Zukunft der Stammzelltransplantation und neue zelluläre Therapien

Nach allogener Transplantation hämatopoetischer Stammzellen (HSZT) kommt es zwischen Spender und Empfänger (Patient) zu einer komplexen Immunreaktion. Im Fokus stehen dabei die v. a. von T-Zellen vermittelte Transplantat-gegen-Wirt-Reaktion („graft-versus-host disease“, GvHD) und der Transplantat-gegen-Leukämie-Effekt („graft-versus-leukemia“, GvL). Ausgehend vom Immunsystem des Blutstammzellspenders sind beide Immunreaktionen zumeist polyklonal, gegen eine Vielzahl von Antigenen gerichtet und werden von einer Vielzahl unterschiedlicher Immuneffektor- und Regulatorzellen beeinflusst. Der Einsatz von zellulären Immuntherapien im Kontext der allogenen HSZT zielt darauf ab,

Um dies zu erreichen, werden Zellprodukte aus definierten Immunzellen hergestellt, die gegen wenige oder ein einzelnes Antigen gerichtet sind bzw. über spezifische intrinsische Eigenschaften verfügen. In diesem Kapitel sollen beispielhaft die adoptive Immuntherapie mit virus- und tumorspezifischen T-Zellen, natürlichen Killer-(NK-)Zellen sowie der Einsatz von regulatorischen T-Zellen (Tregs) und mesenchymalen Stromazellen (MSC) zur Therapie und Prophylaxe der GvHD vorgestellt werden.

Die Wirksamkeit der hier vorgestellten zellulären Therapien in ihrem jeweiligen Indikationsgebiet wurde im präklinischen und – zunehmend auch – klinischen Kontext evaluiert und bestätigt. Durch enormen technologischen Fortschritt können zelluläre Produkte zunehmend schneller und standardisiert hergestellt und als Teil eines modernen, ambitionierten Transplantationskonzepts eingesetzt werden.

T-Lymphozyten spielen eine eminent wichtige Rolle für die immunologischen Vorgänge in einem menschlichen Organismus nach allogener HSZT und sind verantwortlich für die GvHD sowie den GvL-Effekt, aber auch für die Abwehr von reaktivierten Viren. Dies ist besonders bedeutsam bei der Gabe von Stammzellen von virusunerfahrenen (seronegativen) Stammzellspendern. Die Reaktivierung z. B. des Zytomegalievirus (CMV) kann nach allogener HSZT zu Fieber und Myelotoxizität, aber auch zu Kolitis und Pneumonie sowie virus- und therapiebedingt zu Nephrotoxizität führen. All diese Nebenwirkungen sind potenziell lebensgefährlich.

Die Clearance der CMV-Viruslast korreliert mit der Frequenz im peripheren Blut zirkulierender CMV-spezifischer T-Zellen. Dabei spielen die CD8+ T-Zellen die Hauptrolle, aber auch CD4+ T-Zellen sind von Bedeutung. Gleiches gilt für das Epstein-Barr-Virus (EBV), Adenoviren (AdV) und JCV/BKV-Polyomaviren, die nach allogener HSZT reaktivieren können. Bereits Anfang der 1990er-Jahre wurde gezeigt, dass durch adoptiven Transfer von CMV-spezifischen T-Zell-Klonen, die aus dem T-Zell-Repertoire eines CMV-seropositiven Spenders isoliert und in vitro expandiert wurden, die Immunität eines CMV-seronegativen Patienten nach allogener HSZT gegen CMV rekonstituiert werden kann (Riddell et al. 1992). Die Isolation und Expansion von virusspezifischen T-Zell-Klonen dauert unter dem Zeitdruck der Virusinfektion jedoch oft zu lang (ca. 4–6 Wochen). CMV-spezifische T-Zellen stellen einen signifikanten Anteil des endogenen T-Zell-Repertoires in CMV-seropositiven Individuen dar, sodass aktuell der Fokus auf der Herstellung von polyklonalen CMV-spezifischen T-Zellen liegt, die schneller generiert werden können und mittlerweile auch von kommerziellen Anbietern als personalisiertes Zellprodukt hergestellt werden (z. B. Cytovir^TM der Fa. Cell Medica).

Dank enormen technologischen Fortschritts müssen CMV-spezifische T-Zellen heutzutage nicht mehr durch repetitive Antigenstimulation generiert werden, sondern können mithilfe von Selektionsreagenzien aufgrund der Spezifität ihres T-Zell-Rezeptors für ein bestimmtes CMV-Antigen isoliert und für den adoptiven Transfer amplifiziert werden. Ein elegantes und zeitnahes Verfahren stellt die Selektion von CMV- und anderen virusspezifischen T-Zellen mittels Streptameren dar. Streptamere imitieren humane Leukozytenantigen-(HLA-)Moleküle und präsentieren Virusantigenpeptide gegenüber spezifischen T-Zellen, die so aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern aufgereinigt und anschließend dem Patienten mit Virusreaktivierung verabreicht werden können (Abb. 1). Wir konnten erste Fälle der klinischen Wirksamkeit dieser Methode beschreiben (Schmitt et al. 2011). Bei dem besonders häufigen Problem der seronegativen Stammzellspender können auch Third-Party-Spender zur Gewinnung von virusspezifischen T-Zellen herangezogen werden. Aktuelle Entwicklungen gehen dahin, CMV-spezifische T-Zellen sogar ohne vorherige Expansion direkt nach der Isolation zu applizieren und multivirusspezifische T-Zell-Produkte gegen CMV, EBV und AdV zu generieren. Selektionsverfahren mit Streptameren oder immunomagnetischen Beads werden zukünftig auch bei der Selektion von bestimmten T-Zell-Subpopulationen herangezogen werden, um dann gezielt nur diese Populationen genetisch mit chimären Antigenrezeptoren (CAR) oder T-Zell-Rezeptoren (TZR) zu verändern.

Tumorreaktive T-Zellen können aus dem endogenen T-Zell-Repertoire eines Patienten oder HLA-kompatiblen Spenders isoliert und in vitro für den adoptiven Transfer expandiert oder durch Engineering, d. h. genetische Modifikation mit einem tumorreaktiven TZR oder CAR, generiert werden (Abb. 2). CAR-modifizierte T-Zellen haben in klinischen Pilotstudien ihr kuratives Potenzial bei der Behandlung hämatologischer Erkrankungen unter Beweis gestellt und der zellulären Immuntherapie in den vergangenen Jahren enormen Vortrieb gebracht.

Im Gegensatz zu B- und T-Lymphozyten sind natürliche Killer-(NK-)Zellen Teil des innaten, d. h. „angeborenen“ Immunsystems. Die Rezeptoren dieser Zellen sind bereits in der Keimbahn festgelegt und sind nicht Gegenstand weiterer Rearrangements wie die Rezeptoren von B- und T-Zellen. Anders als bei B- und T-Zellen wird kein entsprechendes Peptid, z. B. durch ein HLA-Molekül, dargeboten. Vielmehr ist die Abwesenheit eines passenden inhibitorischen Liganden (sog. Killerzellen-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren, KIR) genügend Signal für eine NK-Zelle, um eine entsprechend ligandendefekte Target-Zelle zu eliminieren. Dies wird als Missing-self-Hypothese bezeichnet (Cruz und Bollard 2015). Es entsteht so ein GvL-Effekt, der durch NK-Zellen ausgeübt wird.

In der pädiatrischen Stammzelltransplantation und in jüngster Zeit auch in der erwachsenen Stammzelltransplantation nimmt die Verwendung von haploidenten Transplantaten zu. Bei dieser Form der Transplantation ist eine ausgeprägte T-Zell-Depletion wichtig, um eine GvHD-Reaktion zu verhindern. Zur T-Zell-Depletion gibt es seit vielen Jahren die Möglichkeit der Aufreinigung von CD34+ Stammzelltransplantaten. Dieses Vorgehen stellt zunächst eine effiziente Vorbeugung gegen GvHD dar, führt aber auch zu einem Verlust der GvL-Reaktivität. Um die antileukämische Wirkung wiederherzustellen, wird in einem 2-zeitigen Vorgehen ein NK-Zell-Präparat vom Stammzellspender gegeben (Stern et al. 2013). So lassen sich besser und nachhaltigere antileukämische Wirkung sowie antivirale Wirkung gegen CMV, EBV und andere Viren erreichen. Laufende Studien untersuchen, wie haplotransplantierte Patienten besonders von der 2-zeitigen Gabe – Stammzellen und dann NK-Zellen – profitieren können und wie nachhaltig dieser Effekt ist.

Seit mehreren Jahrzehnten ist bekannt, dass sich auch beim Menschen unter den T-Lymphozyten Subpopulationen finden lassen, deren Aufgabe in der negativen Regulation von Immunantworten besteht. Bisher am intensivsten untersucht sind CD4+ regulatorische T-Zellen (Treg), die sich über die starke Expression von CD25 und den Transkriptionsfaktors FoxP3+ von üblichen Effektorzellen unterscheiden lassen. In vitro sind sie in der Lage, aktivierte Effektorzellen zu supprimieren und damit auch Autoimmunität zu unterdrücken. Entsprechend führt eine angeborene Mutation und Dysfunktion von FoxP3 zu schweren Autoimmunerkrankungen, die bei Ausbleiben einer kurativen Stammzelltransplantation tödlich verlaufen.

In den vergangenen Jahren konnte gezeigt werden, dass die Frequenz von Treg im Blut von Patienten oder Transplantat mit dem Auftreten von GvHD nach allogener Stammzelltransplantation assoziiert ist. Weiterhin konnte ihre Bedeutung nicht nur bei Autoimmunerkrankungen, sondern auch bei der Organtransplantation belegt werden.

Eine entscheidende Beobachtung in einem präklinischen Modell war, dass der Transfer von Treg im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation zu einer Vermeidung von GvHD bei Erhalt der antileukämischen Aktivität führt (Edinger et al. 2003). Diese Beobachtung stimulierte mehrere Arbeitsgruppen, die Herstellung von Treg unter Reinstraumbedingungen zu optimieren. Wichtig hierbei ist der Erhalt einer phänotypisch und funktionell reinen Population von Treg, die entsprechend sicher infundiert werden kann. In kleineren Pilotstudien konnte gezeigt werden, dass die Übertragung von aus Nabelschnurblut bzw. Spendervollblut oder Leukapheresat gewonnenen Treg sicher durchführbar ist und eine gewisse Effizienz aufweist. Nach weiteren Optimierungsarbeiten wurden in den vergangenen Jahren klinische Studien zur Prävention und Therapie von GvHD und Organabstoßung begonnen. In der Hämatologie wurden zum einen Spender-Treg im Rahmen der HLA-haploidenten Transplantation prophylaktisch eingesetzt, um zusätzlich konventionelle T-Zellen applizieren zu können, zum anderen wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Treg in der Phase nach allogener Transplantation zur GvHD-Prophylaxe eingesetzt. Schließlich konnten Spender-Treg auch bei aktiver akuter und chronischer GvHD mit wechselndem Erfolg therapeutisch eingesetzt werden. Zumeist wurden ca. 1 × 10e5 bis 1 × 10e6 Treg pro kg Körpergewicht infundiert. Falls möglich, wurden Calcineurininhibitoren vor der Treg-Gabe durch mTOR-Inhibitoren ersetzt, um den Treg-Effekt zu unterstützen. Zumeist konnten die infundierten Treg nur über wenige Wochen nach Gabe im peripheren Blut nachgewiesen werden, sodass ein beschleunigter Abbau oder ein Homing in sekundäre lymphatische Organe anzunehmen ist. Weitere klinische Projekte beschäftigen sich mit dem Einsatz von Treg bei entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn), Typ-I-Diabetes mellitus und multipler Sklerose. Parallel laufen präklinische Versuche, die Spezifität von Treg zu verbessern und sie für einen breiteren Einsatz verfügbar zu machen (Kretschmer et al. 2005).

Vor bereits mehr als 30 Jahren wurde erkannt, dass im Bereich des Knochenmarkraums neben den Vorläuferzellen für die Blutbildung auch Progenitoren für Knorpel, Knochen und Fettgewebe existieren. Diese später als „mesenchymale Stammzellen“ definierten Zellen müssen nicht aus fetalem Gewebe gewonnen werden, sondern können auch aus adultem Knochenmark und anderen Geweben isoliert und durch Kulturverfahren expandiert werden.

MSC lassen sich zum einen durch ihre Funktionalität, zum anderen durch ihre Antigenität spezifizieren. Sie sind negativ für die hämatopoietische Antigene CD34, CD133 und CD45, exprimieren zumeist CD166, CD44, CD105 und CD73. Morphologisch unterscheiden sie sich kaum von Fibroblasten bzw. reifen Stromazellen. Nachdem hinsichtlich der Selbsterneuerungskapazität methodische und biologische Unsicherheiten bestehen, wird vorgeschlagen, die typischerweise heterogene Zellpopulation als mesenchymale Stromazellen zu bezeichnen.

Für die therapeutische Anwendung von MSC zeichnen sich verschiedene interessante Perspektiven ab. Denkbar ist der klinische Einsatz von MSC bei

So wurde nachgewiesen, dass MSC die Zytokinexpression und tumorgerichtete Zytotoxizität von NK-Zellen sowie die Proliferation und Antikörperproduktion von B-Lymphozyten inhibieren können. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass MSC auch das immunstimulatorische Potenzial von dendritischen Zellen und die Proliferation von T-Zellen hemmen können.

Diese Erkenntnisse bilden eine wesentliche Grundlage für die Einbindung von MSC in neue Therapiekonzepte für Patienten mit Autoimmunerkrankungen sowie schweren Entzündungsreaktionen (GvHD, Abstoßung von Fremdgeweben) im Rahmen einer Transplantation. Insbesondere bei der steroidrefraktären akuten GvHD wurden anfänglich erfolgversprechende klinische Ergebnisse berichtet (Le Blanc et al. 2008). Eine Bestätigung in prospektiv randomisierten Studien steht jedoch aus. Inzwischen ist die GMP-konforme Herstellung von MSC aus verschiedenen Geweben (Knochenmark, Fettgewebe und Nabelschnurblut/-gewebe) in mehreren akademischen Zentren sowie kommerziell etabliert. In bisherigen klinischen Anwendungen wurden zumeist MSC von nicht verwandten freiwilligen Spendern („third party“) eingesetzt.

Die meisten Erfahrungen existieren mit der Gabe von ca. 1–2 × 10e6 „Third-party“-MSC aus dem Knochenmark pro kg Körpergewicht in repetitiven Applikationsschemata (ca. 2–6 Gaben alle 3–7 Tage). Hier konnten bei steroidrefraktärer GvHD Ansprechraten von ca. 50 % erreicht werden.

Besonders effizient scheinen MSC vor allem bei pädiatrischen Patienten zu sein, bei denen teilweise deutlich höhere Zelldosierungen möglich sind. In jüngster Vergangenheit wurden klinische Erfolge mit aus Nabelschnurgewebe gewonnen MSC im prophylaktischen Setting nach haploidenter Transplantation berichtet (Gao et al. 2016). Neben der systemischen Applikation bei akuter GvHD und Autoimmunerkrankungen werden MSC auch topisch in nicht hämatologischen Indikationen, wie z. B. bei entzündlichen Darmerkrankungen, eingesetzt.