Folin-Ciocalteu-Methode
Folin-Ciocalteu-Methode
Synonym(e)
Lowry-Methode der Proteinbestimmung
Englischer Begriff
Lowry method
Definition
Die Biuretmethode wird ohne Kaliumiodid im Reagens durchgeführt, so dass Cu2+ im Biuretkomplex in Cu+ übergeht. Parallel dazu findet die Reaktion (Oxidation) von Tyrosin-, Tryptophan- und Cysteinresten mit dem zusätzlichen Folin-Ciocalteu-Reagens (besteht aus Phenol- und Natronlauge sowie Phosphorwolframsäure und Phosphormolybdänsäure) statt. Durch Reduktion dieser beiden Säuren wächst die Empfindlichkeit 100-fach gegenüber der klassischen Biuretreaktion.
Beschreibung
Die von Hartree (1972) und Lowry (1951)modifizierte Methode nach Folin-Ciocalteu (1927) erreicht eine Nachweisgrenze von 0,1–1 mg/L Protein. Da die Eichkurve nicht linear verläuft, die Färbung nicht sehr stabil ist und Proteine infolge ihrer differenten Anteile an Tyrosin-, Tryptophan- und Cysteinresten unterschiedliche Extinktionskonzentrationskurven aufweisen, ist die Anwendung dieser Methode durch den besser standardisierbaren Bicinchoninsäureassay und teilweise durch Farbstoffbindungsmethoden (z. B. Bromkresolgrünmethode) ersetzt worden.
Methodik
Frisches Lowry-Reagens wird durch Mischen folgender Lösungen hergestellt:
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15 mL Stammlösung A (100 g Na2CO3 in 1 L 0,5 M NaOH)
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0,75 mL Stammlösung B (1 g CuSO4 × 5 H2O in 100 mL H2O)
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0,75 mL Stammlösung C (2 g K-Tartrat in 100 mL H2O)
1 mL Lowry-Reagens + 1 mL Proteinlösung 15 Minuten bei Raumtemperatur, 2 N Folin-Ciocalteu-Reagens mit H2O 1:10 verdünnen, davon 3 mL zusetzen, mischen und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fotometrie bei 650 nm.
Kalibration
Mit Rinderserumalbumin.
Störfaktoren
EDTA, Ammoniumsulfat, Triton X-100.
Diagnostische Bedeutung
Nur noch verwendet zur Messung von Proteinlösungen aus Fraktionierungen oder Biopsien.