Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay
Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay
Synonym(e)
LOCI-Assay
Definition
Der Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay (LOCI) ist ein homogener Immunoassay unter Verwendung der Chemolumineszenz als Detektionssystem. Er basiert auf dem Zusammenwirken zweier unterschiedlicher Populationen von Mikropartikeln (Beads) in Suspension.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Eine der beiden Bead-Populationen („donor beads“, „sensitizer beads“) enthält eine lichtempfindliche Substanz, z. B. einen Photosensibilisator wie Phthalocyanin, die bei Bestrahlung mit Licht dazu in der Lage ist, Sauerstoff vom elektronischen Grundzustand (Triplettzustand) in den ersten elektronischen Anregungszustand (Singulettzustand) zu überführen (Lumineszenz). Die andere Beadpopulation („acceptor beads“, „chemiluminescer beads“) enthält ein Olefin, das mit dem entstandenen Singulettsauerstoff unter Bildung eines Dioxetans reagiert (Fotooxygenierung). Das gebildete Dioxetan zersetzt sich spontan unter Emission von Licht (Chemilumineszenz).
Die Donor- und Akzeptor-Beads sind mit Antigenen bzw. spezifischen Antikörpern beschichtet. Bei kompetitiven Assays kann z. B. eine Bead-Population mit Antigen und die andere mit dem korrespondierenden Antikörper, bei nichtkompetitiven Assays können z. B. beide Bead-Populationen mit spezifischen Antikörpern beschichtet sein. Während der Inkubation der beschichteten Donor- und Akzeptor-Beads mit der Probe werden infolge spezifischer Wechselwirkungen beide Bead-Populationen in räumliche Nähe zueinander gebracht. Die in der Probe suspendierten Beads werden mittels Laser bestrahlt (680 nm; 0,1–1 s). Der in den Donor-Beads unter Lichteinfluss freigesetzte Singulettsauerstoff diffundiert in den Innenraum der Akzeptor-Beads und bewirkt dort die Chemilumineszenzreaktion. Die darauf folgende, innerhalb einer definierten Zeitspanne auftretende Chemolumineszenzemission bei 550–650 nm wird gemessen. Das Messsignal ist proportional zur Anzahl der innerhalb einer bestimmten Zeit auftretenden Donor-Bead-Akzeptor-Bead-Wechselwirkungen und damit zur Konzentration des zu bestimmenden Analyten.
Einsatzgebiet
Der LOCI wird zur Bestimmung von Antigenen mit großer und kleiner Molekularmasse sowie Antikörpern eingesetzt. Da sich die Chemilumineszenzreaktion im Inneren der Beads abspielt, wird sie nicht von höhermolekularen Bestandteilen der flüssigen Probe beeinflusst, was den LOCI sehr sensitiv, spezifisch und wenig störanfällig macht.
Instrumentierung
Der LOCI kann manuell und automatisiert durchgeführt werden. Entsprechende Geräte zur Automatisierung des Tests sind auf dem Markt erhältlich.
Sensitivität
Der LOCI ermöglicht den sehr sensitiven Nachweis einzelner Analyte. Die mit kompetitiven Immunoassays nachgewiesenen Konzentrationen liegen im pmol/L-Bereich und die mittels nichtkompetitiver Immunoassays nachgewiesenen Konzentrationen im fmol/L-Bereich.
Fehlermöglichkeit
Bei zu langer Inkubationsdauer kommt es zu unspezifischer Aggregation der Beads und damit zu falsch positiven Reaktionen. Hohe Konzentrationen von Ascorbinsäure im Urin stören den LOCI, weshalb hier verdünnte Urinproben (<1 %) eingesetzt oder Oxidationsmittel zugesetzt werden müssen.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Der LOCI ermöglicht den schnellen (5–15 Minuten) Nachweis einzelner Analyte unter Verwendung geringer Probenvolumina (20 μL).
Literatur
Ullman EF, Kirakossian H, Singh S et al (1994) Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proc Natl Acad Sci 91:5426–5430CrossRefPubMedPubMedCentral
Wild D (2001) The immunoassay handbook. Nature Publishing Group, New York, S 192–194