Grundlagen der Hormonbestimmung in der pädiatrischen Endokrinologie
Verfasst von: Stefan A. Wudy, Michaela F. Hartmann, Claudia Boettcher, Clemens Kamrath und Werner F. Blum
Die pädiatrische Endokrinologie ist auch ein „Laborfach“, welches das Gebiet der endokrinen Analytik beinhaltet. Im Unterschied zur Endokrinologie der Erwachsenen gelten für die pädiatrische Endokrinologie viele Besonderheiten. Viele angeborene Hormonstörungen manifestieren sich bereits in der Kindheit und stellen differenzialdiagnostische Herausforderungen dar. Störungen des Wachstums und der Pubertätsentwicklung sind Domänen der pädiatrischen Endokrinologie. Oft wird vergessen, dass praktisch alle kommerziell erhältlichen Hormonassays nur für Erwachsene entwickelt worden sind. Die unkritische Anwendung solcher Assays bei Kindern birgt oft Probleme. Die ständige Dynamik von Wachstum und Entwicklung des kindlichen Organismus schafft wechselnde analytische Anforderungen. Ferner müssen altersbezogene Referenzbereiche vorgehalten werden. Dies alles muss bei der Auswahl von Methoden zur endokrinen Diagnostik bei Kindern berücksichtigt werden, da sonst Fehlmessungen und Fehlinterpretationen unvermeidlich sind.
Besonderheiten der Hormonbestimmung bei Kindern und Stellenwert der pädiatrisch-endokrinologischen Analytik
Die pädiatrische Endokrinologie ist auch ein „Laborfach“, welches das Gebiet der endokrinen Analytik beinhaltet. Im Unterschied zur Endokrinologie der Erwachsenen gelten für die pädiatrische Endokrinologie viele Besonderheiten. Viele angeborene Hormonstörungen manifestieren sich bereits in der Kindheit und stellen differenzialdiagnostische Herausforderungen dar. Störungen des Wachstums und der Pubertätsentwicklung sind Domänen der pädiatrischen Endokrinologie. Oft wird vergessen, dass praktisch alle kommerziell erhältlichen Hormonassays nur für Erwachsene entwickelt worden sind. Die unkritische Anwendung solcher Assays bei Kindern birgt oft Probleme.
Die ständige Dynamik von Wachstum und Entwicklung des kindlichen Organismus schafft wechselnde analytische Anforderungen. Ferner müssen altersbezogene Referenzbereiche vorgehalten werden.
Dies alles muss bei der Auswahl von Methoden zur endokrinen Diagnostik bei Kindern berücksichtigt werden, da sonst Fehlmessungen und Fehlinterpretationen unvermeidlich sind.
Bedauerlicherweise haben Entwicklungen der letzten Jahre dazu geführt, dass Labormethoden aus der pädiatrischen Endokrinologie in Disziplinen abgewandert sind oder abgezogen wurden, in denen vorrangig die Interessen und Bedürfnisse Erwachsener bedient werden. Vermeintlich aus Kostengründen oder Argumenten der besseren Effizienz hat man so vielen pädiatrisch-endokrinologischen Laboren die Existenzgrundlage entzogen. Dass dies oft mit erheblichen Qualitätsverlusten in der pädiatrisch-endokrinologischen Analytik einherging, konnte jedoch nur die kleine Schar der praktisch tätigen pädiatrischen Endokrinologen merken, da nur sie mit den Diskrepanzen zwischen Laborbefunden und klinischen Befunden konfrontiert ist. Wie jedoch die jüngsten Entwicklungen auf dem Sektor der Bewertung klinischer und analytischer Leistungen (EBM, GOÄ) zeigen, liegt eine adäquate Honorierung noch in ferner Zukunft. Bei aller vermeintlichen Ratio ökonomischer Diskussionen dürfen wir jedoch nicht das Wohl der uns anvertrauten Patienten vergessen. Qualität ist nicht gleichbedeutend mit Luxus!
Cave
Fehlmessungen mit konsekutiver Fehlinformation des Patienten und seiner Eltern sowie inkorrekter Diagnose und inadäquater Therapie können für die Betroffenen desaströse Auswirkungen entfalten.
Das pädiatrisch-endokrinologische Labor ist ein entscheidendes technisch-diagnostisches Instrument des pädiatrischen Endokrinologen, vergleichbar dem Herzkatheter eines Kardiologen oder dem Endoskop eines Gastroenterologen. Kein Vertreter der beiden letztgenannten Spezialgebiete würde so ohne Weiteres sein technisches Instrument aus der Hand geben.
Da der pädiatrische Endokrinologe in besonderem Maße abhängig von den Labormethoden ist, um eine richtige Diagnose zu stellen oder den Patienten zu führen, sind gründliche Kenntnisse der Hormonbestimmungsmethoden von essenzieller Bedeutung. Theorie und Praxis des pädiatrischen Hormonlabors sind Kernbestandteile der derzeitigen europäischen Ausbildungsrichtlinien für die pädiatrische Endokrinologie und Diabetologie (Hindmarsh 2001). Ferner muss der pädiatrische Endokrinologe die von ihm angewendeten Labormethoden genau kennen und auf diese ggf. Einfluss nehmen können. Dies setzt einen ungehinderten Zugang zum Laborbereich oder besser ein eigenes Labor voraus. Es ist daher die Intention dieses Kapitels, dem pädiatrischen Endokrinologen einen Überblick über die verfügbaren Hormonbestimmungsmethoden zu geben und ihn in die Grundlagen derselben einzuführen.
Prinzipien der Hormonbestimmungsmethoden
Die Konzentrationen der Hormone in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben sind im Allgemeinen sehr niedrig. Es sind daher sensitive Bestimmungsmethoden erforderlich. Diese beruhen meistens auf der Basis von Immunoassays. In besonderen Situationen kommen andere Verfahren wie Bioassays, Radiorezeptorassays oder chemische bzw. physikalisch-chemische Nachweismethoden in Frage.
Bei der Hormonbestimmung im Blut (Serum oder Plasma) ist die tageszeitliche (zirkadiane) Abhängigkeit der Konzentration zu beachten. Viele Hormone liegen sowohl frei als auch an ein Trägereiweiß gebunden vor.
Aufgrund des Konzentrierungseffektes sind bestimmte Hormon- und vor allem deren Metabolitkonzentrationen im Urin höher als im Blut (Ausnahme Peptidhormone).
Des Weiteren stellt Urin per se schon eine „gereinigte“ Flüssigkeit dar. Zu unterscheiden ist die Bestimmung der Hormone aus Spontanurin oder Sammelurin. Urinbestimmungen aus z. B. 24-Stunden-Urin geben zusätzlich eine zeitlich integrale Information. Die Schwankungen durch tageszeitlich unterschiedliche Konzentrationen entfallen bei dieser Bestimmungsmethode. Vielfach erlaubt eine Metabolitenbestimmung aus Sammelurin Rückschlüsse auf die Sekretionsrate des Prähormons, des eigentlichen Hormons oder die eingenommene Menge eines Medikamentes (z. B. eines Hormonpräparates).
Bioassays
Der Bioassay (biologischer Assay) stellte ursprünglich die einzige Methode dar, um hormonelle Wirkungen zu erfassen. Mit dem Bioassay misst man die Effekte eines Hormons qualitativ oder quantitativ auf einen lebenden Organismus oder in vitro in Zellsystemen. Wegen der oft aufwendigen Durchführung kommen Bioassays heute in der Labordiagnostik nur noch selten und nur bei speziellen Fragestellungen zum Einsatz.
Radiorezeptorassays
Der Radiorezeptorassay ist eine Methode zur Untersuchung sowohl der Hormonkonzentration als auch der Bindungsfähigkeit des Hormons an seinen Rezeptor. Dem Assay liegt eine Hormon-Rezeptor-Interaktion zugrunde, die sättigbar, kompetitiv und reversibel ist. Durch radioaktiv markierte Hormone werden in direkten Bindungsversuchen zwischen der spezifischen Bindung an den Rezeptor (hohe Affinität) und der unspezifischen Bindung an beispielsweise Gewebe (geringe Affinität) unterschieden.
Immunoassays
Die meisten Hormonassays werden heutzutage nach dem Prinzip des kompetitiven Bindungsassays durchgeführt. Der Prototyp des kompetitiven Bindungsassays ist der Radioimmunoassay (RIA, Abb. 1). Die fundamentalen Bestandteile eines RIA sind
1.
radioaktiv-markiertes („heißes“) Hormon, der sog. Tracer,
2.
unmarkiertes („kaltes“) Hormon, das im Standard und in der Probe enthalten ist, und
Schematische Darstellung eine Radioimmunoassays (RIA). Kompetitive Bindung des unmarkierten und des radioaktiv markierten Antigens um die Bindungsstellen am spezifischen ersten Antikörper. Zur Präzipitation der Antigen-Antikörper-Komplexe wird ein zweiter unspezifischer Antikörper verwendet
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Radioisotope des Tritiums (Betastrahler) oder des Jods (Gammastrahler) werden in das Steroid- oder Proteinhormon eingebaut („Markierung“), was die Immunreaktivität des Hormons nicht beeinflussen sollte. Tracer und Analyt bzw. Standardhormon konkurrieren nun um die Bindungsstellen am Antikörper. Die Mengen an eingesetztem Tracer und Antikörper bleiben konstant. Für die Standardkurve werden die Konzentrationen an Standardhormon schrittweise erhöht. Die Reaktionen laufen nun in den Teströhrchen so lange ab, bis sich ein Reaktionsgleichgewicht eingestellt hat. Danach wird das ungebundene, freie Hormon von den Antikörperhormonkomplexen abgetrennt. Die von den gebundenen Antikörperhormonkomplexen emittierte Radioaktivität wird gemessen und die Standardkurve erstellt. Ausgehend von Standard 0, bei dem eine maximale Tracermenge vom Antikörper gebunden wird, nimmt mit steigender Konzentration an Standardhormon die Menge an antikörpergebundenem Tracer reziprok ab (Abb. 2).
Abb. 2
Linearisierter Plot mit Standarddaten eines Radioimmunoassays (RIA). Der Hormongehalt einer Probe kann über die X-Achse ermittelt werden, die die prozentuale Bindung (hier 50 %) angibt. Kalkulationen von der Regressionslinie werden generell mithilfe eines Computers durchgeführt. Ak Antikörper, H Standardhormon, H* radioaktiv markiertes Hormon
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Die beim RIA verwendeten Antikörper gehören hauptsächlich zu der Gammaglobulin(IgG)-Klasse der Immunglobuline und sind entweder monoklonaler oder polyklonaler Natur. Um die Kreuzreaktivität mit strukturähnlichen Hormonen gering zu halten, sollte der Antikörper spezifisch für das zu untersuchende Hormon sein. Dies wird erreicht über die sog. Paratope im variablen Bereich der V-Domäne beim Antikörper, die ein bestimmtes Epitop beim Hormon erkennen und nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip binden. Die Bindung erfolgt über nonkovalente Kräfte. Daher sind, wie bei einer Enzym-Substrat-Reaktion, die Bindungen reversibel.
Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern wird das reine Hormon in bestimmte Tierspezies (meistens Kaninchen) injiziert. Kleine Moleküle (Haptene) wie Steroide, Peptidhormone oder Prostaglandine besitzen kaum oder keine Antigenität. Sie müssen für die Immunisierung kovalent an einen immunogenen Carrier (wie z. B. Albumin oder Hämocyanin) gekoppelt werden, um eine immunologische Antwort zu erzielen. Um eine starke Immunantwort zu provozieren, werden Hormone (Proteohormone oder carriergekoppelte Hormone) zusammen mit einem sog. Adjuvans injiziert. Im Anschluss an die Grundimmunisierung folgen in etwa 4-wöchigen Abständen Booster-Injektionen, um den Antiserumtiter und die Antiserumavidität (Bindungsstärke) zu erhöhen.
Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist komplizierter. Wie bei der Gewinnung polyklonaler Antikörper wird eine bestimmte Tierspezies (meistens Mäuse) mit Hormon oder carriergekoppeltem Hormon immunisiert. Danach werden Milzzellen, die nur einen einzigen Antikörpertyp sezernieren (aus einem einzigen B-Zell-Klon = monoklonal), isoliert und mit Myelomazellen fusioniert. Diese immortalisierten Hybridomazellen verbleiben in Kultur und stellen somit eine kontinuierliche Antikörperquelle dar.
Vor der Radioaktivitätsmessung ist es erforderlich, die Antikörperhormonkomplexe vom freien, ungebundenen Hormon zu trennen. Eine geeignete und bei vielen kommerziell erhältlichen Kits verwendete Methode ist die Festphasentrennung. Hierbei sind die Wände der eingesetzten Teströhrchen vorab mit dem spezifischen Antikörper beschichtet. Ein Zentrifugationsschritt ist nicht erforderlich und das ungebundene Hormon wird mit dem Überstand dekantiert. Bei der Adsorptionsmethode bindet das freie Hormon an bestimmte Oberflächen, wie z. B. dextranumhüllte Aktivkohle oder Silikate, das dann durch Zentrifugation von der gebundenen Fraktion getrennt wird. Die Methode der Präzipitation basiert auf der Zugabe eines zweiten Antikörpers, der den ersten spezifisch erkennt und bindet. Durch Zentrifugation pelletiert der Antikörperhormonkomplex am Boden des Teströhrchens und das freie Hormon und freier Tracer verbleiben im Überstand. Nach Zentrifugation wird die Radioaktivität im Präzipitat gemessen.
Weitere Verfahren, die auf einem ähnlichen Prinzip wie Radioimmunoassays basieren, sind der Proteinbindungsassay, der „Scintillation Proximity Assay“ (SPA), der Enzymimmunoassay (EIA), der Fluoroimmunoassay (FIA) und der Chemolumineszenzassay (CIA). Der primäre Unterschied zwischen diesen Methoden besteht im physikalischen Prinzip des Nachweises von gebundenen Assay-Komponenten. Beim EIA, FIA und CIA ist das radioaktive Hormon durch einen enzym-, fluoroeszein- oder luminolmarkierten Liganden ersetzt. Die Quantifizierung erfolgt beim FIA durch ein Fluorometer und beim CIA durch ein Luminometer, während beim EIA durch den Enzym-Substrat-Abbau die Werte im Fotometer errechnet werden.
Im Gegensatz zu den kompetitiven Assays, bei denen der Antikörper durch seine konstante Konzentration limitierend wirkt, wird beim Antikörper-Exzessimmunoassay der spezifische Antikörper im Überschuss zugegeben. Der immunoradiometrische Assay (IRMA) und der enzymgebundene Immunosorbent Assay (ELISA, Abb. 3) stellen solche Exzessimmunoassays dar. Bei beiden Assays findet die sog. Sandwichtechnik Anwendung, bei der der Ligand bzw. das Hormon von zwei Antikörpern an unterschiedlichen Epitopen gebunden wird. Der erste Antikörper (Fängerantikörper) ist dabei kovalent oder adsorptiv an eine feste Phase gekoppelt. Der zweite Antikörper (Detektionsantikörper) ist beim IRMA radioaktiv markiert und beim ELISA mit einem Enzym konjugiert, das ein colorimetrisch nachweisbares Substrat abbaut.
Abb. 3
Schematische Darstellung eines ELISA. Im ersten Schritt bindet der immobilisierte Antikörper das in Lösung schwimmende Antigen. Im zweiten Schritt bindet ein enzymgekoppelter Antikörper sekundär an das Antigen. Im dritten Schritt kommt es durch das Enzym zum Substratumsatz, anhand dessen die Antigenkonzentration bestimmt werden kann
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Nichtradioaktive Verfahren wie ELISA verbreiten sich immer mehr, weil sie kostengünstiger und weniger belastend für Personal und Umwelt sind. Allerdings ist der ELISA im Allgemeinen weniger sensitiv als der RIA.
Chromatografische und massenspektrometrische Nachweismethoden
Chromatografische Trennverfahren erlauben die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase. Die Proben werden im Allgemeinen in einer flüssigen oder gasförmigen sog. mobilen Phase aufgenommen und dann über die stationäre Phase geleitet. In Abhängigkeit von der Wechselwirkung zwischen dem Analyten und mobiler sowie stationärer Phase eluieren die Komponenten in einer charakteristischen zeitlichen Abfolge. Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher chromatografischer Techniken. Derzeit finden chromatografische Techniken vor allem im Rahmen der Gaschromatografie (GC, Abb. 4) sowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie („high performance liquid chromatography“, HPLC) mit unterschiedlichen Detektionsverfahren Anwendung.
Abb. 4
Prinzip des gaschromatografischen Analysenvorgangs. Das Probengemisch (im Lösungsmittel A gelöste Stoffe B und C) wird verdampft (1). In der Säule (Kapillare) erfolgt die Auftrennung des Stoffgemisches (2). Am Säulenausgang erfolgt die Detektion und über die Auswerteinheit die Aufzeichnung in einem Chromatogramm (3)
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Ein Massenspektrometer ist ein Gerät, mit dessen Hilfe Moleküle in gasförmige Ionen überführt werden. Die Ionen werden entsprechend ihrem Verhältnis Masse zu Ladung (m/z) im Hochvakuum aufgetrennt. Die relative Häufigkeit (Intensität) dieser Ionen wird aufgezeichnet. Grundsätzlich weisen alle Massenspektrometer den gleichen Aufbau auf. Sie bestehen aus einem Einlasssystem, der Ionenquelle, einem Analysator, in dem die entstandenen Ionen massenspezifisch getrennt werden und der Registriereinheit, dem Detektor (Abb. 5).
Abb. 5
Funktionelle Komponenten eines Massenspektrometers
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Bei der GC-MS-Kopplung (Gaschromatografie mit massenspektrometrischer Detektion) werden, im Gegensatz zu den klassischen Detektoren der GC (wie z. B. dem Flammenionisationsdetektor), direkte, strukturbezogene Daten der zu analysierenden Substanzen erhalten. Die GC übernimmt die Aufgabe, die Substanzen aus dem Probengemisch aufzutrennen. Identifizierung und Quantifizierung erfolgen mittels der Massenspektrometrie.
In der Steroidanalytik stellt die GC-MS eine bewährte Technik dar, um Steroidmetaboliten sicher zu identifizieren oder neu zu beschreiben. So handelt es sich beispielsweise bei der GC-MS-Multisteroidanalyse aus Harn um ein nichtinvasives, hochspezifisches und rasches Analyseverfahren, das immer dann eingesetzt werden sollte, wenn Störungen im Steroidstoffwechsel vermutet werden (Abb. 6). Leistungsfähige Methoden erlauben die simultane Bestimmung von bis zu ca. 50 Harnsteroidmetaboliten und daraus eine umfassende Charakterisierung (Androgene, Östrogene, Progesteronmetaboliten, Kortisolmetaboliten, Aldosteronvorstufen) des menschlichen Steroidstoffwechsels. Aus der Konstellation der Metaboliten (Metabolom) kann „nichtselektiv“ (vorurteilsfrei) auf die zugrunde liegende Störung im Steroidstoffwechsel geschlossen werden.
Abb. 6
GC-MS-Harnsteroid-Metabolomanalyse (Scanläufe) eines Patienten mit 21-Hydroxylase-Mangel (a) und eines gesunden Mädchens (b). Die arabischen Zahlen geben interne Standards an. Das Steroidprofil des Patienten wird dominiert durch die Metaboliten des 17-Hydroxyprogesteron (PO-5β, 3d 17-Hydroxypregnanolon, PT Pregnantriol) und des 21-Deoxykortisols (11-O-PT 11-Oxo-Pregnantriol). Die Exkretion der Glukokortikoidmetaboliten ist eher niedrig (THF Tetrahydrokortisol, 5α-THF 5α-Tetrahydrokortisol, THE Tetrahydrokortison)
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Die GC-MS-Harnsteroid-Metabolomanalyse erlaubt die Diagnostik praktisch aller adrenaler Enzymstörungen im Steroidstoffwechsel. Steroidbestimmungen im Harn gewährleisten auch als zeitlich integrale Parameter eine exzellente Therapiekontrolle.
Wenn statt vollständiger Massenspektren nur die Ionenströme einzelner ausgewählter Massen registriert werden, erzielt man eine erhebliche Steigerung der Empfindlichkeit. Verwendet man stabilisotopmarkierte Analoga der Analyten als interne Standards, spricht man von Isotopenverdünnungs/-Gaschromatografie-Massenspektrometrie (ID/GC-MS). Auf dem Prinzip der ID/GC-MS beruhen Methoden, die in der Qualitätssicherung den Goldstandard zur Überprüfung von Immunoassays darstellen (Referenzmethoden).
Schaltet man zwei Massenspektrometer hintereinander, spricht man von Tandemmassenspektrometrie (TMS) oder MS/MS. Die zu bestimmende Probe wird im ersten Massenspektrometer ionisiert. Dabei entsteht eine sehr große Anzahl verschiedener Ionen, von denen jene Masse im ersten Massenspektrometer ausgewählt wird, die die substanzspezifischen Ionen enthält. Die ausgewählten Ionen werden dann in eine Stoßkammer geleitet, wo sie mit einem neutralen Gas zusammenstoßen und weiter zerfallen. Diese Zerfallsprodukte werden im nachgeschalteten zweiten Massenspektrometer weiter aufgetrennt und registriert. Die meisten Tandemmassenspektrometer sind sog. Triple-Quadrupolgeräte.
Die Tandemmassenspektrometrie hat beispielsweise Einzug gehalten in das Neugeborenenscreening. Die Kopplung mit der Flüssigkeitschromatografie (LC-MS/MS) macht diese Technik für Anwendungen im klinischen Bereich interessant. Im Rahmen eines einzigen Messvorgangs können komplexe Metabolitenkonstellationen erfasst und potenziell bis zu ca. 30 Stoffwechseldefekte erkannt werden (z. B. Phenylketonurie, Fettsäureoxidationsdefekte, Organoazidopathien). Auf dem Gebiet der Steroidanalytik wurden Anwendungen der LC-MS/MS für Serumsteroide beschrieben. Auf dem Gebiet der Harnsteroidanalytik reicht das analytische Potenzial der LC-MS/MS nicht an das der GC-MS heran.
Zuverlässigkeit und Validierung von Hormonassays
Die analytischen Methoden werden nach ihrer Qualität in Routine- und Referenzmethoden eingeteilt. Bei Routinemethoden handelt es sich um Methoden mit einer für die Anwendung hinreichenden Praktikabilität und Zuverlässigkeit. Unter einer Referenzmethode versteht man ein sorgfältig geprüftes Messverfahren zur Bestimmung einer oder mehrerer Parameter, bei dem alle Bedingungen und Abläufe exakt beschrieben sind und welches aufgrund seiner Richtigkeit und Präzision geeignet ist, andere Methoden zur Bestimmung derselben Parameter auf Genauigkeit zu überprüfen.
Wichtige Kriterien zur Beurteilung der Leistungsfähigkeit einer Methode sind Präzision, Richtigkeit, Sensitivität und Spezifität.
Die Präzision eines Assays gibt die Reproduzierbarkeit der Messung eines Analyten in verschiedenen Konzentrationsbereichen an. Man unterscheidet die Intraassay-Präzision (Wiederholpräzision oder Präzision in Serie) von der Interassay-Präzision (Präzision von Serie zu Serie). Die Intraassay-Präzision ist ein Parameter für die Übereinstimmung der Messergebnisse unter Wiederholbedingungen. Die Interassay-Präzision gibt die Übereinstimmung der Messergebnisse bei Bestimmungen aus dem gleichen Material und in demselben Laboratorium in konsekutiven Serien an. Die Richtigkeit beschreibt die Übereinstimmung zwischen dem Mittelwert von Wiederholungsmessungen und dem wahren Wert.
Die analytische Spezifität einer Methode charakterisiert ihr Potenzial, nur den gesuchten Analyten zu erfassen. Andere Probenbestandteile sollen das Ergebnis der Analyse nicht verfälschen.
Unter analytischer Sensitivität versteht man die Eigenschaft einer Methode, benachbarte Konzentrationswerte zu unterscheiden. Sie zeigt, inwieweit sich ein Wert in Abhängigkeit vom Signal des zu messenden Systems verändert. Unter Nachweisgrenze versteht man die untere Grenze des Messbereiches. Diese wird als das sicher vom Untergrund zu unterscheidende Messergebnis definiert.
Nach der Entwicklung eines Assays zur Hormonbestimmung muss zur korrekten Interpretation der Ergebnisse auch der Einfluss mehrerer physiologischer Variablen berücksichtigt werden (Tab. 1). Einige Hormone zeigen eine zirkadiane Rhythmik, andere zeigen beispielsweise einen stressabhängigen Anstieg.
Tab. 1
Einfluss physiologischer Parameter auf Hormonkonzentrationen
Hormonbestimmungen sind teilweise erheblich methodenabhängig. Referenzwerte können nicht ohne Weiteres von Labor zu Labor übertragen werden. Es ist daher nötig, für zu messende endokrine analytische Parameter Referenzwerte in einer gesunden Population zu erstellen. Im Idealfall sollte zur Erstellung des Referenzbereiches die gleiche Methode Einsatz finden wie bei der Bestimmung der Proben und der Einfluss von Parametern wie Geschlecht, Alter und Tageszeit berücksichtigt werden (Tab. 2).
Tab. 2
Klinische Situationen, die jeweils eigene Referenzbereiche für Hormonmessungen erfordern
Umrechnung konventioneller Einheiten in SI-Einheiten: mit dem Umrechnungsfaktor multiplizieren. Umrechnung der SI-Einheiten in konventionelle Einheiten: durch den Umrechnungsfaktor dividieren
Prä- und postanalytische Aspekte bei der Hormonbestimmung
Bereits präanalytisch können sich die zu bestimmenden Messparameter verändern. Wir unterscheiden endogene und exogene Einflussfaktoren:
Zu den endogenen Einflussfaktoren zählen unabänderliche biologische Gegebenheiten oder unabänderliche individuelle Eigenschaften. Beispiele hierfür sind das Geschlecht, das Patientenalter, Biorhythmen, genetische Einflüsse oder Schwangerschaft.
Exogene Einflussgrößen lassen sich zumindest auf lange Sicht beeinflussen durch den Patienten oder den Arzt. Beispiele hierfür sind Lebensgewohnheiten, die Ernährung, Körpergewicht, der Grad der körperlichen Aktivität, psychisch und stressbedingte Veränderungen etc.
Für eine Reihe von Parametern sind besondere Störfaktoren zu beachten, die bereits bei der Blutentnahme (z. B. Körperlage, Tageszeit der Probennahme), beim Probentransport (geeignete Temperatur, Lichtempfindlichkeit) zu beachten sind. Bestimmte Parameter erfordern spezielle konservierende Maßnahmen (z. B. Säurezusatz bei Bestimmung von Katecholaminen im 24-h-Urin). Analytische Interferenzen können bedingt sein durch Einflüsse von Hämolyse oder Trübungen aber auch durch Medikamente.
Zufällige und systematische Fehler können die Analysenergebnisse beeinflussen. Um diese so weit wie möglich zu minimieren, sind Qualitätskontrollmaßnahmen erforderlich. Die Ergebnisse von Qualitätskontrollmessungen müssen dokumentiert werden. Es sollte in den Laboratorien ein Regelwerk vorgehalten werden, das eine Qualitätsnachweisführung erlaubt.
In der Ergebnismitteilung muss eine eindeutige Zuordnung zum Patienten erfolgen. Ferner müssen das Untersuchungsmaterial eindeutig angegeben und die Resultate unmissverständlich mitgeteilt werden. Die Analysenresultate müssen dokumentiert werden.
Praktische Aspekte
Kasuistik zur Diagnostik des 21-Hydroxylase-Mangels im Neugeborenenalter
Bei einem reifen männlichen Neugeborenen wird am 4. Lebenstag das Neugeborenenscreening abgenommen und ein überhöhter Wert für 17-Hydroxyprogesteron festgestellt. Zur Konfirmationsdiagnostik wird das Baby in einer Universitätskinderklinik vorgestellt. Mit dem dort vorgehaltenen Immunoassay für 17-Hydroxyprogesteron wird ein erhöhter Wert von 832 ng/dl gemessen und der Verdacht auf ein adrenogenitales Syndrom (AGS) geäußert.
Daraufhin holen die Eltern eine zweite Meinung an einer weiteren Universitätskinderklinik ein. Bei der dort durchgeführten Untersuchung findet sich mit dem in diesem Haus vorgehaltenen Assay ein Serum-17-Hydroxyprogesteron-Wert von 1954 ng/dl. Im Serum beträgt die Natriumkonzentration 138 mmol/l und die Kaliumkonzentration 5,5 mmol/l. Zeitgleich wird eine Spontanurinprobe (5 ml) zur Erstellung einer GC-MS-Harnsteroid-Metabolomanalyse eingesendet. Dieses zeigt eine für ein Neugeborenes unauffällige Metabolitenkonstellation, die AGS-Parameter sind nicht erhöht, die Kortisolmetaboliten sind normal. Es dominieren sog. Foetalzonensteroide, das sind während der Neugeborenenperiode ausgeschiedene 5-en-Steroide.
Kommentar: Die Antikörper der Immunoassays für 17-Hydyroxyprogesteron zeigen eine erhebliche Kreuzreaktivität gegenüber den in großer Menge vom Neugeborenen produzierten Foetalzonensteroiden. Die physikalisch-chemische Bestimmungsmethode der GC-MS ist unabhängig vom Phänomen der Kreuzreaktivität und damit wesentlich spezifischer.
Fallstricke bei der Bestimmung von Wachstumsfaktoren
Insulin-like-growth-factor-I(IGF-I)-Messungen im Serum werden vor allem in der Diagnostik von Wachstumsstörungen eingesetzt. IGF-I (und IGF-II) sind in der Zirkulation an IGF-Bindungsproteine (IGFBP-1 bis -6) gebunden. Die IGFBP interferieren in Immunoassays massiv und müssen durch geeignete Maßnahmen ausgeschaltet werden. Eine etablierte Methode bei der Messung von IGF-I ist die Blockierung durch einen Überschuss an IGF-II. In Serum oder EDTA-Plasma sind IGF-I und IGFBP relativ stabil, was die Probenbehandlung und -verschickung (bei Raumtemperatur) einfach macht.
Das quantitativ dominierende IGFBP ist IGFBP-3. Der wichtigste Regulator für IGF-I und IGFBP-3 ist das Wachstumshormon (STH, somatotropes Hormon), das einen stimulierenden Effekt hat. Bei einem ausgeprägten STH-Mangel sind IGF-I und IGFBP-3 erniedrigt, bei Akromegalie und hypophysärem Gigantismus erhöht. Bei der Interpretation der Ergebnisse muss die starke Altersabhängigkeit mit einem hohen Gipfel während der Pubertät, besonders von IGF-I, berücksichtigt werden. Neben STH beeinflussen eine Reihe anderer Hormone und Faktoren die IGF-I- und IGFBP-3-Spiegel im Serum. Erniedrigte Werte finden sich vor allem bei Nahrungskarenz, Malabsorption, schweren Erkrankungen (systemische entzündliche Erkrankungen, maligne Erkrankungen), nach schwerem Trauma, bei Leberinsuffizienz, bei unbehandeltem Diabetes mellitus oder bei Hypothyreose. Erhöhte Werte finden sich bei Niereninsuffizienz, Pubertas praecox oder ausgeprägter Adipositas (trotz niedrigem STH). Die Interpretation der Serumspiegel muss notwendigerweise solche Störungen berücksichtigen. Dies wird häufig übersehen.
IGF-I- und IGFBP-3-Messungen werden auch zum Monitoring einer STH-Therapie eingesetzt. Supranormale Werte von IGF-I sollten wegen des potenziell stimulierenden Effekts auf Neoplasien vermieden werden. Ein unzureichender Anstieg während der STH-Therapie kann auf Non-Compliance hinweisen. In diesem Zusammenhang ist die Pharmakodynamik zu berücksichtigen. Bei Patienten mit Wachstumshormonmangel fallen nach Aussetzen der STH-Gaben die IGF-I-Spiegel relativ rasch (1–3 Tage) auf niedrige Ausgangswerte zurück. IGFBP-3 ist in dieser Hinsicht robuster. Der Abfall zieht sich über Tage bis eine Woche hin.
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