufgrund der pathohistologischen Untersuchung am Tumorresektat nach definitiver chirurgischer Behandlung erhoben wurden.
Die pathologische Klassifikation (pTNM) ergänzt die vor der Behandlung erhobenen Befunde durch die exakte Bestimmung von Tumorausbreitung am Tumorresektat. Besondere Bedeutung kommt hierbei der genauen Untersuchung von Lymphknoten zu. Alle Lymphknoten – nicht nur die makroskopisch auffälligen – sollten histologisch untersucht werden und dabei auf Topografie und anatomische Lymphdrainagewege besonderes Augenmerk gerichtet werden. Bestimmte standardisierte Vorgehensweisen bei der Aufsuche und Begutachtung von Lymphknoten finden besondere Beachtung, so sollten bei Kolonkarzinomresektaten mindestens 12, bei Magenkarzinomen mindestens 16 Lymphknoten präpariert und histologisch untersucht werden.
R- und CRM-Klassifikation
Entscheidend ist weiterhin die Begutachtung der Resektionsränder und -flächen. Für die Prognose ist es von größter Wichtigkeit, ob der Tumor komplett entfernt wurde. Die Kombination der histologischen Aufarbeitung der Resektionsränder mit dem makroskopischen Operationsbefund erlaubt die Aussage, ob Resttumorgewebe im Organismus zurückgelassen werden musste. Zusätzlich muss der Kliniker dem Pathologen mitteilen, ob weitere Metastasen in entfernteren Organen vorliegen. Die Beurteilung erfolgt dann in Zusammenschau der Befunde mit der sog. R-Klassifikation (Residualtumor): R0 bedeutet hierbei, dass kein Residualtumor im Organismus belassen wurde und kein Anhalt auf Metastasen besteht. Eine exaktere Bezeichnung wäre kein Resttumorgewebe diagnostizierbar unter Zuhilfenahme aller diagnostisch verfügbaren Methoden. Die Therapie ist somit als kurativ zu bezeichnen.
R1 wird dann angegeben, wenn sich mikroskopisch Resttumorgewebe, beispielsweise an den Resektionsrändern, nachweisen lässt. Konnte schon makroskopisch Resttumorgewebe gesehen werden oder berichtet der Kliniker beispielsweise von (nicht resezierbaren) Lebermetastasen, erfolgt die Einordnung als R2. Bei Leukämien und Lymphomen ist die Bezeichnung R0 gleichzusetzen mit „kompletter Remission“. R1 bedeutet hier, dass zwar klinisch eine komplette Remission vorliegt, aber bioptische Befunde unerwarteten Resttumor zeigen. R2 umfasst alle anderen Situationen wie partielle Remission, unveränderter Status oder Progression. Bei manchen Entitäten, wie dem Rektum- und Pankreaskarzinom wird der R-Status noch durch die CRM-(„circumferential resection margin“-)Angabe komplettiert. Dieser Wert beschreibt im metrischen Maß den Abstand des Tumors zum Resektionsrand (RR). Im Allgemeinen wird der CRM als positiv gewertet (CRM+), wenn Tumoranteile ≤1 mm an den RR heranreichen. Dabei ist irrelevant, wie die Tumorzellen dorthin gelangt sind, es werden sowohl Satellitenknötchen, Lymphknotenmetastasen, Tumorgefäßeinbrüche und ein Wachstum per continuitatem berücksichtigt (Abb. 2).
Abb. 2
Adenokarzinom des Rektums. Der Abstand des Tumors zum Absetzungsrand sollte unter dem Mikroskop gemessen werden. Ist dieser Abstand ≤1 mm, ist der CRM positiv (CRM+), dabei ist es unbedeutend, wie die Tumorzellen dorthin gelangt sind. Reicht der Tumor bis unmittelbar an den Absetzungsrand, liegt zusätzlich eine prognostisch sehr ungünstige R1-Situation vor. CRM „circumferential resection margin“
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Immunhistochemie
Neben der lichtmikroskopischen Diagnose an Gewebeschnitten, die mit den sog. Standardfärbungen bearbeitet wurden, stehen dem Pathologen weitere Hilfsmittel zur Verfügung, die sich in den letzten 30 Jahren nahezu explosionsartig weiterentwickelt haben. Insbesondere die Immunhistochemie, die im Gegensatz zu vielen neuen molekularbiologischen Untersuchungsmethoden ein morphologisches Verfahren ist, hilft dem Pathologen bei Aussagen über Histogenese, Differenzierung und möglicher endokriner Funktion eines Tumors. Auch werden immunhistochemische Biomarker häufiger, die Aussagen über das potenzielle Ansprechen gegen eine entsprechende Therapie erlauben.
Das Wesen der Immunhistologie liegt in der Möglichkeit, bestimmte Antigene (zumeist Proteine) sensitiv in situ, d. h. innerhalb des Gewebsverbands, sichtbar zu machen. Damit ist nicht nur eine direkte intrazelluläre Lokalisation bestimmter Proteine lichtmikroskopisch möglich, sondern auch – zumindest bei einigen Antikörpern – eine semiquantitative Abschätzung der Konzentration des nachgewiesenen Antigens.
Zell- und Gewebsproteine mit antigenem Charakter können durch die Bindung des für sie spezifischen Antikörpers unter Ausbildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes sichtbar gemacht werden. Dessen Visualisierung erfolgt durch die Hinzugabe einer Markersubstanz, bei der es sich um fluoreszierende Stoffe (beispielsweise Fluoreszeinisothiozyanat [FITC]), um Enzyme (Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase) oder auch um radioaktive Substanzen handeln kann. Letzteres ist heute aber kaum noch in Verwendung.
Verwendet man Enzyme, werden zusätzlich verschiedene Substrate benötigt, die durch die Reaktion mit dem Enzym eine Farbänderung erfahren (sog. Chromogene; als Beispiel: Diaminobenzidin [DAB]). Heute steht eine Vielzahl kommerzieller poly- und monoklonaler Antikörper zur Verfügung. Unter ihnen findet sich jedoch nach wie vor kein Marker, der sicher zwischen einer benignen und malignen Zelle zu differenzieren vermag. Es gibt aber Antikörper, die dem Pathologen Entscheidungshilfen geben können, beispielsweise ob der vorliegende Tumor epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs ist, da sie jeweils nur in der einen oder anderen Tumorgruppe nachweisbar sind, was Tab. 3 veranschaulichen soll.
Zudem sollte die Immunhistologie diagnostisch nur von Morphologen angewandt werden, die sehr versiert in der konventionellen Diagnostik sind. Sonst besteht die Gefahr, dass Fehldiagnosen aufgrund falsch positiver oder falsch negativer immunhistologischer Befunde gestellt werden. Ein guter Pathologe macht viele immunhistologische Untersuchungen überflüssig, während eine gute Immunhistologie keinen schlechten Pathologen ersetzt.
In jedem Labor, das diese Methode verwendet, müssen regelmäßige laborinterne Untersuchungen mit positiven und negativen Kontrollen durchgeführt werden. Es gibt Ansätze, das Verfahren und verwendete Antikörper zu standardisieren, und die meisten pathologischen Institute nehmen mittlerweile an Ringversuchen der QuIP (Qualitätssicherungs-Initiative Pathologie) teil.
Im Folgenden werden die verschiedenen Gewebe und ihre wichtigsten Markerantigene kurz beschrieben.
Spezifische Marker des Epithelgewebes
Epitheliale Differenzierungsmerkmale (Ausbildung eines kontinuierlichen Zellverbands, Desmosomen) sind in gering differenzierten Tumoren nur noch sporadisch vorhanden und fehlen in undifferenzierten (anaplastischen) völlig. Bestimmte Strukturproteine werden parallel zu epithelialen Differenzierungsvorgängen exprimiert und können, wenn sie durch die Immunhistochemie nachgewiesen werden, die epitheliale Abkunft des Gewebes sichern.
Diese, zum Zytoskelett gehörenden Intermediärfilamente kommen praktisch ubiquitär vor und werden in 19 verschiedene Proteine eingeteilt, die sich hinsichtlich ihrer gelelektrophoretischen Eigenschaften unterscheiden. Obwohl nur gering strukturell unterschiedlich, können 2 getrennte Untergruppen gefunden werden: Die Zytokeratine 1–8 gehören der basischen Subgruppe an, die Zytokeratine 9–19 der sauren. In jeder Zelle wird ein saures und ein basisches Zytokeratin als „Pärchen“ exprimiert.
Die strukturelle Verschiedenheit innerhalb der Zytokeratinfamilie ist recht gering. Es gibt deshalb Antikörper, die alle Zytokeratinarten erkennen, weshalb im Folgenden daher von Gesamtzytokeratin gesprochen wird.
Gesamtzytokeratine werden in nahezu allen Epithelien exprimiert, ob verhornend oder unverhornt, auch in Epithelgewebe mesenchymaler Herkunft.
Alle Zellen nicht epithelialen Ursprungs sind Zytokeratin-negativ, dieses Expressionsmuster lässt die Zytokeratine zu idealen Epithelmarkern werden. Entdifferenzieren sich Epithelzellen zu Tumorzellen, bleiben die Zytokeratine erhalten und beweisen ihre Stabilität und Konservativität dadurch, dass selbst in undifferenzierten Karzinomen oder in deren Lymphknotenmetastasen ein (Gesamt-)Zytokeratinnachweis gelingt. Maligne Mesotheliome sind ebenso wie Thymome mittels Antikörper gegen Gesamtzytokeratin anfärbbar.
Die Koexpression von Zytokeratin und Vimentin (dem mesenchymalen Intermediärfilamenttyp) ist bei Schilddrüsentumoren und auch mesodermalen Tumoren wie Nierenzellkarzinomen, Endometriumkarzinomen und einigen Sarkomen beschrieben worden. Eine mögliche Erklärung hierfür bietet die Beobachtung, dass während der Organogenese ebenfalls beide Intermediärfilamentarten exprimiert werden.
Neuroendokrine Tumoren koexprimieren neben Zytokeratinen auch Neurofilamente, am bekanntesten sind hier die Merkelzelltumoren der Haut.
Merkelzellen exprimieren ein neueres Zytokeratin, das die Nummer 20 trägt (CK20) und ein eingeschränktes Expressionsspektrum in Normalepithelien zeigt. Es ist das vorherrschende Zytokeratin im Dünn- und Dickdarmepithel. Da die Expression von CK20 nicht nur in Tumoren, sondern auch in Metastasen und bei Tumoren schlechter Differenzierung und untypischem histologischen Muster erhalten bleibt, kommt ihm eine gewisse differenzialdiagnostische Bedeutung zu.
Epitheliales Membranantigen (EMA)
Die Antigene, an die der EMA-Antikörper bindet, sind bis heute noch nicht sicher identifiziert, vermutet werden Glykoproteine der apikalen Plasmamembran des sezernierenden Epithels der weiblichen Brustdrüse. EMA-Antikörper reagieren mit einer Vielzahl von Epithelzelltypen, besonders mit Zylinderepithelien. Dementsprechend zeigen Mamma- und andere Adenokarzinome die stärkste Anfärbbarkeit. Nicht epitheliale Tumoren sind EMA-negativ, eine Ausnahme bilden Plasmozytome und verschiedene Lymphomunterarten.
Carcinoembryonales Antigen (CEA)
Das carcinoembryonale Antigen (CEA) wurde als erstes onkofetales Antigen 1965 in kolorektalen Karzinomen und im fetalen Darm entdeckt. Es handelt sich um ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 160–200 kDa und ausgesprochen variablen Kohlenhydratketten, die es zu einem heterogenen Molekül werden lassen. Molekularbiologische Methoden haben kürzlich 5 Untergruppen der „CEA-like proteins“ definiert, die sich hinsichtlich ihres Molekulargewichts und dem Glykolysierungsgrad unterscheiden. Diese Heterogenität der Epitope hat zu einer Vielzahl kommerzieller Antikörper geführt, die aufgrund von Präabsorptionsverfahren mit den unterschiedlichen CEA-Subklassen reagieren. Immunoreaktives Gewebe ist im Bronchus (Bronchialepithelien, Alveolarepithelien), den Speicheldrüsen, im gesamten Magen-Darm-Trakt, dem Pankreas- und Gallengang, der Prostata, der Endozervix, im Urothel und den C-Zellen der Schilddrüse gefunden worden.
In Adenokarzinomen des Gastrointestinaltrakts, der Mamma, der Lunge, des Ovars und der Endozervix kann CEA in 50–90 % der Fälle nachgewiesen werden.
Die intrazelluläre CEA-Immunoreaktivität findet sich in hochdifferenzierten Magen-, Kolon- und Pankreaskarzinomen an der apikalen, luminalen Zelloberfläche. Inhomogene, von Zelle zu Zelle unterschiedliche CEA-Anfärbbarkeit wurde bei geringer differenzierten Karzinomen des Verdauungstrakts gefunden, wobei die quantitative Immunoreaktivität parallel zur Differenzierung abnimmt.
Zusammen mit anderen epithelialen Markern wie EMA und den Zytokeratinen hat CEA differenzialdiagnostische Bedeutung, nicht nur in der Identifikation von Karzinomen, sondern auch z. B. in der Abgrenzung von Bronchialkarzinomen gegenüber Mesotheliomen. Beide Tumorarten zeigen Keratinpositivität, Mesotheliomen fehlt aber EMA und zu einem hohen Prozentsatz sind sie CEA-negativ. Besondere Bedeutung kommt den epithelialen Markern in der Diagnostik von Metastasen in Lymphknoten und anderen Organen zu, um den Kreis der möglicherweise infrage kommenden Primärtumoren einzuengen.
Spezifische Marker des mesenchymalen Gewebes
In der sehr heterogenen Gruppe der mesenchymalen Tumoren spielen die intrazellulären Filamente ebenfalls eine wertvolle diagnostische Rolle. In Anlehnung an normales, mesenchymales Gewebe unterscheidet man 2 große Gruppen der Vimentin- und Desmin-exprimierenden Tumoren. Nicht muskuläre mesenchymale Zellen sind Vimentin-positiv und leiten sich vom Mesoderm ab (Fibroblasten, Fibrozyten, Osteoblasten, Osteozyten). Schwann-Zellen sollen hier als Ausnahme genannt werden, da sie Vimentin exprimieren, sich aber vom Neuroektoderm ableiten.
Myogene Zellen sind Desmin-positiv. Mit Ausnahme der Gefäßmuskulatur sind Skelett-, Herz- und Eingeweidemuskulatur Desmin-positiv.
Desmin-positive Tumoren umfassen Rhabdomyome und Rhabdomyosarkome sowie Leiomyome und Leiomyosarkome, wobei eine differenzialdiagnostische Abgrenzung der beiden genannten malignen Formen durch Desmin nicht möglich ist. Bei undifferenzierten Rhabdomyosarkomen kann allerdings der Desmingehalt so gering sein, dass er nach Formalinfixierung nicht mehr nachweisbar ist. Außerdem sind bei dieser Tumorentität eine Koexpression von Desmin und Vimentin beschrieben worden, was auch in der normalen Muskelembryogenese beobachtet wurde.
Vimentin-positive Tumoren sind in der Regel mesodermalen Ursprungs und umfassen die Gruppe der nicht muskulären Weichteilsarkome und Liposarkome. Ausnahmen bilden hier das synoviale und epithelioide Sarkom. Knochentumoren zeigen ebenfalls eine Vimentinanfärbbarkeit. Heterogene Expression wurde bei Lymphomen und Non-Hodgkin-Lymphomen sowie Leukämien gesehen. Vimentin-positiv sind darüber hinaus maligne Melanome und Ewing-Sarkome.
Die Gruppe der Vimentin-positiven Tumoren ist also relativ groß. Um sie weiter zu unterteilen, müssen zusätzliche Marker angewendet werden, wobei hier das S-100-Protein erwähnt werden soll. Neurinome, Schwannome und Granulosazelltumoren sind dann homogen S-100-positiv.
Der Vollständigkeit halber sei hier auf diejenigen Tumoren hingewiesen, die mesenchymalen Ursprungs sind und Keratinpositivität aufweisen. Es handelt sich um synoviale und epithelioide Sarkome sowie um Chordome. Bei Letzteren wurde zusätzlich die Koexpression von Vimentin und Keratin beschrieben. Dieses Verhalten findet seine entwicklungsgeschichtliche Erklärung durch die Entwicklung von mesenchymalen Zellen in epitheliale Zellen.
Alpha-Fetoprotein
Das Alpha-Fetoprotein (AFP) ist ein Sialinsäure-haltiges, aus 590 Aminosäuren bestehendes Protein der alpha1-Globulinfraktion des Serums. Seine Funktion ist weitgehend ungeklärt, die Strukturähnlichkeit mit Albumin macht eine Transportfunktion im Blut wahrscheinlich, Bindung an Bilirubine und Östrogene untermauern diese Hypothese. Es wurde erstmalig im Serum von Feten entdeckt, wo seine Konzentration bis zum Geburtstermin kontinuierlich abnimmt und normalerweise im weiteren Leben unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Erhöhte Serumkonzentrationen finden sich bei Patienten mit hepatozellulären Karzinomen (HCC) (über 400 ng/ml) und zu einem geringeren Teil bei solchen mit Keimzelltumoren. Ebenfalls – wenn auch in geringerem Ausmaß – finden sich erhöhte Werte bei hepatischen Regenerationsvorgängen, beispielsweise nach Leberteilresektionen oder nach Exposition mit Hepatotoxinen. Molekulargenetisch konnte nachgewiesen werden, dass die Transkription des AFP-Gens durch Leberzellschaden positiv reguliert wird.
Unter den Keimzelltumoren, die AFP synthetisieren und sezernieren, sind – neben Dottersacktumoren – Keimzelltumoren mit Dottersacktumoranteilen und Teratome AFP-positiv. Die Erhöhung der AFP-Konzentration im Serum hat differenzialdiagnostische Bedeutung, sie schließt ein reines Seminom aus.
Obwohl die AFP-Konzentration im Serum von über 90 % der HCC-Patienten erhöht ist, findet sich in nur ca. 30–50 % aller Tumoren eine Gewebspositivität, dabei vor allem bei hepatozellulären Karzinomen der Differenzierung Edmondson 2 und 3. Da aber fast alle anderen gastrointestinalen Tumoren AFP-negativ sind, besitzt dieses Antigen eine differenzialdiagnostische Markerfunktion.
Spezifische, von der Neuralleiste abstammende Zellen gehören zum APUD-System („amine precursor uptake and decarboxylation“) und werden heute unter dem Begriff des diffusen neuroendokrinen Systems zusammengefasst. Sie sind am Aufbau klassischer endokriner Organe wie Adenohypophyse, Nebennierenmark, C-Zellen der Schilddrüse sowie der Pankreasinseln beteiligt. Man findet sie aber auch verstreut in den Schleimhäuten des Gastrointestinaltrakts, des Bronchialsystems und auch in der Haut als Merkelzellen.
Die wichtigsten Tumoren, die von den APUD-Zellen ausgehen, sind neben den kleinzelligen Lungenkarzinomen die Karzinoide, die am häufigsten im Verdauungstrakt lokalisiert sind, und zwar in der Appendix, wo sie einen benignen Verlauf zeigen, und im Ileum als maligne Verlaufsform.
Neuron-spezifische Enolase (NSE)
Als nahezu universaler neuroendokriner Marker gilt die Neuron-spezifische Enolase (NSE). Es handelt sich um eine Molekülfamilie, die aus mindestens 4 verschiedenen Isoenzymen besteht, die jeweils Dimere mit 3 möglichen, teilweise homologen Untereinheiten (α, β and γ) bilden. Die monomeren Kombinationen sind spezifisch für die Gewebe, in denen sie vorkommen. Ultrastrukturelle Untersuchungen haben gezeigt, dass NSE diffus im Zytoplasma verteilt ist und keinem spezifischen Organellsystem zugeordnet werden kann. Ihre Funktion besteht in der Interkonversion von 2-Phosphoglycerat und Phosphoenolpyruvat innerhalb der Glykolyse des Zuckerstoffwechsels.
Die NSE lässt sich in fast allen neuroendokrinen Tumoren nachweisen und ist deshalb ein weitverbreitetes Markerenzym, beispielsweise zur differenzialdiagnostischen Abklärung von Karzinoiden versus schlecht differenzierten Karzinomen. Ein weiteres Anwendungsgebiet liegt in der Abgrenzung von kleinzelligen Lungenkarzinomen gegen nicht kleinzellige Karzinome.
Chromogranin
Ein weiterer Marker für neuroendokrine Differenzierung ist das Chromogranin, ein saures Glykoprotein aus den neurosekretorischen Granula mit über 40 verschiedenen Varianten.
Am häufigsten wird das Chromogranin A gefunden, das aus einer 65–75 kDa schweren Polypeptidkette besteht. Sequenzhomologien mit Bombesin wurden beschrieben, was zu Kreuzreaktivitäten führen kann. Funktionell sind die Chromogranine an der „Verpackung“ der neurosekretorischen Granula beteiligt, außerdem regulieren sie die granuläre Kalziumkonzentration.
Die meisten endokrinen Zellen enthalten Chromogranin sowie – aus ungeklärter Ursache – Zellen des lobulären Mammaepithels, Speicheldrüsengangzellen und auch Thymusepithelzellen. Chromogranin-positiv sind Karzinoide, Inselzelltumoren, Phäochromozytome und C-Zell-Karzinome der Schilddrüse.
Ebenso wie NSE bietet Chromogranin dem Pathologen die differenzialdiagnostische Möglichkeit der Abgrenzung neuroendokriner Tumoren von schlecht differenzierten Karzinomen. Auch Chromogranin ist als Antigen relativ labil, was es anfällig für Fixierung macht. Es sollte zudem auf die Spezifität des verwendeten Antikörpers geachtet werden, da Chromogranin A, B und C nur partielle Strukturhomologien aufweisen.
(Monoklonale) Antikörper gegen monozytäre und granulozytäre Zellen sowie gegen Lymphozytensubpopulationen können nicht nur am Blutausstrich, sondern auch zur Diagnostik an Gewebeschnitten verwendet werden (Tab. 3). Eine internationale Terminologie für (durch Antikörper erkennbare) Membranantigene von Zellen des hämatolymphatischen Systems wurde für die Leukozytendifferenzierungsantigene etabliert. Die Standardisierungsbemühungen führten dazu, dass bestimmte monoklonale Antikörper, die mit einer nahezu identischen serologischen Aktivität gegen ein spezifisches Membranantigen reagieren, durch eine CD- („cluster of differentiation“-)Nummer belegt wurden. Auf internationalen, von der WHO veranstalteten Workshops über Leukozytendifferenzierungsantigene werden diese CD-Listen ständig modifiziert und aktualisiert.
Das Leukozytenantigen (LCA, leucocyte common antigen, CD45) mit einem Molekulargewicht von 200 kDa befindet sich in der Plasmamembran von hämatopoetischen Zellen. Der immunhistochemische Nachweis von LCA gelingt in über 90 % von Non-Hodgkin-Lymphomen, in nahezu allen Fällen von chronischen lymphozytären Leukämien, Haarzellleukämien und prolymphozytären Leukämien. Im Gegensatz hierzu ist das LCA nur in etwa der Hälfte aller akuten lymphozytären Leukämien nachweisbar. Leukämien der myeloischen Reihe sind zumeist LCA-negativ, Plasmozytome zeigen allenfalls eine geringe Anfärbbarkeit.
Eine weitere Unterteilung von Neoplasien der blutbildenden Organe nach ihrem histogenetischen Ursprung erfolgt mit zahlreichen spezifischen B- und T-Zellmarkern, histiozytären Differenzierungsantigenen und dem Nachweis anderer Oberflächenantigene (Tab. 4).
Die Diagnose eines schlecht differenzierten oder undifferenzierten Tumors in Abgrenzung zu einer lymphoretikulären Neoplasie ist eine häufige, nicht immer einfache Aufgabe. Zusätzlich zur Histologie können immunhistochemische Ergebnisse hierbei Entscheidungshilfen leisten (Tab. 5).
Tab. 5
Antikörperauswahl bei Fragestellung „wenig differenzierter maligner Tumor“ und entsprechende Immunoreaktivitätsmuster
Die Anwendung immunhistochemischer Zusatzuntersuchungen ist auch indiziert, wenn es bei der Biopsie von Metastasen um die Abgrenzung der möglichen Primärtumorlokalisationen geht. Ein möglicher Algorithmus für CUP („cancer of unknown primary“) ist in Abb. 3 dargestellt.
Abb. 3
Algorithmus zur Differenzialdiagnostik bei „cancer of unknown primary“ (CUP). Die „Erstlinienmarker“ LCA („leucocyte common antigen“), S100, Pan-Zytokeratin und Vimentin lassen eine erste Orientierung zu und erlauben eine grobe Einordung des Tumors (a). Bei Positivität für CK7 und/oder CK20 kann eine weitere Typisierung des Adenokarzinom hinsichtlich Lokalisation des Primärtumors vorgenommen werden (b)
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Hormonrezeptoranalyse
Das Wachstum von Tumorzellen ist bei bestimmten Organtumoren hormonabhängig. Eine Veränderung des hormonalen Milieus kann zu einer Wachstumsverzögerung oder einem Wachstumsstopp führen, morphologisch zum Teil einhergehend mit regressiven Veränderungen der Tumorzellen. Die antineoplastische Wirkung von Hormonen ist an das Vorhandensein bestimmter Rezeptoren gebunden. Nachgewiesen wurden solche Rezeptoren für Östrogene, Progesteron, Testosteron, Prolaktin und Kortison. Das Spektrum der Tumoren, die auf eine Hormontherapie ansprechen, umfasst Mamma-, Endometrium-, Prostata- und Schilddrüsenkarzinome. Eine Reihe von Tumoren, wie kolorektale Karzinome oder Leberzellkarzinome, haben Rezeptoren für Östrogen oder Progesteron, sprechen aber auf eine Hormontherapie nicht an. Die jeweiligen Hormone binden an den Rezeptor, der Hormon-Rezeptor-Komplex wird in die Zelle aufgenommen und löst dort die jeweiligen Effekte aus. Die entscheidende Rolle der Rezeptoren für die Hormonwirkung führte zur Bestimmung dieser Rezeptoren am Tumorgewebe.
Die Pathologie kann den Rezeptornachweis durch immunhistochemische Verfahren durchführen, die mittlerweile auch durch Ringversuche standardisiert ablaufen. Mittlerweile sind auch Resistenzmarker für Hormonrezeptoren in der Erprobung. So sprechen Patienten mit kastrationsresistentem Prostatakarzinom, bei denen die sog. Splice-Variante 7 des Androgenrezeptors nachgewiesen wurde, sehr viel schlechter auf eine Therapie mit Abirateron an als Patienten ohne diese Variante. Es bleibt abzuwarten, ob die klinischen Kollegen in der Zukunft hiervon Gebrauch machen, um die medikamentöse Therapie zielgerichtet einsetzen zu können.
Proliferationsmarker, Tumorzellkinetik
In einem normalen ausdifferenzierten Gewebe teilen sich immer nur wenige Zellen; sie werden als die Wachstumsfraktion bezeichnet. Im Gegensatz hierzu ist die Proliferationskinetik maligner Zellen tief greifend gestört.
Im Allgemeinen besitzen Tumoren eine hohe Wachstumsfraktion bei einer geringen Zellabsterberate, was zur Tumorvergrößerung führt. Man geht davon aus, dass von der ersten entarteten Zelle bis zum nachweisbaren Tumor ca. 30 Zellteilungszyklen (=109 Krebszellen mit 1 g Masse) benötigt werden.
Der normale DNA-Gehalt einer menschlichen Zelle entspricht dem doppelten Chromosomensatz (2n; 46 Chromosomen), man bezeichnet sie als diploid. Aufgrund der gestörten Zellteilungs- und somit Wachstumskinetik besitzen Tumorzellen demgegenüber einen DNA-Gehalt, der mehr oder weniger weit über dem von normalen Zellen liegt, man bezeichnet sie deshalb als aneuploid. Hinzu kommt, dass die DNA-Werte bei malignen Zellen stärker streuen, als dies bei nicht malignen Zellen der Fall ist. Das morphologische Korrelat dieser Aneuploidie ist als Hyperchromasie oder Polychromasie und Polymorphie der Tumorzellkerne lichtmikroskopisch erfassbar.
Neben den herkömmlichen morphologischen Methoden der Untersuchung gibt es die Möglichkeit, den Grad der Aneuploidie mittels zytophotometrischer Methoden zu bestimmen und so zwischen euploiden und aneuploiden Läsionen zu differenzieren. Hierfür stehen die die Bild-(Image-)Zytophotometrie und die Durchflusszytophotometrie zur Verfügung.
Die DNA-Durchflusszytometrie bietet den Vorteil, dass innerhalb einer relativ kurzen Zeit verschiedene weitere Zellparameter gemessen werden können, beispielsweise der zelluläre DNA-, RNA- und Proteingehalt. Im Prinzip beruht diese Technik auf der Fluoreszenzmarkierung von DNA- (bzw. RNA-)Abschnitten, wobei die Bindungsaffinität bestimmter Farbstoffe an die zu untersuchende Struktur ausgenutzt wird (z. B. bindet Propidiumiodid an die DNA). Die Fluoreszenzintensität der markierten Abschnitte wird gemessen, wenn sie einen Laserlichtstrahl passieren. Von der jeweilig gemessenen Intensität kann dann auf den DNA-Gehalt rückgeschlossen werden. Anhand von Histogrammen können zusätzlich Berechnungen durchgeführt werden, die den Anteil der Zellen ergeben, die sich in der S-Phase (DNA-Synthesephase) des Zellzyklus befinden.
Die S-Phase eines Tumors korreliert mit seiner Proliferationsaktivität: In Karzinomen mit hoher Proliferationsrate befinden sich viele Zellen in der S-Phase des Zellzyklus.
Durchflusszytometrische Methoden können bei vielen Gewebearten angewandt werden, das Material sollte kryokonserviert sein, die Einbettung in Paraffin erschwert die Durchführung. Für eine Reihe von Tumoren ist ein Zusammenhang zwischen DNA-Gehalt und Prognose gefunden worden. So ist ein hoher Grad an Aneuploidie bei Urothel-, Lungen- und (nichtseminomatösen) Hodenkarzinomen mit einer schlechteren Prognose vergesellschaftet.
Die Methode der Durchflusszytometrie ist jedoch kein Standardverfahren, was mit dem hohen apparativen und präparativen Aufwand zusammenhängt. Die Einzelwerte, aus denen sich die Histogramme ergeben, können teilweise beträchtliche Streuungen aufweisen, da sie sich aus einer Vielzahl von Parametern zusammensetzen, in die auch methodische Fehler eingehen können (Ausstrichtechnik, Inhomogenität des Zellmaterials von verschiedenen Stellen des Tumors, benigne Zellpopulationen etc.). Zudem muss für jede der verwendeten Methoden und auch für jede untersuchte Tumorart ein individueller Kontrollwert gefunden werden, der Diploidie bzw. den DNA-Gehalt von Zellen (zumeist Lymphozyten und Fibroblasten) in der Ruhephase als „internen Standard“ verwendet.
Unbestritten ist, dass bei allen Tumoren sowohl diploide als auch aneuploide Fälle bekannt sind. Der höchste Prozentsatz der Aneuploidie wird bei Lungenkarzinomen gefunden, dort sind 96 % aller Tumoren aneuploid. Der niedrigste Wert liegt bei chronischen Leukämien, hier sind alle „Tumorzellen“ diploid. Bei akuten Leukämien oder Blastenkrisen werden demgegenüber bei 25 % resp. 50 % aneuploide Zellen gefunden. Im Gegensatz hierzu können aneuploide Werte auch bei nach üblichen Kriterien benignen Läsionen gefunden werden, z. B. bei Fibroadenomen der Mamma oder Mastopathien, ebenfalls bei Schilddrüsenadenomen, chronischen Dickdarmentzündungen und Riesenzelltumoren des Knochens.
Zur weiteren Untersuchung der Proliferationskinetik maligner Tumoren sind bestimmte Antikörper entwickelt worden, die Antigene nachweisen, die nur in der Replikationsphase der Zelle auftreten. Ein Beispiel hierfür ist das „proliferating cell nuclear antigen“ (PCNA), das im Zellkern lokalisiert ist und als Hilfsenzym der DNA-Polymerase agiert. Seine Expression ist streng an den Zellzyklus gekoppelt, wobei es im Verlauf der G1- und zu Beginn der S-Phase zu einem sprunghaften Konzentrationsanstieg kommt. In der G0-(Ruhe-)Phase der Zelle wird dieses Protein nicht exprimiert. Somit können Zellen, die sich in der DNA-Synthesephase befinden, selektiv kenntlich gemacht werden. Es zeigte sich für bestimmte Organtumoren (Magen- und Urothelkarzinom), dass die Zahl der PCNA-exprimierenden Zellen negativ zur Prognose korreliert, d. h., ein hoher Prozentsatz PCNA-positiver Zellen kann auf ein hohes Rezidivrisiko und einen aggressiven biologischen Tumortyp hinweisen.
Ein weiteres nukleäres Matrixantigen, das nur in bestimmten replikativen Phasen des Zellzyklus (G1-, S-, G2-Phase) auftritt, ist das Ki-67-Antigen. Die immunhistochemische Darstellung der proliferierenden Zellen mit einem Antikörper gegen Ki-67 ergibt ein gutes Bild der Wachstumsfraktion eines Tumors. In neueren Studien wird von einem prognostischen Wert dieses Antigens bei Lymphomen, Bronchial- und Mammakarzinomen berichtet. Wie bei PCNA ist auch für Ki-67 ein hohes Maß an Anfärbbarkeit tendenziell mit einer schlechteren Tumorprognose assoziiert.
Molekularpathologie
Krebs als eine durch genetische Veränderungen ausgelöste Erkrankung beruht auf einer Deregulation der ansonsten streng geordnet ablaufenden Vorgänge der Entwicklung und Vermehrung von Zellen. Durch chemische, virale und physikalische Noxen können Mutationen im Erbgut einer Zelle ausgelöst werden, die letztlich zur Entstehung eines Tumors führen. Dabei ist das Gleichgewicht derjenigen Gene gestört, die einerseits als Protoonkogene onkogenetisches Potenzial besitzen und andererseits als Tumorsuppressorgene einem Tumorwachstum entgegenwirken. Durch Mutationen können die das Zellwachstum kontrollierenden Protoonkogene zu Onkogenen aktiviert werden. Ihre Gegenspieler, die Tumorsuppressorgene, stoppen dagegen die Zellproliferation und können Reparaturmechanismen induzieren oder bei irreparablen DNA-Schäden die Apoptose induzieren. Sind beide Allele durch Mutationen oder Genverlust geschädigt, können sie ihrer regulierenden Funktion innerhalb der Zelle nicht mehr nachkommen, ein Tumor kann entstehen.
Durch verschiedene molekularpathologische Methoden ist man heute in der Lage, die genetischen Veränderungen, die zur malignen Entartung geführt haben, zu untersuchen und sie in der Tumordiagnostik einzusetzen. Durch die Einführung der Polymerasekettenreaktion („polymerase chain reaction“ [PCR]) können diejenigen Regionen der DNA, die Onkogene oder Tumorsuppressorgene enthalten, in beliebig großer Menge amplifiziert und hinsichtlich möglicher Mutationen untersucht werden. So konnten Veränderungen einzelner Basenpaarungen im ras-Onkogen bei ca. 50 % aller kolorektalen Karzinome und bei fast 90 % aller Pankreaskarzinome gefunden werden.
Untersucht man das Tumorsuppressorgen p53, so findet man Mutationen in nahezu allen Lungenkarzinomen und in einem Großteil von kolorektalen Karzinomen. Derartige Veränderungen sind zwar derzeit nicht von diagnostischer Relevanz, tragen aber dazu bei, Einsichten in regulative Vorgänge der Tumorentstehung zu gewinnen.
Eine klinische Bedeutung können die molekularpathologischen Methoden in der möglichen Etablierung neuer prognostischer und prädiktiver Faktoren haben.
Beim Mammakarzinom hat eine genetische Veränderung auf Chromosom 17q21 besondere Bedeutung in therapeutischer und prognostischer Hinsicht erlangt. Auf diesem Genabschnitt wird für das HER2-Protein (Synonyme: c-erbB-2, HER2/neu, p185HER2) kodiert, eine Membranrezeptor-Tyrosinkinase, die strukturell einer trunkierten Form des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR, HER1) entspricht. Etwa 25–30 % der Mammakarzinome (NOS) sowie bis zu 60 % der intraduktalen Karzinome (duktales Carcinoma in situ [DCIS]) überexprimieren den Rezeptor.
Die Überexpression in humanen Tumoren beruht überwiegend auf einer Amplifikation des c-erbB2-Gens (HER2) als Folge genomischer Instabilität. Die klinische Relevanz des c-erbB-2-Status beim Mammakarzinom besteht in einer inversen Korrelation zwischen c-erbB-2-Überexpression/Genamplifikation und dem klinischen Verlauf. Darüber hinaus erwiesen sich c-erbB-2-überexprimierende Tumoren als weniger sensitiv gegenüber Standardchemo- und Hormontherapien. Die Detektion des c-erbB-2 kann über die Bestimmung der Genkopienzahl, den Nachweis der mRNA oder des Proteins erfolgen. Im Jahr 2000 erhielt Trastuzumab, ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der gegen das HER2-Protein gerichtet ist und die Proliferation HER2-überexprimierender Tumorzellen hemmt, durch die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) die Zulassung. Voraussetzung für diese Therapie ist aber die eindeutige Diagnose der Überexpression des HER2-Proteins bzw. der Nachweis der Genamplifikation.
Eine weitere diagnostische Anwendung der PCR liegt in der Untersuchung von Chromosomenrearrangements. So findet man bei follikulären Lymphomen häufig die Translokation t(14;18); durch die Anwendung der PCR kann diese Translokation schnell und sicher diagnostiziert werden. Die Größe des amplifizierten DNA-Stücks, individuell unterschiedlich für jeden Tumor, erlaubt zusätzlich die Aussage, ob es sich bei diesem Patienten um den Primärtumor oder um ein Rezidiv handelt. Die Spezifität und die hohe Sensitivität der PCR ermöglichen ihren Einsatz auch in der Diagnostik von kompletten Remissionen leukämischer Erkrankungen; durch spezielle, tumorspezifische Primer, die hochspezifisch nur mit einem bestimmten (mutierten oder rearrangierten) Genabschnitt reagieren, kann eine einzige Tumorzelle innerhalb von 107 normalen Zellen diagnostiziert werden.
Die Standardtechnik der letzten Jahre in der Detektion „isolierter Tumorzellen“ oder „minimaler residueller Erkrankung“ solider Tumoren war die Immunzytochemie unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen epitheliale Zellbestandteile. Dabei wurden spezifische Antikörper, tumorspezifische Membranantigene oder Zytokeratine verwandt. Die Spezifität dieser Antikörper ist allerdings für diagnostische Tests relativ gering, da in Knochenmarkproben von Patienten ohne Tumorerkrankung bis zu 5 % Zytokeratin-positive Zellen gefunden werden können. Doppelmarkierungsverfahren können hierbei die Gefahr einer falsch positiven Diagnose verringern. Die Sensitivität immunzytologischer Verfahren liegt über der der konventionellen Histologie. Modellexperimente an peripheren Blut- oder Knochenmarkproben, die mit Tumorzellen kontaminiert wurden, lassen auf eine hohe Wiederfindungsrate von 2–4 Tumorzellen in 10 x 106 mononukleären Zellen schließen. Verfahren der Zellanreicherung, wie Zytozentrifugation, oder die Verwendung von Imageanalysegeräten zur Durchmusterung großer Probenvolumina können zukünftig zu einer weiteren Erhöhung der Wiederfindungsrate immunzytologisch positiver Tumorzellen führen. Eine weitaus sensitivere Technik zum Nachweis spezifischer DNA-(oder RNA-)Sequenzen gelingt durch die PCR.
Die hohe Sensitivität der PCR resultiert aus der exponentiellen Zunahme spezifischer DNA- bzw. RNA-Moleküle. Die Frequenz isolierter Tumorzellen im Knochenmark bzw. im Blut liegt zwischen 1:105 und 1:106 Knochenmarkzellen. Die Nachweisgrenze der PCR beträgt, wie bereits oben beschrieben, bis zu 1 Tumorzelle auf 106 Normalzellen. Die Sensitivität der PCR-Amplifikation von DNA bzw. mRNA isolierter Tumorzellen wird auch durch den Stichprobenumfang beeinflusst. Hierbei ist die Frage entscheidend, ob überhaupt eine Tumorzelle in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass sich bei einer bestimmten Konzentration p von Tumorzellen in einer Stichprobe des Umfangs N mindestens eine Tumorzelle befindet, wird mit der Poisson-Gleichung berechnet:
Wenn die Frequenz der Tumorzellen 1:10−6 beträgt und 106 Zellen untersucht werden, ist die Wahrscheinlichkeit, mindestens 1 Tumorzelle in der Stichprobe zu haben, lediglich 63 %. Auch wenn die PCR-Reaktion per se in der Lage ist, diese Zelle zu amplifizieren, kann die Sensitivität in dieser Probe nicht über 63 % steigen!
Zytogenetik
Mehr als 14.000 karyotypisch abnormale Neoplasien sind beschrieben worden, vier Fünftel davon in hämatologischen Systemerkrankungen. Die Tumorzytogenetik nahm ihren Anfang mit der Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms bei der chronisch-myeloischen Leukämie (CML). Hierbei ist ein Segment des langen Arms von Chromosom 22 (Philadelphia-Chromosom, bcr-Gen) abgebrochen und auf Chromosom 9 transloziert. An dieser Stelle von Chromosom 9 sitzt das wachstumsregulierende c-abl-Onkogen, das nun mit dem bcr-Gen von Chromosom 22 in unmittelbarer Nachbarschaft zu liegen kommt. Dieses neu zusammengesetzte Fusionsgen wird gemeinsam transkribiert, und ein neues Protein entsteht: das bcr-abl-Onkoprotein. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Protein die Entstehung von Leukosen begünstigt.
Die in Tumorzellen vorkommenden Chromosomenaberrationen werden in 3 Gruppen eingeteilt:
Primäre Aberrationen: Bei ihnen wird eine enge Vergesellschaftung mit der Tumorentstehung postuliert. Sie können Protoonkogene oder Antionkogene (Tumorsuppressorgene) in ihrer Funktion beeinträchtigen.
Sekundäre Aberrationen: Bei der Progression eines Tumorleidens treten durch vermehrte Zellteilungen zusätzliche Chromosomenaberrationen auf. Diese können teilweise auch eine Vielzahl von Umlagerungen von Chromosomenabschnitten in einer Zellteilung beinhalten (Chromothripsis).
Tertiäre Aberrationen ereignen sich erst im Endstadium einer rasch proliferierenden Tumorerkrankung. Man stellt sich vor, dass Antimetastasierungsgene verloren gehen.
Die Schwierigkeiten konventioneller zytogenetischer Studien liegen in der Art des hierfür benötigten Materials. Um den Chromosomensatz zu untersuchen, wird eine lebende, sich in Teilung befindliche Zelle benötigt, was die direkte Untersuchung von frisch reseziertem Gewebe notwendig macht. Eine andere Möglichkeit ist das Anlegen einer Zellkultur, in der die Teilungsfähigkeit der Tumorzellen aufrechterhalten werden soll. Aus diesen praktischen Gründen sind die Neoplasien von Blut und Knochenmark zytogenetischen Untersuchungen leicht zugänglich und dementsprechend gut dokumentiert. Demgegenüber sind die meisten epithelialen Tumoren schlechter untersucht: Mamma-, kolorektale-, Lungen- und Prostatakarzinome zeigen oft eine geringe Rate von Mitosen, auch ist die notwendige Einzelzellpräparation sehr schwierig. Neuerdings wird versucht, Tumororganoide, die unter Zugabe von Stammzellfaktoren gezüchteten „Minitumoren“ entsprechen, zu verwenden. Diese Modellsysteme erlauben dann eine genetische Charakterisierung und dienen als Testsysteme, um vorherzusagen, welche Chemotherapeutika bei dem jeweiligen Tumor wirken.
Bei den Organtumoren haben Chromosomenaberrationen eine eher untergeordnete diagnostische Bedeutung, finden aber zunehmenden Eingang in die Routineuntersuchung hämatologischer oder lymphoretikulärer Systemerkrankungen.
Die zytogenetische Untersuchung findet nicht nur bei der Erstdiagnose von hämatologischen Systemerkrankungen Anwendung, sondern auch zur Bestimmung von (Voll-)Remission oder Rezidiv. Erreicht man mit einer Therapie die komplette Remission, normalisiert sich der Karyotyp. Sollten zusätzliche chromosomale Aberrationen des Karyotyps eines Patienten auftreten, ist eine Progression der Erkrankung anzunehmen.
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