PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
Synonym(e)
Polymerase-Kettenreaktion
Englischer Begriff
PCR; polymerase chain reaction
Definition
Unter PCR (Polymerase-Kettenreaktion) versteht man die Vervielfältigung eines mittels flankierender Oligonukleotide (Primer) definierten DNA-Abschnitts durch eine auf die vervielfältigten Abschnitte aufbauende, sich zyklisch wiederholende Replikation.
Beschreibung
Die 1983 erstmals durch Kary Mullis (Mullis, Kary Banks) publizierte PCR hat sich zu einer der elementaren methodischen Grundlagen der Molekularbiologie entwickelt. Definierte DNA-Abschnitte lassen sich in kurzer Zeit zigtausendfach vervielfältigen und einer gezielten Analyse, wie z. B. der Mutationssuche, zuführen.
Aus Studien zur DNA-Replikation war seinerzeit bereits bekannt, dass man durch ein synthetisches Oligonukleotid als Initationsprimer (Oligonukleotid-Primer) und mithilfe der E.-coli-DNA-Polymerase einen definierten Abschnitt einer DNA-Sequenz, den man durch Hitzedenaturierung einzelsträngig gemacht hatte, replizieren konnte. Da für jeden weiteren Replikationszyklus eine Hitzedenaturierung erfolgen musste, die einerseits die doppelsträngige DNA in einzelsträngige überführte, andererseits aber die E. coli-DNA-Polymerase inaktivierte, sodass nach jedem Zyklus neues Enzym hinzugefügt werden musste, war dieser Ansatz für einen größeren Maßstab nicht geeignet.
Den wesentlichen Durchbruch erbrachte die Isolierung einer thermostabilen DNA-Polymerase aus dem thermostabilen Bakterium Thermus aquaticus. Dieses als Taq-Polymerase beschriebene und unter diesem Namen kommerziell verfügbare Enzym verliert durch die hohen Temperaturen einer Hitzedenaturierung nicht seine Aktivität und kann daher eingesetzt werden in einem sich zyklisch wiederholenden Prozess aus
1.
Hitzedenaturierung der doppelsträngigen DNA,
Für die automatisierte Durchführung dieser zyklischen Vorgänge wurden zahlreiche Modelle eines sog. PCR-Cyclers entwickelt, die in rascher Abfolge die jeweiligen Inkubationstemperaturen ändern können.
Im Detail läuft ein Standard-PCR-Protokoll folgendermaßen ab:
Für eine bekannte, zu amplifizierende DNA-Sequenz werden im Vorfeld gegenläufige (Sense- und Antisense-) Oligonukleotide als Primer designt, die die gleiche DNA-Schmelztemperatur („melting temperature“) und von der Struktur beispielsweise möglichst keine Palindrome oder keinen G/C-Gehalt über 50 % haben sollen. Für die optimale Primerwahl stehen Computerprogramme, wie z. B. Primer3Plus, zur Verfügung.
Für das eigentliche Assay werden folgende Komponeneten in kleinen Reaktionsgefäßen zusammenpipettiert: genomische DNA (0,10–1 μg/100 μL), ein PCR-Reaktionsmix bestehend aus Tris-HCl-Puffer, dNTPs (je 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP, dGTP), MgCl2, Sense- und Antisense-Primern (0,1–1 μM) und destilliertem Wasser sowie Taq-Polymerase (ca. 2,5 Units/100 μL). Die Reaktionsgefäße werden in einen PCR-Thermocycler transferiert und das ausgewählte Amplifikationsprogramm gestartet. Die Temperaturprofile der einzelnen Programme können sich dabei voneinander unterscheiden.
Ein Thermocycler-Programm besteht aus folgenden, individuell variablen Segmenten:
-
Segment 1:
-
1 Zyklus
-
Initiale Denaturierung (der genomischen DNA) bei 95 °C für 1–2 Minuten
-
-
Segment 2:
-
Insgesamt 25–30 Zyklen
-
Denaturierung bei 95 °C für 30–45 Sekunden
-
Annealing bei primerspezifischer Temperatur (50–65 °C) für 45–60 Sekunden
-
Elongation bei 72 °C für 45 Sekunden bis 3 Minuten
-
-
Segment 3:
-
1 Zyklus
-
Finale Elongation bei 72 °C für 10 Minuten
-
Nach erfolgter Amplifikation können die Reaktionsgefäße mit den Amplifikaten bis zum Gebrauch bei Kühlschranktemperatur gelagert werden.
ACHTUNG! Zur Vermeidung von Kontaminationen mit Amplifikaten gilt für die Durchführung von PCR-Analysen eine sog. 3-Raum-Regel, nach der einzelne Schritte in unterschiedlichen Räumen zu erfolgen haben und ein Transfer, nicht nur der Reaktionsansätze, sondern auch allgemeiner Verbrauchsmittel, Pipetten, Geräte oder Laborkittel nur nach dem Einbahnstraßenprinzip erfolgen kann: Im Prä-PCR-Bereich werden die genomischen DNAs extrahiert und die eigentlichen PCR-Assays zusammenpipettiert. Die geschlossenen Ansatzgefäße werden anschließend in den eigentlichen PCR-Raum zu den Thermocyclern transportiert und die Reaktion gestartet. Nach erfolgter Amplifikation werden die geschlossenen Reaktionsgefäße in den Post-PCR-Bereich transferiert, wo die Amplifikate weitergehend bearbeitet und gelagert werden können.
Aus der klassischen PCR-Reaktion wurden für gezielte Fragestellungen zahlreiche Varianten weiterentwickelt, wie z. B. Realtime-PCR, Multiplex-PCR, Nested-PCR, Touchdown-PCR, RT-PCR (reverse transcriptase PCR).
Literatur