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Uroonkologie
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Publiziert am: 29.11.2019

Molekulare Grundlagen der Karzinogenese und molekularbiologische Untersuchungsmethoden

Verfasst von: Michèle J. Hoffmann, Helge Taubert und Kerstin Junker
Durch die Entwicklung von zielgerichteten Medikamenten („targeted drugs“), deren Wirksamkeit auf der Inhibition bedeutsamer biologischer Prozesse der Tumorzellen und anderer Zellen im Tumor beruht, hat die Kenntnis molekularer Veränderungen solider Tumoren einen neuen Stellenwert im klinischen Alltag erhalten. Darüber hinaus bilden sie die Grundlage der „molekularen Diagnostik“. Diese eignet sich nicht nur zum Nachweis von Tumoren, sondern wird uns in die Lage versetzen, die Prognose und das Therapieansprechen für den einzelnen Patienten individuell zu definieren. Dies kann z. B. für die Einschätzung der Prognose nach operativer Therapie, die Wahl einer Therapie (z. B. adjuvant) oder die Auswahl von „targeted drugs“ genutzt werden.
Durch die Entwicklung von zielgerichteten Medikamenten („targeted drugs“), deren Wirksamkeit auf der Inhibition bedeutsamer biologischer Prozesse der Tumorzellen und anderer Zellen im Tumor beruht, hat die Kenntnis molekularer Veränderungen solider Tumoren einen neuen Stellenwert im klinischen Alltag erhalten. Darüber hinaus bilden sie die Grundlage der „molekularen Diagnostik“. Diese eignet sich nicht nur zum Nachweis von Tumoren, sondern wird uns in die Lage versetzen, die Prognose und das Therapieansprechen für den einzelnen Patienten individuell zu definieren. Dies kann z. B. für die Einschätzung der Prognose nach operativer Therapie, die Wahl einer Therapie (z. B. adjuvant) oder die Auswahl von „targeted drugs“ genutzt werden.
Die folgenden Abschnitte geben eine Übersicht über die molekularen Grundlagen von Krebserkrankungen. Darüber hinaus werden relevante molekularbiologische Techniken dargestellt. Spezifische molekulare Veränderungen und deren klinische Bedeutung sind den einzelnen Organkapiteln zugeordnet.

Molekulare Grundlagen der Karzinogenese

Charakteristische Eigenschaften von Tumorzellen

Für die neoplastische Transformation einer normalen Zelle sind zahlreiche genetische und epigenetische Veränderungen erforderlich. Die Zahl an Veränderungen ist nicht genau bekannt und variiert von Tumor zu Tumor. Systematische Sequenzanalysen von Tumor-DNA haben 1000–10.000 Punktmutationen in einigen Karzinomen ergeben; in unterschiedlichem Maße treten dazu numerische und strukturelle chromosomale Aberrationen, Verluste, Zugewinne und Rearrangements auf.
Dabei sind Tumorzellen aus molekularbiologischer Sicht durch folgende Charakteristika gekennzeichnet (Hanahan und Weinberg 2000):
  • Selbstversorgung mit Wachstumssignalen
  • Unempfindlichkeit gegenüber wachstumsinhibitorischen Signalen
  • Umgehung der Apoptose
  • Unbegrenztes replikatives Potenzial
  • Fortwährende Angiogenese
  • Gewebsinvasion und Metastasierung.
Gegenwärtig werden auch die folgenden Faktoren zu den Charakteristika gezählt (Hanahan und Weinberg 2011):
  • Genomische Instabilität und Mutationen
  • Tumor-fördernde Entzündung
  • Spezifische Veränderungen des Energie- & Intermediärstoffwechsels
  • Veränderte Immunantwort.
Diese Eigenschaften werden durch Veränderungen in bestimmten Genen hervorgerufen. Dazu zählen die positiv regulierenden, d. h. proliferationsfördernden Protoonkogene, und die negativ regulierenden, proliferationshemmenden Tumorsuppressorgene. Bei beiden Gruppen handelt es sich um zelleigene Gene. Sie wirken als Bestandteile bestimmter zellulärer Regulationssysteme, besonders der Zellzyklusregulation.

Onkogene

Die Protoonkogene wirken physiologisch positiv regulierend auf z. B. Wachstum und Proliferation von Tumorzellen. Sie können für eine Reihe verschiedener Proteine wie Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Signaltransduktoren (G-Proteine), Proteinkinasen oder Transkriptionsfaktoren kodieren. Somatische Mutationen der Protoonkogene führen zu ihrer Aktivierung zum Onkogen und so z. B. zur unkontrollierten Proliferation (Beispiele sind u. a. FGFR3, MET, KIT, RAS-Gene, MYC, CTNNB1). Die Mutationen können Proteine mit veränderten Eigenschaften erzeugen und so auch zur Überproduktion eines veränderten Onkoproteins führen.

Tumorsuppressorgene

Eine Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG) erfordert in der Regel Veränderungen beider Allele. Dies kann durch eine Kombination von Punktmutationen, Genverlusten durch Chromosomenaberrationen oder einen epigenetischen Mechanismus, die DNA-Hypermethylierung, erfolgen (Jones und Baylin 2002). Dabei treten bei sporadischen Tumoren die Veränderungen beider Allele voneinander unabhängig auf. Bei familiären Formen wird ein mutiertes Allel von einem Elternteil ererbt. Das mutierte Allel ist dabei auf der Ebene der einzelnen Zelle in der Regel rezessiv: erst wenn das verbleibende intakte Allel durch eine zweite – somatische – Mutation inaktiviert wird, kommt es zur Tumorentstehung. In Tumoren häufig inaktivierte TSG sind z. B. RB1, TP53, CDKN2A (p16INK4A), APC, PTEN, VHL, BRCA1/2.
Die Deregulation von Protoonko- und Tumorsuppressorgenen im Tumor liegt wesentlich der ungehemmten Proliferation als charakteristischem Merkmal von entarteten Zellen zugrunde. An der Kontrolle der Proliferation ist eine Reihe von Faktoren beteiligt. Dazu gehören extrinsische, z. B. parakrine Wachstumsfaktoren und Signale von anliegenden Zellen (Zell-Zell-Kontakt) sowie intrinsische Faktoren. Diese Signale müssen über Signalketten zum Zellkern übertragen werden, wo die Replikationskontrolle stattfindet. In vielen dieser Kaskaden sind Onkogene als positive, Tumorsuppressorproteine dagegen als negative Regulatoren zu finden. Tumorsuppressoren, die direkt die zelluläre Proliferation oder Apoptose kontrollieren, kann man als „gatekeeper“ betrachten, während andere Tumorsuppressoren als „caretaker“ das Genom stabilisieren. Letztere sind v. a. an Zellzyklus-„Checkpoints“ oder der DNA-Reparatur beteiligt.

Tumor-Epigenetik

Der Begriff Epigenetik ist eine Kombination der altgriechischen Wörter: ὲπΐ (epi) dazu, außerdem, auf, über und γɛνɛά (geneá) Abstammung. Er umfasst alle Prozesse in einer Zelle, die als „zusätzlich“ zu den Inhalten und Vorgängen der Genetik gelten und er wurde erstmals von Conrad Hal Waddington 1942 gebraucht (Waddington 1942). Heute fassen wir unter Epigenetik alle vererbbaren Prozesse zusammen, die nicht durch Veränderungen in der DNA-Sequenz (wie z. B. Mutationen) verursacht werden, aber einen Einfluss auf die Genexpression bzw. die Proteintranslation haben, wie z. B. DNA-Modifikationen, Histonmodifikationen, RNA-Methylierungen und nicht-kodierende RNAs (ncRNAs).
Neben Punktmutationen und chromosomalen Veränderungen tragen auch epigenetische Veränderungen ohne solche Sequenzveränderungen zu einer vererbbaren Veränderung eines Genexpressionszustandes und somit zur Entstehung unterschiedlicher Phänotypen und zu Tumorentstehung und -progression bei. Diese Regulation erfolgt durch mehrere miteinander interagierende Mechanismen, die DNA-Methylierung, Histonmodifikationen, RNA-Methylierung sowie transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulation durch RNAs, die für kein Protein kodieren (Abb. 1). Zu diesen „nichtkodierenden“ RNAs zählen z. B. die micro-RNAs (miRNAs) und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) (Dawson und Kouzarides 2012). Epigenetische Veränderungen in Tumoren können entsprechend die Muster von DNA-Methylierung und Histonmodifikationen betreffen sowie die aberrante Expression von nichtkodierenden RNAs. Die Ursachen dieser Veränderungen liegen z. T. in Mutationen oder Fehlexpression epigenetischer Regulatorproteine, darunter DNA-Methyltransferasen, Histonacetyltransferasen, Histondeacetylasen, Histonmethylasen, Histondemethylasen sowie von Faktoren, die an der Umorganisation von Nukleosomen (Remodellierung) beteiligt sind. Überexpression oder Expressionsverlust von regulatorischen RNAs kann je nach Tumorart ebenfalls onkogen oder tumorsuppressiv wirken.

DNA Methylierung

Beim Menschen versteht man unter DNA-Methylierung in der Regel eine kovalent gebundene Methylgruppe, die hauptsächlich an Zytosinen (5-Methylzytosin) in CpG-Dinukleotiden vorkommt, in normalen Zellen vorwiegend an CpG-Dinukleotiden im Bereich von heterochromatischen repetitiven Sequenzen und Retroelementen (z. B. LINE-1) (Baylin und Jones 2016). Cluster von CpG-Dinukleotiden, sog. CpG-Inseln findet man z. B. in Genpromotoren und diese sind regulär unmethyliert. Die DNA-Methylierung bleibt über die Zellteilung hinweg erhalten, indem der elterliche Strang als Vorlage für die DNA-Methyltransferase DNMT1 dient, die die Methylierung des Tochterstranges vermittelt. DNA-Methylierung gilt im Vergleich zu anderen epigenetischen Modifikationen als stabil, kann aber durch passive und aktive Mechanismen (z. B. TET-Dioxygenasen durch Oxidation zu 5-Hydroxymethylcytosin) entfernt werden (Baylin und Jones 2016). DNA-Methylierung reguliert zentrale Prozesse wie genomisches Imprinting oder X-Chromosom Inaktivierung. Physiologisch finden im humanen Organismus zwei Phasen mit umfangreichen Methylierungsveränderungen statt; während der Gametogenese wird in den Keimzellen das sog. Imprinting gelöscht und in den reifenden Gameten neu gesetzt, im Zuge der Embryonalentwicklung werden de novo-Methylierungen von den DNMT3-Enzymen (A und B) nach der Implantation eingeführt. Ein Verlust des Imprintings kann zu Fehlentwicklungen führen (z. B. Beckwith-Wiedemann Syndrom), tritt aber auch bei manchen Tumorerkrankungen auf (Feinberg und Tycko 2004).
In Tumorzellen findet man verschiedene Veränderungen des DNA-Methylierungsmusters, die durchaus gewebespezifisch ausgeprägt sein können, wie eine genomweite Hypomethylierung repetitiver Sequenzen, die zu genomischer Instabilität und aberranter Transkription (Neoantigene) beiträgt. Gleichzeitig findet man häufig fokale Hypermethylierungen in Promotorbereichen von Genen, die dadurch transkriptionell inaktiv werden. Hiervon können auch Tumorsuppressorgene betroffen sein (z. B. p16INK4A), aber vor allem Differenzierungs-assoziierte Faktoren und Polycomb-Zielgene wie z. B. HOX-Gene, wodurch aberrante Differenzierung und veränderte Zellschicksale von Tumorzellen vermittelt werden. Therapeutisch lässt sich Hypermethylierung durch DNA-Methyltransferase-Inhibitoren wie z. B. 5-aza-2′-Deoxycytidin (Decitabin) rückgängig machen (Jones et al. 2016). Veränderungen der DNA-Methylierung korrelieren häufig mit veränderten Histonmodifikationen, so weisen Polycomb-Zielgene neben der DNA-Hypermethylierung auch häufig Trimethylierungen am Histon H3 Lysin 27 (H3K27) auf (Baylin und Jones 2016).

Histonmodifikationen

Histone sind basische Proteine, die im Zellkern von Lebewesen mit einem Zellkern (Eukaryoten) vorliegen. Sie verpacken die DNA. In Abhängigkeit vom Ausmaß der Verpackung können Gene unterschiedlich in RNA umgeschrieben (transkribiert) werden.
Vergleichbar zur DNA-Methylierung gibt es bei den Histonen als Modifizierung vor allem Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen. Bei den Histonen verläuft der Modifikationsprozess in 3 Stufen ab: dem Setzen einer Modifikation („Writing“), dem Überarbeiten der Modifikation („Editing“) und dem Lesen der Modifikation („Reading“) (Abb. 2).
Histonmodifikationen werden anhand des modifizierten Histons, der im Histon modifizierten Aminosäure und der Art der Modifizierung bezeichnet. So bedeutet z. B. H3Kme1, das Histon H3 ist am Lysin (Proteinkode für Lysin ist K) einfach methyliert. Generell lassen sich Histonmodifikationen unterscheiden, die einen aktivierenden oder unterdrückenden Einfluss auf die Transkription haben können. Exemplarisch sei hier genannt, aktivierender Einfluss: H3 Acetylierung und H3K4me3 währenddessen einen unterdrückenden Einfluss haben: H3 Deacetylierung, H3K9me2, H3K9me3, H3K27me3. Bei der Mutationsanalyse für Nierenzellkarzinome konnten zahlreiche Mutationen in den Genen für Histonmethyltransferasen, Lysin-spezifischen Demethylasen und Histonacethyltransferasen identifiziert werden (Ricketts et al. 2018). Da zahlreiche Tumorzellen Histon-Deacetylasen (HDACs) verstärkt exprimieren, spielen in der Tumorbehandlung zunehmend Histon-Deacetylasehemmer (HDACi) eine Rolle. So wurde der HDAC-Inhibitor Panobinostat 2015 in der EU (europäischen Arzneimittelagentur EMA) zur Behandlung des Multiplen Myeloms zugelassen.

Lange nicht kodierende RNAs

Aus den Ergebnissen von Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen weiß man, dass das humane Genom für tausende RNA-Transkripte kodiert, die nicht in Proteine translatiert werden, obwohl sie mit mRNAs vergleichbare Eigenschaften haben (Mercer und Mattick 2013). Diese heterogene Gruppe von Molekülen wird im Wesentlichen über ihre Größe definiert, alle nicht-kodierenden Transkripte mit einer Länge von mehr als 200 Nukleotiden werden als sog. lange nicht-kodierende RNAs (lncRNA) von kürzeren nicht-kodierenden Transkripten, wie z. B. microRNAs, unterschieden. lncRNAs werden häufig stark gewebespezifisch exprimiert und sind funktionsabhängig z. B. an der dynamischen Remodellierung des Chromatins im Zellkern beteiligt, indem sie regulatorische Proteine wie z. B. Polycomb-Proteine rekrutieren und DNA-Methylierung, Histon-Modifikationen und schließlich Genexpression beeinflussen. Daher gelten sie als eine neue Gruppe epigenetischer Regulatoren, die die Feinregulation von Zellschicksalen vermitteln können. Bei der funktionellen Untersuchung von lncRNAs in Tumoren konnte gezeigt werden, dass ihre aberrante Expression zur Entstehung maligner Phänotypen beiträgt (Fatica und Bozzoni 2014). Aktuelle Arbeiten belegen, dass lncRNAs auch für die Biologie urologischer Tumore, wie z. B. das Nierenzellkarzinom und das Prostatakarzinom eine wesentliche Rolle spielen (Liu et al. 2018; Xu et al. 2018).

miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) bezeichnen die kürzeren, 22–25 Nukleotide langen nicht-kodierenden regulatorischen RNAs. Sie sind hoch konserviert und in allen eukaryotischen Zellen vorhanden. Die aktuelle Ausgabe der miRBase (Version 22) umfasst 38589 humane miRNAs (Kozomara und Griffiths-Jones 2014). MiRNAs werden durch Introns und Exons kodiert (Ha und Kim 2014). Nach der Prozessierung der primären Vorläufer (precursor) miRNA (pri-miRNA) über mehrere Schritte wird die reife einsträngige miRNA in den RISC (RNA-induced silencing complex) Komplex geladen. So kann die miRNA an die Ziel-mRNA binden. Dadurch wird die Translation verhindert und evtl. die mRNA Degradierung initiiert, was schlussendlich zur Inhibierung der Proteinsynthese führt. Da eine miRNA einige Hundert mRNA Transkripte regulieren kann, stellen die miRNAs eine sehr effektive Möglichkeit der Regulation wichtiger Signalwege dar, die auch wesentlich die Tumorentstehung und Progression, aber auch Prozesse wie die Therapieresistenz beeinflussen. MiRNAs sind aufgrund ihrer geringen Größe sehr stabil, da eine Degradierung durch RNAsen kaum noch stattfinden kann. Sie sind deshalb sehr gut als Biomarker geeignet, da sie aus allen Geweben, sowohl kryokonserviert als auch formalin-fixiert und paraffin-eingebettet (FFPE), sowie aus Körperflüssigkeiten isoliert werden können. Sie haben deshalb zunehmend Bedeutung für die Diagnostik zur Identifizierung von Tumoren, aber auch für die Klassifizierung von Tumorentitäten sowie als prognostische und prädiktive Biomarker, auch in der Urologie (Schubert et al. 2016). MiRNAs spielen auch eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation und werden, verpackt in extrazelluläre Vesikel, zwischen Zellen, auch über große Distanzen in den Körperflüssigkeiten transportiert.

Regulation von Zellzyklus und Apoptose

Die physiologische Abfolge der Zellzyklusphasen wird wesentlich durch Phosphorylierung von Proteinen gesteuert. Eine Gruppe von Proteinkinasen bildet den Kern der Zellzyklusmaschinerie. Diese sog. CDK („cyclin dependent kinases“, zyklinabhängige Proteinkinasen) stellen Heterodimere aus einer katalytischen Kinase- und einer regulatorischen Zyklinuntereinheit dar. Für die Aktivierung der Proteinkinaseeigenschaft müssen die CDK darüber hinaus selber phosphoryliert und dephosphoryliert werden. Spezifische Kombinationen zwischen verschiedenen Zyklinen und Kinasen sind charakteristisch für jede Phase des Zellzyklus. Wenn die Zellen die G0-Phase verlassen, um in die G1-Phase des Zellzyklus einzutreten, werden D-Typ-Zykline (D1, D2 und D3) und etwas später Zyklin E synthetisiert. Dagegen sind die Zykline A und B für die Regulation der DNA-Synthese-Phase, der G2-Phase und der Mitose verantwortlich.
Die D-Zykline komplexieren mit den katalytischen Kinase-Untereinheiten CDK4 und CDK6, Zyklin E mit der CDK2. Die Zyklin-A-mRNA-Expression steigt, nachdem sich die Zyklin-E-CDK2-Komplexe gebildet haben. Die Aktivierung von CDK1 durch Zyklin A und B erlaubt schließlich den Übergang in die Mitose.
Die CDK unterliegen weiterhin einer negativen Regulation durch Inhibitorproteine (zyklinabhängige Kinaseinhibitoren, CKI). Es können zwei Klassen von CKI unterschieden werden: Die KIP/CIP-Familie ist eine Gruppe strukturell verwandter Proteine (p21, p27, p57), die alle in der Lage sind, verschiedene Zyklin-CDK-Komplexe zu binden und zu inhibieren. In der Zelle ist ihr hauptsächliches Ziel wohl der Zyklin-E-CDK2-Komplex. Die Rolle der verschiedenen Proteine in vivo liegt daher in der Vermittlung der Zellantwort auf charakteristische mitogene und antimitogene Signale. Während z. B. p21 den durch p53 regulierten Zellzyklus-Arrest nach DNA-Schädigung vermittelt, löst p27 einen Zellzyklusarrest als Folge von Serumentzug, Kontaktinhibition oder Einwirkung von TGF-β aus.
Die zweite Klasse von CKI, die vier verwandten Moleküle p15, p16, p18 und p19, werden als INK4-Proteine bezeichnet. Im Gegensatz zu den Proteinen der KIP/CIP-Familie sind die INK4 Proteine spezifische Inhibitoren der Zyklin-CDK-Komplexe Cyclin D-CDK4 und Cyclin D-CDK6. Die INK4 Proteine kompetieren – im Gegensatz zur KIP/CIP-Familie – in vivo mit den Zyklinen um CDK-Monomere. Das p15INK4B-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der antimitogenen Wirkung von TGF-β. Das p16INK4A-Protein besitzt eine sehr lange Lebensdauer und akkumuliert daher allmählich über viele Zellzyklen hinweg. Diese Akkumulation wird als eine Ursache der mit der Seneszenz von Zellen einhergehenden verminderten Proliferationsfähigkeit angesehen (Evan und Vousden 2001).
Der Übergang von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus ist derzeit am besten charakterisiert: Das RB1-Protein bindet und blockiert in seiner aktiven, d. h. hypophosphorylierten Form Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie. Diese Transkriptionsfaktoren aktivieren Gene, die für die DNA-Replikation notwendig sind (wie DNA-Polymerase α, PCNA, Dihydrofolatreduktase u. a.). Während der G1-Phase wird RB1 sukzessive durch die Zyklin D-CDK4- oder Zyklin D-CDK6- und Zyklin E-CDK2-Komplexe phosphoryliert. Die Phosphorylierung von RB1 führt zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors, was wiederum die Transkription von E2F-abhängigen Genen und den Übergang in die S-Phase ermöglicht (Abb. 3) (Sherr und McCormick 2002).
Defekte in der Regulation des Zellzyklus in Tumorzellen können unmittelbar durch Aktivierung von beteiligten Protoonkogenen wie Zyklin D1, Zyklin D2 oder CDK4 oder durch Verluste der Funktion von beteiligten Tumorsuppressoren wie RB1 oder p16INK4A entstehen. In manchen Tumoren sind sie Folge von Veränderungen in Signalkaskaden, die auf den Zellzyklus einwirken.
Im Zellzyklus werden nicht nur Proliferationssignale integriert, sondern es wird auch sichergestellt, dass das genetische Material möglichst intakt weitergegeben wird. Um eine Anhäufung genomischer Fehler während der Zellteilung zu vermeiden, existieren sog. „Checkpoints“ innerhalb des Zellzyklus, aus denen heraus ggf. Reparaturmechanismen aktiviert werden können. Als Beispiel sei hier der p53-abhängige G1/S-Checkpoint genannt, der nach DNA-Schädigungen durch Bestrahlung oder Zytostatika die Zellen vermittelt durch p21CIP1 am Eintritt in die S-Phase hindert. Ein zweiter wichtiger Checkpoint (G2/M) verhindert den Eintritt von Zellen mit unvollständig replizierter DNA in die Mitose. Wichtig ist, dass die G2-Phase des Zellzyklus die Phase ist, welche für eine Chemo- und/oder Bestrahlungstherapie am sensitivsten ist (Liao und Lieu 2005; Milas et al. 1999; Pawlik und Keyomarsi 2004; Siemann und Keng 1984).
Neben Zellzyklusarrest kann an Checkpoints auch Apoptose induziert werden. Die Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, ist ein weiterer wichtiger Mechanismus, um die Entstehung fehlerhafter und schließlich maligner Zellen zu verhindern. Sie unterscheidet sich von der pathologischen Nekrose und findet sich physiologisch bei verschiedenen Entwicklungsprozessen in mehrzelligen Organismen wie z. B. der Entwicklung, Differenzierung und Reifung hämatopoetischer und immunkompetenter Zellen.
Apoptose kann über einen extrinsischen oder einen intrinsischen Signalweg initiiert werden; beide münden in eine gemeinsame „Exekutions“-Kaskade. Der intrinsische Signalweg, der z. B. durch DNA-Schäden aktiviert wird, erhöht die Permeabilität von Mitochondrien. Dies führt zur Bildung eines „Apoptosom“-Protein-Komplexes der seinerseits Exekutions-Caspasen aktiviert. Caspasen sind spezifische Proteasen. Der extrinsische Signalweg wird durch Membranrezeptoren, sogenannte „Todes-Rezeptoren“ initiiert. Diese werden durch Zytokine oder Oberflächenproteine von zytotoxischen Immunzellen aktiviert. Die intrazellulären „Death-Domänen“ des aktivierten Rezeptors lagern FADD-Adaptorproteine im „DISC“-Komplex an, der wiederum verschiedene Initiator-Caspasen aktiviert. Letztere initiieren proteolytisch die Exekutionskaskade. In dieser spalten die Effektor-Caspasen eine Vielfalt von Proteinen, sodass die morphologischen Kennzeichen der Apoptose eine Chromatinkondensation, Ausstülpungen der Zellmembran, eine internukleosomale DNA-Fragmentierung und eine Absonderung des Zellinhalts in Membranabschnürungen, sogenannten apoptotischen Körpern („apoptotic bodies“) sind. Speziell spalten Caspasen Inhibitoren von intrazellulären DNasen, sodass auch die DNA fragmentiert wird. Nach dem Auftreten der apoptotischen Körper wird die sterbende Zelle schnell von ihren Nachbarzellen phagozytiert (Castedo et al. 2004; Los et al. 2001).
Die Apoptose wird in beiden Signalwegen in mehreren Stufen reguliert. BCL-2 verhindert die Wirkung der verwandten proapoptotischen Proteine BAX und BAK an den Mitochondrien. Weiterhin erfolgt eine Regulation durch andere Mitglieder der BCL-2-Familie, die auf unterschiedliche Stress-Signale ansprechen. FLIP inhibiert den extrinsischen Signalweg an den Todesrezeptoren, während Inhibitoren der Apoptose (IAP), wie z. B. Survivin, Caspasen am „Apoptosom“ inhibiert. IAP werden dagegen durch SMAC/Diablo antagonisiert, das bei der Permeabilitätsänderung der Mitochondrien freigesetzt wird.
In Tumoren können sowohl der intrinsische als auch der extrinsische Apoptosesignalweg beeinträchtigt sein. Zu den häufigen Veränderungen zählen Verlust der Expression des Todesrezeptors TNFRSF6 (auch FAS oder Apo-1), Überexpression von BCL-2 oder Verlust der Expression von BAX sowie Überexpression von Survivin (Cory et al. 2003).

Wachstumsregulation

Das autounkontrollierte Zellwachstum ist eine der wesentlichen Eigenschaften von Tumoren. Wie im Kapitel vorher beschrieben, beruht das Wachstum nicht allein auf der Steigerung der Proliferation, sondern auf einer Störung des Gleichgewichts zwischen Zellteilung und Apoptose. In diesen Prozess sind vielfältige Signalwege involviert, die durch Proteinkinasen und Proteinphosphatasen reguliert werden. Diese beiden Enzymgruppen ermöglichen eine enge und reversible Kontrolle der Proteinphosphorylierung und damit der Proteinaktivität. Hierbei stellen Proteintyrosinkinasen (PTK) die größte Klasse von Signalproteinen dar. Sie werden noch einmal in Rezeptorproteintyrosinkinasen (RPTK) und zytoplasmatische PTK unterteilt. RPTK sind Transmembranrezeptoren, deren intrinsische PTK nach Bindung eines Liganden an der Zelloberfläche aktiviert wird. Die Liganden bewirken eine Oligomerisierung der Rezeptoren, in aller Regel werden Dimere der Rezeptoren gebildet (Heldin 1995). Dies führt zunächst zur Tyrosinautophosphorylierung der Rezeptoruntereinheit, die wiederum die katalytische Aktivität der intrazellulären Untereinheit einschließlich der Phosphorylierung der Tyrosinreste induziert. Damit können zytoplasmatische Signalproteine binden, die vielfältige Signalwege aktivieren. Zu den wichtigsten RPTK zählen z. B. die EGFR-Familie, PDGFR, VEGF, FGFR, MET und AXL (Abb. 4). Diese regulieren wichtige intrazelluläre Signalwege (vor allem PI3K-AKT-mTOR, RAF-MEK-ERK oder JAK/STAT), die Einfluss auf Proliferation, Apoptose, Metabolismus, Angiogenese, DNA-Reparatur haben (Blume-Jensen und Hunter 2001; Schlessinger 2000).
Durch Feedbacksignale der Downstreameffektoren wird das physiologische Gleichgewicht erhalten. In Tumoren hingegen wird dieses Gleichgewicht gestört. Dies beruht am häufigsten auf der Aktivierung der RPTK durch Mutationen oder Überexpression, bedingt z. B. durch genomische Rearrangements, Amplifikationen. Im Ergebnis kommt es zu einer konstitutiven Rezeptoraktivierung auch ohne Ligandenbindung. Derartige Alterationen sind für z. B. für EGFR, FGFR und MET als RPTK, aber auch für zytoplasmatische PTK wie ALK, JAK und ABL bekannt. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden in den letzten 10 Jahren erfolgreich viele zielgerichtete Therapien entwickelt, die in diese Signalwege eingreifen. Hierzu zählen EGR-Inhibitoren (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib), die erfolgreich bei Lungenkarzinomen eingesetzt werden oder ALK-Inhibitoren wie Crizotinib ebenfalls für Lungenkarzinome und Lymphome. Für Nierenzellkarzinome werden Multi-Tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) verwendet, die gegen VEGFR und PDGFR (z. B. Sunitinib, Pazopanib), MET und AXL (Cabozantinib) gerichtet sind (Choueiri und Motzer 2017). Beim Harnblasenkarzinom laufen aktuell Studien zu FGFR-Inhibitoren, wobei in der Vergangenheit keine Erfolge verzeichnet wurden (Di Martino et al. 2016). Trotz aller Fortschritte in der Tumortherapie bleibt das Problem der Resistenz gegenüber diesen Substanzen bestehen, entweder primär (intrinsisch) oder sekundär. Dies kann unter anderem auch dadurch erklärt werden, dass verschiedene intrazelluläre Signalwege und Effektoren durch mehrere RPTK reguliert werden (Sun und Bernards 2014). Wenn nur eine RPTK inhibiert wird, kann ein Signalweg durch eine andere RPTK weiter aktiviert werden. Diese Redundanz in der RPTK- Signaltransduktion muss bei der Therapieentwicklung berücksichtigt werden und sollte die Grundlage für Kombinationstherapien oder sog. Multi-TKIs bilden. Darüber hinaus müssen auch Feedbackmechanismen beachtet werden.
Neben Onkogenaktivierungen als häufigste Form der Singalwegaktivierung können auch inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie PTEN im PI3K-AKT-mTOR Signalweg zur Aktivierung der Proliferation führen.

Genetische Instabilität und DNA-Reparatur

Neben publizierten Daten einzelner Microarray- und Sequenzierungs-Analysen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/) stehen inzwischen durch die technologische Weiterentwicklung (s. Abschn. 2.1) auch große Datenmengen zur genetischen Variabilität und Genexpressionsveränderungen aus Hochdurchsatzanalysen (Next Generation Sequencing) von großen Patientenkohorten öffentlich zur Verfügung (http://cancergenome.nih.gov/). Für einzelne urogenitale Entitäten wurden die Ergebnisse jeweils in Publikationen übersichtlich dargestellt (Cancer Genome Atlas Research 2014; Cancer Genome Atlas Research et al. 2013, 2015 Ricketts et al. 2018; Robertson et al. 2018; Shen et al. 2018)
Diese Daten zeigen u. a. deutliche Unterschiede in der Zahl der somatischen Mutationen je nach Tumorart auf. Während Keimzelltumore in der Rangliste eher im unteren Drittel zu finden sind, liegen klarzellige und papilläre Nierenkarzinome im Mittelfeld, Harnblasenkarzinome weisen neben Lungentumoren und Melanomen die höchste Anzahl somatischer Mutation auf, sind also genetisch sehr instabil (Bailey et al. 2018). Zudem deuten solche Studien auf eine starke Tumorheterogenität zwischen Patienten einer Tumorentität oder sogar zwischen Primärtumor und Metastase hin. Diese Unterschiede spiegeln sich auf molekularer Ebene in unterschiedlichen Mutationsspektren oder Genexpressionsveränderungen wieder. Aus klinischer Sicht sind damit Unterschiede im klinischen Verlauf und Therapieansprechen assoziiert. Hieraus leitet sich die Idee der maßgeschneiderten Therapie (precision medicine) ab, die auf einer molekularen Subtypisierung (Mutationsspektren/ Biomarker-Expression) von Patienten beruht und hierdurch eine genauere Prognose zu Verlauf und Ansprechen auf verschiedene klassische wie moderne Therapieverfahren ermöglichen soll.
Neben der Exposition gegenüber genotoxischen Agenzien und genomweiter DNA-Hypomethylierung von Retroelement-Sequenzen (s. o.) können auch endogene Störungen wichtiger zellulärer Prozesse zur Akkumulation genetischer Veränderungen und genetischer Instabilität führen. Hierzu zählen neben Defekten in der Zellzyklusregulation (s. Abschn. 1.5) u. a. Störungen bei der DNA-Replikation in schnell proliferierenden Tumorzellen und Defekte in der DNA-Reparaturantwort. Neben Mutationen und Genexpressionsveränderungen können diese Prozesse auch durch Veränderungen der Chromatinarchitektur (s. Abschn. 1.4) gestört sein.
Inzwischen sind etwa 276 Gene identifiziert, die im weiteren Sinne mit der DNA-Reparaturantwort (DNA damage response/DDR) assoziiert sind. Diese sind an der Regulation der Reparatur, der Signaltransduktion oder spezifischen Reparaturmechanismen beteiligt. Zu den wichtigsten Mechanismen gehören solche zur Reparatur einzelner Basen, wie Nukleotid-Excisionsreparatur (NER) und Basenexcisions-Reparatur (BER), zur Reparatur von Fehlpaarungen, wie Mismatch-Reparatur (MMR), und solche zur Reparatur von sog. Crosslinks und Strangbrüchen, wie nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ), homologe Rekombination (HR), die Transläsions-DNA-Synthese (TLS) und der Fanconi Anämie-Signalweg (FA). Störungen dieser Mechanismen sind für diverse Tumorarten einzeln berichtet, eine rezente „pan Cancer“-Analyse des TCGA Konsortiums umfasste 33 Tumorarten (Knijnenburg et al. 2018). Neben genetischer Instabilität können sie mit dem Auftreten bestimmter sog. Mutationssignaturen sowie mit schlechtem Verlauf und Therapieansprechen bzw. -Resistenz assoziiert sein. Auch die Regulation und Aktivierung der DDR kann durch Veränderung von Faktoren, die regulär zur Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints und Zellzyklus-Arrest oder Apoptose führen können (z. B. p53, ATM, ATR, CHK1, CHK2), gestört sein. Harnblasenkarzinome sind bekannt für Störungen des G1 Zellzyklus-Checkpoints, der u. a. aus pRB1-Verlust, CDKN2A-Deletion oder E2F3-Überexpression resultiert (Bartkova et al. 2005). Die homologe Rekombination ist z. B. häufig in Keimzell-, Prostata- und Harnblasentumoren gestört, in papillären Nierenzellkarzinomen jedoch eher selten. Harnblasentumore können auch NER-defizient sein und Prostatatumore können zudem Veränderungen in Genen der BER, TLS und des FA haben. Ein weitreichenderes Verständnis gestörter DNA-Reparatur kann neue therapeutische Fenster für Kombinationstherapien eröffnen.
Eine weitere pan Cancer-Studie des TCGA-Konsortiums identifizierte zudem zahlreiche DDR-Gene als sog. Driver-Gene, deren Veränderung also maßgeblich für Entstehung und-Progression diverser Tumorarten sein kann (Bailey et al. 2018). Hierzu zählen z. B. ATM, CUL3, SMARCA4, IDH1, ATRX, TP53 und BRCA1. Weitere zentrale pan Cancer Driver, die häufig von Mutationen betroffen sind, sind u. a. PIK3CA, KRAS, PTEN und ARID1A.
Natürlich können auch zentrale Signalwege von genetischen Veränderungen betroffen sein und tragen somit zur Vermittlung charakteristischer Eigenschaften von Tumorzellen bei (Cancer Hallmarks, s. Abschn. 1.1). Eine rezente pan Cancer-Studie an 10 zentralen kanonischen Signalwegen (Zellzyklusregulation, Hippo, Myc, Notch, NRF2, PI3K/AKT, RTK-RAS, TGFβ, TP53 und WNT) in 9125 Tumorproben von 33 Entitäten ergab (Abb. 5) auch hier ausgeprägte Unterschiede zwischen verschiedenen Tumorarten einerseits und Tumoren derselben Entität andererseits (Sanchez-Vega et al. 2018). Dennoch hatten 98 % der Proben wenigstens eine tumorfördernde (driver alteration, nicht nur Mutation) in wenigstens einem der Signalwege. In 57 % der Proben war mindestens eine Veränderung nachweisbar, die durch aktuell zur Verfügung stehende zielgerichtete Therapieformen angreifbar wäre. Eine gute Übersicht der in urogenitalen Tumoren betroffenen Faktoren bietet Sanchez-Vega et al. (Sanchez-Vega et al. 2018).

Invasion und Metastasierung

Invasion und Metastasierung stellen eine wesentliche Eigenschaft von Karzinomen dar und grenzen sie von benignen Tumoren ab. Die Metastasierung bestimmt nach wie vor die Prognose und ist damit die entscheidende Todesursache bei den meisten Tumorerkrankungen. Die Kenntnis der molekularen und zellulären Veränderungen der Metastasierung ist deshalb essentiell zur Verbesserung der Prognose der Patienten. Die Formierung der Metastasen von der Tumorzellstreuung aus dem Primärtumor bis zur Koloniebildung in einem anderen Organ unterliegt einem mehrstufigen Prozess und wird als Invasions-Metastasierungskaskade bezeichnet (Fidler und Paget 2003; Lambert et al. 2017; Talmadge und Fidler 2010). Dieser Prozess umfasst:
  • Lokale Invasion in das umgebende Gewebe
  • Intravasation in die Zirkulation
  • Überleben der Zellen im Blutsystem
  • Arrest und Extravasation in das Parenchym des Metastasierungsorgans
  • Proliferation und Koloniebildung (Mikrometastasen, Metastasen)
Im Gegensatz zur Entstehung der Primärtumoren sind die molekularen Grundlagen der Metastasierung nur wenig verstanden.
Eine grundlegende Eigenschaft invasiver und metastasierender Tumorzellen konnte jedoch mehrfach belegt werden: die epithelial-mesenchymale Transition (EMT). Diese beschreibt die Reduzierung bzw. den Verlust epithelialer (Differenzierungs-) Eigenschaften und die Ausprägung eines mesenchymalen (dedifferenzierten) Phänotyps. Dieses EMT Programm erlaubt Tumorzellen vor allem die Dissemination, also das Verlassen des Primärtumors und das Erreichen der Zirkulation, da hierdurch Motilität, Invasionsfähigkeit und der Abbau der extrazellulären Matrix (EZM) induziert und gesteigert werden. Die EMT wird durch das Zusammenwirken verschiedener Transkriptionsfaktoren wie Snail, Slug, Twist, Zeb1/2 induziert. Diese werden neben TGF-ß auch durch miRNAs (z. B. miR-200 Familie) reguliert (De Craene und Berx 2013). Nach Erreichen der Zirkulation, als Einzelzellen oder Zellcluster, müssen sich die Tumorzellen (zirkulierende Tumorzellen, CTC) neben den physikalischen Einflüssen vor allem gegen Immunzellen schützen. Hierbei spielt die Wechselwirkung mit anderen Zellen wie den Blutplättchen und Neutrophilen eine wichtige Rolle. So verhindern Thrombozyten einerseits durch Bindung an die CTC die Erkennung durch natürliche Killerzellen (NK) und können andererseits durch die Sekretion von löslichen Faktoren wie TGF-ß und PDGF die Aktivität der NK Zellen unterdrücken (Labelle und Hynes 2012; Nieswandt et al. 1999; Palumbo et al. 2005). Darüber hinaus fördern sie auch die EMT der CTC durch TGF-ß-Freisetzung und Aktivierung des NF-κB-Signalweges (Labelle et al. 2011). Neutrophile können unter anderem immunsupprimierend wirken, verstärken die Extravasation durch Produktion von MMPs und halten die CTC intraluminal fest (Cools-Lartigue et al. 2013; Spiegel et al. 2016). Für die Extravasation produzieren die Tumorzellen neben MMPs weitere Faktoren wie VEGF und ADAM12. Im nächsten Schritt muss dann die Koloniebildung, basierend auf der Proliferation der Tumorzellen, stattfinden. Da die Zellen am Ort der Metastasierung auf eine andere Mikroumgebung treffen als im Primärtumor, kommt es häufig zunächst zur „Dormancy“, die Zellen befinden sich in einem Wachstumsarrest oder „Schlafzustand“, bedingt durch fehlende Signale oder spezielle Signale der aktuellen Mikroumgebung (Lambert et al. 2017). Welche Signale zur Aufhebung des Ruhezustandes, z. T. nach Jahren, führen, ist bisher wenig verstanden. Die Koloniebildung setzt unter anderem voraus, dass die Tumorzellen wieder epitheliale Eigenschaften annehmen, ähnlich wie vorher im Primärtumor. Dies erfolgt durch die mesenchymal-epitheliale Transition (MET) (Brabletz 2012). Die Ansiedlung der Tumorzellen und die folgende komplexe Tumorbildung am Metastasierungsort sind, wie bei der Primärtumorentstehung, abhängig von der spezifischen Mikroumgebung. Dies erklärt z. T. auch den organspezifischen Tropismus, d. h. die Beobachtung, dass bestimmte Tumoren vorzugsweise in bestimmte Organe metastasieren. Erstmals wurde dieses Phänomen als „seed and soil“ Hypothese von Paget Ende des 19. Jahrhunderts beschrieben (Paget 1889). Einerseits müssen die CTC Eigenschaften besitzen, die eine Expansion in der neuen Umgebung ermöglichen, andererseits muss die Umgebung für die Expansion der Zellen geeignet sein. Dies ist ein dynamischer Prozess, der auch durch die Formierung der prämetastatischen Nische beschrieben wird. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass eine spezifische Mikroumgebung am zukünftigen Metastasierungsort induziert wird, bevor die Tumorzellen dorthin eintreten (Kaplan et al. 2006). Hierbei kommt es zunächst zu einer Aktivierung mesenchymaler Stammzellen, im Weiteren zum Umbau/Aktivierung der ortsständigen Fibroblasten und Endothelzellen. Dies wird durch den Primärtumor gesteuert, neben löslichen Faktoren spielen hier auch Exosomen eine wesentliche Rolle. Für die Exosomen, die vor allem mRNAs, miRNAs und Proteine transportieren, konnte hier eine wichtige Rolle für den Organtropismus belegt werden (Hoshino et al. 2015; Peinado et al. 2012, 2017).
Bisher konnten keine Mutationen identifiziert werden, die spezifisch mit der Metastasierung assoziiert sind, was unterstreicht, dass die der Metastasierung zugrunde liegenden Mutationen zu den tumortreibenden Mutationen zählen, die bereits bei der Tumorentstehung notwendig sind (Lambert et al. 2017). Damit kann auch nicht von einer Akkumulation von genetischen Alterationen als Voraussetzung für die Metastasierung ausgegangen werden, wie sie in der klassischen Mehrschritthypothese der Tumorgenese von Vogelstein für das Kolonkarzinom beschrieben wurde. Es scheinen vielmehr epigenetische Alterationen, auch in Wechselwirkung mit der Mikroumgebung, eine Rolle zu spielen wie für das Lungenkarzinom im Mausmodell beschrieben (Denny et al. 2016). Neben den globalen Chromatinkonfigurationsänderungen und DNA-Methylierung sind auch miRNAs wesentlich an den komplexen Prozessen der Metastasierung beteiligt (Nicoloso et al. 2009; Ozturk et al. 2016). Als tatsächlich genetisch bedingte Alterationen kann die Inaktivierung von „metastasis suppressor genes“ oder Aktivierung von „metastasis oncogenes“ angesehen werden, wie für NM23, KISS1, KAI1 und MACC1 gezeigt (Pachmayr et al. 2017; Steeg 2003).

Molekularbiologische Untersuchungsmethoden

Hochdurchsatzverfahren zur Identifizierung von Biomarkern

Hochdurchsatzverfahren werden in der Regel als Screening Verfahren eingesetzt. Bei den Hochdurchsatzverfahren gibt es offene und geschlossene Systeme. Offene Systeme sind in der Lage auch neue noch unbekannte Moleküle zu identifizieren, hierzu gehören z. B. Sequenzierverfahren. Geschlossene Verfahren können nur bereits bekannte Moleküle nachweisen bzw. quantifizieren, hierzu gehören z. B Chip-Technologien. Chip-Technologien ermöglichen parallel die Untersuchung einer großen Anzahl von Faktoren, z. B. Gentranskripte (mRNA). Dies spielt insbesondere in der Tumorforschung eine bedeutende Rolle, da Tumoren vielfältige Veränderungen in der Menge und Struktur von Transkripten aufweisen.
Genomische Alterationen
Bereits seit einigen Jahren existieren Chip-Technologien zur Untersuchung von Nukleinsäuren. Je nach Plattform können damit DNA-, mRNA- oder microRNA-Proben untersucht werden. Hierbei sind auf einem Träger Oligonukleotidmoleküle bekannter Sequenz in einem geordneten Raster („Array“) immobilisiert. Beispielsweise ist dabei eine Sequenz spezifisch für ein bestimmtes Gentranskript. Wird eine markierte Probe (z. B. Tumor-RNA) auf einem Chip hybridisiert, erfolgt eine spezifische Bindung von RNA-Fragmenten an die jeweils komplementären Sonden. Die Position des Signals der RNA-Markierung im Raster ermöglicht eine Aussage über die Identität des Transkripts, die Signalstärke über seine Expressionshöhe. Die Auswertung der erhaltenen Daten erfolgt mit Hilfe geeigneter Software-Programme und liefert beispielsweise Genexpressionsmuster, die mit einem spezifischen histologischen Tumorsubtyp oder dem Überleben von Tumorpatienten assoziiert sind (Grimm et al. 2003; Sanjmyatav et al. 2011b).
Für mRNA-Untersuchungen existieren sog. themenspezifische Arrays, mit denen beispielsweise alle apoptoserelevanten Gentranskripte untersucht werden. Mit anderen Arrays kann die Expression aller Gentranskripte, zum Teil auch ihrer verschiedenen Spleißvarianten, simultan bestimmt werden.
Für DNA-Analysen werden u. a. sog. „single nucleotide polymorphism“ (SNP)-Arrays verwendet, die sowohl eine Genotypisierung verschiedener SNPs im Genom als auch eine genomweite DNA-Kopienzahlanalyse zulassen (Beaudet und Belmont 2008). Des Weiteren wird auch die hochauflösende CGH (s. o.), die sog. Array-CGH, zur Detektion chromosomaler und genetischer Veränderungen eingesetzt (Beaudet und Belmont 2008; Pinkel und Albertson 2005; Sanjmyatav et al. 2011a), wenn auch immer seltener.
Der AmpliChip-CYP450-Test ist ein SNP-Array zur Detektion von Genotypen in zwei Genen der Cytochrom P450-Familie. Da diese Gene an der Metabolisierung von etwa einem Viertel aller rezeptpflichtigen Medikamente beteiligt sind, kann mit Hilfe dieses AmpliChip-CYP450-Tests patientenspezifisch die Metabolisierung eines Wirkstoffes und damit die Dosierung des Medikamentes abgeschätzt werden (Li et al. 2008).
In den letzten Jahren hat sich zunehmend das „Next generation Sequencing“ (NGS, Second Generation Sequencing) als Alternative zu Array-basierten Methoden durchgesetzt. Der Name NGS kommt daher, dass die erste Generation von Sequenzierverfahren, hauptsächlich Sanger and Maxam-Gilbert Sequenzierung, durch eine weitere Generation von Sequenzierverfahren abgelöst wurde. Diese Methoden erlauben die gleichzeitige und schnelle Bestimmung der Sequenz von Hunderttausenden kürzerer Nukleinsäuresequenzen. Damit kann die Sequenzierung des vollständigen humanen Genoms bzw. Transkriptoms erstmals innerhalb weniger Tage durchgeführt werden. Die Kosten sanken aufgrund stetiger Technologieentwicklungen immer weiter, so dass mittlerweile die Sequenzierung eines kompletten Genoms für <1000 US $ möglich ist. Wir möchten im Weiteren kurz auf verschiedene Sequenzierstrategien auf DNA- und RNA-Ebene eingehen.
Beim „whole genome sequencing“ (WGS) wird das gesamte Genom sequenziert. Es werden alle kodierenden und nicht-kodierenden Regionen auf DNA-Ebene erfasst, wodurch auch der Nachweis von Punktmutationen, von Genduplikationen und Deletionen, sogenannten Copy Number Variations (CNVs; ca. 30.000 im humanen Genom), von Einzelnukleotid Polymorphismen (single nucleotid polymorphisms/SNPs; ca. 3 Mill. im humanen Genom) und von DNA-Methylierungsmustern möglich ist. Gesamtgenomische Sequenzierungen erlaubten bei den urologischen Tumoren vor allem weitere molekulare Subklassifizierungen für Prostatakarzinome (Wedge et al. 2018), Nierenzellkarzinome (Ricketts et al. 2018), muskelinvasive Blasenkarzinome (Robertson et al. 2018) und nicht-muskel-invasives Blasenkarzinome (Lerner und Robertson 2016), testikuläre Keimzelltumore (Shen et al. 2018) vorzunehmen und damit auch potentielle Therapietargets zu identifizieren.
Für die Sequenzierung auf RNA-Ebene ist immer zuerst eine Umschreibung in komplementäre DNA (cDNA) erforderlich. Beim RNAseq auch „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“ (whole transcript sequencing/WTS) genannt, wird die gesamte RNA, d. h. alle kodierenden und nicht kodierenden RNAs sequenziert. RNA-Seq erlaubt umfassende Aussagen zur Genexpression, z. B. wie unterschiedliche Allele eines Gens exprimiert sind und ob posttranskriptionale Modifikationen oder Fusionstranskripte vorliegen (Morin et al. 2008; Wang et al. 2009).
Beim „whole exome sequencing“ (WES) werden nur alle proteinkodierenden Bereiche (ca. 20.000 Gene) d. h. das Exom, angereichert und sequenziert. Dabei machen die proteinkodierenden Gene aber nur ca. 1 % des Genoms mit etwa 30 Millionen Basenpaaren aus. Beim „clinical exome sequencing“ (CES) wird nur ein Subset des Exoms (krankheitsassoziierte Gene) angereichert und sequenziert, was kostensparend gegenüber der WES ist. Eine weitere spezielle und sehr effektive RNA-Sequenzierungsmethode ist die „MACE“ (Massive analysis of cDNA ends). Hierbei wird von jeder mRNA (jedem polyadenylierten Transkriptmolekül) bzw. deren cDNA nur ein einzelner Abschnitt sequenziert (Zawada et al. 2014). Dadurch können alle Transkripte gleichmäßig und mit einer geringen Lesetiefe (wenige reads) erfasst werden, was vor allem bei degradierter RNA und für den Nachweis von seltenen Transkripten bzw. von Polymorphismen vorteilhaft ist (Zawada et al. 2014). Eine andere Technik wird bei der SAGE (Serial Analysis of Gene Expression), der serielle Analyse der Genexpression eingesetzt. Aus der in cDNA umgeschriebenen mRNA werden mittels des Enzyms Reverse Transkriptase kurze Stücke sogenannte tags herausgeschnitten und diese werden dann sequenziert. Dies erlaubt die Analyse einer sehr großen Menge von Genen bzw. kann die Anzahl der genspezifischen mRNA-Moleküle relativ gut und quantitativ bestimmt werden (Velculescu et al. 1995). Eine Weiterentwicklung ist die SuperSAGE, welche noch effektiver mRNA Moleküle quantifizieren kann (Matsumura et al. 2005).
Gegenwärtig erfolgt gerade der Übergang zur 3. Generation der Sequenzierungen (Third Generation Sequencing). Es handelt sich um neue Methoden, die längere Sequenzen (long-reads) lesen können, wodurch es möglich wird, epigenetische Modifikationen an nativer DNA direkt zu sequenzieren bzw. alle Transkripte ohne zeitaufwendiges Anordnen (assembly) zu erfassen (van Dijk et al. 2018).
Es gibt ausgewiesene aktuelle Publikationen zur Genexpression, welche auf Hochdurchsatzmethoden basieren, z. B. beim Prostatakarzinom (He et al. 2018), klarzelligen Nierenzellkarzinom (Chen et al. 2018), testikulären Keimzelltumor (Sun et al. 2019), Blasenkarzinom (Inamura 2018; Robertson et al. 2018).
DNA-Methylierung
Im Vergleich zu RNA ist DNA erheblich stabiler, die Methylierung ist nach Extraktion der DNA praktisch irreversibel. Daher lassen sich DNA-Methylierungsveränderungen robust an diversen Probenmaterialen wie z. B. Biopsien, Körperflüssigkeiten oder Paraffin-eingebettetem Gewebe untersuchen und eignen sich gut als Biomarker. Während sich beim Prostatakarzinom die genomweite Hypomethylierung von LINE-1-Retrotransposonsequenzen vorwiegend in fortgeschrittenen Tumoren nachweisen lässt, findet man diese beim Urothelkarzinom über alle Stadien hinweg. Auch die DNA-Hypermethylierung von Genpromotoren lässt sich entsprechend robust nachweisen. In zahlreichen Studien wurden, abhängig von der Tumorart, verschiedene Kandidatengene mit Hypermethylierung wie z. B. RASSF1A, RARB und CDKN2A (p16INK4A) beim Urothelkarzinom oder RASSF1A, GSTP1 und APC beim Prostatakarzinom als putative Biomarker postuliert, die jedoch weiterer Validierung in großen Multi-Center-Studien bedürfen. Viele der aktuell verwendeten Analyse-Methoden beruhen dabei auf der Bisulfit-Konversion der DNA, einer Deaminierungs-Reaktion durch die unmethyliertes Zytosin zu Uracil umgewandelt wird und 5-Methylzytosin unverändert bleibt (Clark et al. 1994). Divergente Ergebnisse früherer Studien mögen auch aus den in der Vergangenheit verwendeten Methoden wie z. B. der qualitativen Methylierungs-spezifischen PCR (MS-PCR) resultieren, die wenig geeignet ist, um nur anteilig oder heterogen methylierte Sequenzen zu analysieren. Der Goldstandard zur Untersuchung einzelner CpG-Stellen ist die Bisulfitsequenzierung klonierter PCR-Produkte. Weitere Techniken sind z. B. Pyrosequenzierung, quantitative MS-PCR, COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis), SNuPE (Single Nucleotide Primer Extension) oder massenspektrometrische Analysen. Übersichten über Ergebnisse früherer Studien findet man für das Urothelkarzinom z. B. in (Besaratinia et al. 2013) und für das Prostatakarzinom in (Goering et al. 2012).
Die heutigen modernen Techniken zeichnen sich einerseits durch erhöhte Sensitivitäten aus, die Analysen von wenig Material ermöglichen, bis hin zur Einzelzell-Analyse. Darüber hinaus stehen inzwischen zahlreiche Techniken zur globalen Analyse von mehreren Hunderttausend Stellen auf Hypo- wie Hypermethylierung zur Verfügung (Stirzaker et al. 2014). Gängig ist die Verwendung sog. BeadChips, hier werden etwa 0,5 μg Bisulfit-konvertierte DNA, ähnlich wie bei Microarray-Analysen, hybridisiert und fluoreszenzmarkiert, so dass differentielle Methylierung über Fluoreszenzsignal ausgelesen werden kann. Auf diese Art können etwa 450.000 (z. B. Illumina 450 K) bzw. 850.000 (Infinium EPIC Array 850k) CpG-Stellen gleichzeitig analysiert werden.
Die Weiterentwicklung von Next Generation Sequencing (NGS) Techniken hat die zur Verfügung stehenden Methoden zur globalen Analyse von DNA-Methylierung vielfältig erweitert und auch die Abdeckungsrate (sog. Coverage) sämtlicher im humanen Genom vorkommender CpG-Stellen erhöht. So wurde der frühere Goldstandard der Bisulfit-Sequenzierung ebenfalls für eine genomweite Analyse adaptiert (WGBS: whole genome bisulfite sequencing), so dass 1–5 μg Bisulfit-umgewandelte DNA zur Herstellung einer sog. Library und die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung eingesetzt werden kann. Diese Methode hat eine Coverage von etwa 95 %, zum Vergleich erreichen die bead arrays lediglich etwa 1,7 %, ist allerdings auch entsprechend kostenintensiv. Als preiswertere Variante steht die RRBS-Methode (reduced representative bisulfite sequencing) zur Verfügung. Diese Methode ist auf die Untersuchung von Regionen mit mittlerer bis hoher CpG-Dichte beschränkt, die sich mit Einzelnukleotidauflösung und einer Coverage von etwa 4 % untersuchen lassen. Hierfür werden DNA-Mengen im Nanogramm-Bereich mit dem Restriktionsenzym MspI verdaut, die dann im Weiteren in eine WGBS-Analyse einfließen kann.
Beispiele für Methoden mit einer mittleren Coverage sind z. B. auf Affinitätsanreicherung beruhende Ansätze ohne Bisulfitkonversion. Hierbei wird 0,2–1 μg methylierte DNA mit einem Antikörper gegen 5-Methylzytosin (MeDIP) oder an beads gekoppelten MBDCap Proteinen (MBDCap) präzipitiert, für die Library-Herstellung verwendet und sequenziert. Die Coverage liegt bei etwa 18 %, beide Methoden unterliegen einem gewissen Bias, indem sie eher CpG-arme Bereichen wie intergenische Regionen anreichern (MeDIP) bzw. eher CpG-reiche Regionen wie CpG-Inseln (MBDCap).
Durch diese Techniken hat sich der Wissensstand über genomweite Methylierungsveränderungen in Tumoren in der letzten Dekade erheblich erweitert und trägt so einerseits zum biologischen Verständnis und ggf. zur molekularen Subtypisierung bei, andererseits zu der Erkenntnis, dass weniger einzelne Marker als vielmehr Markerpanels vielversprechende Biomarker mit hohen Spezifitäten und Sensitivitäten sein können, die es nun zu validieren gilt (Chen et al. 2014). Auch für die Ergebnisse aktuellerer Studien mit modernen Methoden sind Entitätenbezogen Übersichtsarbeiten publiziert, die z. B. die Ergebnisse beim Urothelkarzinom zusammenfassen (Schulz und Goering 2016).
Proteine
Auch in der Proteinanalytik hat eine Entwicklung zur simultanen Untersuchung vieler Proteine und Proteinmodifikationen eingesetzt. Auf einem Array immobilisierte Antikörper können, ähnlich wie bei den Arrays zur Nukleinsäureanalyse, zur Identifikation der in einem Gemisch enthaltenen Proteine genutzt werden. Weiterhin kann die Wechselwirkung von „small molecules“ mit Proteinen in einem Hochdurchsatzmaßstab untersucht werden, was insbesondere in der Pharmaindustrie zum Screening potenzieller Wirkstoffe eingesetzt wird. Außerdem werden solche Biochips auch zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet (Albala und Humphrey-Smith 2003; Bernot 2004). Darüber hinaus sind massenspektrometrische Verfahren (MALDI, SELDI) sehr gut zur Proteinidentifikation geeignet.
Neben den genannten Chip-Technologien kann auch die Immunhistochemie (s. oben) in Form von „tissue microarrays“ – Paraffinblöcken, die Gewebestanzen hunderter Proben enthalten – als Hochdurchsatzmethode eingesetzt werden. Dabei wird, anders als bei den oben beschriebenen Array-Verfahren, keine Vielzahl von Markern, sondern ein spezifischer Marker an einem großen Probenkollektiv untersucht (Kononen et al. 1998).
Es stehen umfangreiche Datenbanken zur Verfügung, die es erlauben, bestimmte Tumormarker für urologische Tumoren in Bezug zu klinischen und Überlebensdaten zu analysieren. Dies sind z. B. die Datenbanken TCGA-PRAD (prostate adenocarcinoma), TCGA-KIRC (kidney renal cell carcinoma), TCGA-BLCA (bladder cancer), TCGA-TGCT (Testicular Germ Cell Tumors) einzusehen unter: https://portal.gdc.cancer.gov/ und http://www.cbioportal.org/.
In der Regel sind Array-basierte Hochdurchsatzanalysen kostenaufwendig, sodass sie meist an einer kleinen Stichprobe angewendet werden, um potenzielle Marker für eine spezifische Fragestellung zu identifizieren. Diese Marker werden anschließend mit Hilfe anderer Techniken, wie PCR oder Immunhistochemie an „tissue microarrays“, an einem großen Kollektiv validiert.
Eine wichtige Voraussetzung für Hochdurchsatzanalysen sind geeignete bioinformatische Algorithmen zur Auswertung der erzeugten Datenmengen, sodass auch die Bioinformatik für molekularbiologische Untersuchungen zunehmend an Bedeutung gewinnt. Für das NGS stellt sowohl die immer größer werdende Datenmenge als auch die Bewertung der erzielten Daten eine Herausforderung dar (Di Resta et al. 2018). Im Bereich der funktionellen Proteinanalyse ermöglichen bioinformatische Methoden darüber hinaus auch die Identifikation von Sequenzhomologien eines Proteins zu anderen Proteinen desselben oder anderer Organismen und lassen damit Rückschlüsse auf die Funktion des Proteins sowie mögliche Protein-Protein- oder Protein-DNA-Wechselwirkungen zu (Albala und Humphrey-Smith 2003; Kononen et al. 1998).

Validierung von Biomarkern

Die Validierung von Biomarkern bis zum Übergang in die klinische Anwendung umfasst üblicherweise mehrere zentrale Schritte: eine genaue Definition des Probenmaterials, die analytische Validierung des Biomarker-Tests, die klinische Validierung des Test, die Analyse der Vorhersagekraft für Diagnose oder Prognose und schließlich Genehmigung und Marktzulassung (Duffy et al. 2015). Idealerweise sollten sich entsprechende Biomarkerstudien z. B. an den Empfehlungen internationaler Kommittees für Tumormarker (TMUGS, REMARK, BRISQ, STARD, MIAME) orientieren (Duffy et al. 2015).
Biomarker, die aus Hochdurchsatz-Screeninganalysen hervorgegangen sind werden daher zunächst einzeln mittels Methoden wie der quantitativen PCR oder in situ Hybridisierung im Falle von Geweben validiert.
Für die Untersuchung von Nukleinsäuren (DNA und RNA) war die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch Mullis 1985 von zentraler Bedeutung. Die PCR erlaubt die millionenfache Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnittes in wenigen Stunden und ist damit Ausgangspunkt für zahlreiche qualitative und quantitative Untersuchungsverfahren. Bei DNA-Untersuchungen ist die PCR Voraussetzung für genetische Fingerprints, den Nachweis von Allelverlusten („loss of heterozygosity“), Analysen genetischer Polymorphismen und die Detektion bekannter Mutationen (Mülhardt 2002). Durch die Weiterentwicklung der PCR-Technik wendet man heute vorwiegend quantitative PCR-Methoden (qPCR), z. B. für die Bestimmung der Konzentration bestimmter Gentranskripte (mRNA) oder microRNA, und auch für die Analyse von Mutationen, Einzelnukleotidplymorphismen (SNP) und DNA-Kopiezahlveränderungen. Durch die Verwendung eines entsprechenden Standards und einer farbstoffmarkierten Sonde ist eine Quantifizierung des Zielmoleküls in der Probe möglich. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität eignet sich die quantitative PCR auch für molekulare Untersuchungen in Urinproben, die eine nicht-invasive Diagnostik und Prognostik möglich werden lassen (Zuiverloon et al. 2013). Verwendet man Bisulfit-konvertierte DNA, ermöglichen PCR-basierte Methoden wie die quantitative MS-PCR oder das Pyrosequencing die Validierung putativer DNA-Methylierungsmarker.
In-situ-Hybridisierungsverfahren (ISH) ermöglichen den Nachweis von Chromosomenaberrationen, Genveränderungen und RNA-Expression auf Einzelzellniveau. Durch den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen (FISH) konnte die Empfindlichkeit und Auflösung dieser Methode deutlich erhöht werden. Das Prinzip besteht in der Hybridisierung markierter komplementärer Nukleinsäurestränge auf objektträgerfixierte Zellen (z. B. histologische Schnitte, Urinzellen) oder Chromosomen. Auf DNA-Ebene eignet sich die FISH besonders zum Nachweis von Genamplifikationen, numerischen Chromosomenveränderungen und Translokationen. Für den Nachweis von Translokationen wird dabei neben der Zielgensonde z. B. eine Zentromersonde des entsprechenden Chromosoms verwendet.
Anwendung findet diese Technik beispielsweise beim Prostatakarzinom zum Nachweis chromosomaler Translokationen oder im Urin von Harnblasenkarzinom-Patienten zum Nachweis von Tumorzellen (Perner et al. 2007); (Junker et al. 2006). Auf RNA-Ebene liegt der Vorteil der ISH in der Möglichkeit, Zellen, die eine bestimmte mRNA-Expression aufweisen, in einem Gewebeverband zu identifizieren.
Eine spezielle Hybridisierungstechnik wird bei der Messung der mRNA-Konzentration des Prostatatumormarkers PCA3 („prostate cancer antigen 3“, auch: DD3) in Urinproben angewendet. Hier wird die Target-RNA zunächst spezifisch angereichert and amplifiziert und anschließend durch Hybridisierung detektiert („APTIMA PCA3 assay“). Dieser Test und weitere Teste, wie der SelectMDx, können eine Entscheidungshilfe zur Durchführung einer Rebiopsie bei Männern mit Verdacht auf Prostatakrebs darstellen (Haese et al. 2008; McGrath et al. 2016; Van Neste et al. 2016).
Zur Validierung von Proteinveränderungen dienen Westernblot (semiquantitativ), ELISA (quantitativ), Immunhistochemie bzw. Immunfluoreszenz.

Panelentwicklung

Die molekulare Analyse spielt eine immer größere Rolle für die individuelle Prognosebewertung und Therapiewahl. Da immer mehr zielgerichtete Therapien, basierend auf der Kenntnis von tumortreibenden Mutationen und veränderten Signalwegen, verfügbar sind, wird die genetische Analyse mehr und mehr integraler Bestandteil der Therapieentscheidung. Inzwischen stehen hierzu einige, von der FDA zugelassene Panels (z. B. MSK-IMPACT, F1CDx), die mehrere Hundert tumorassoziierte Mutationen in Tumorgeweben analysieren können, zur Verfügung. Daneben werden aber auch Panels für das Transkriptom und das Proteom entwickelt. Zur Prognoseabschätzung wurden mehrere Genexpressionstests, z. T. zunächst für das Mammakarzinom, etabliert. Der Array-basierte und durch die FDA zugelassene MammaPrint-Test, der die Expression von 70 an der Proliferation beteiligten Genen analysiert, wird zur Abschätzung des Metastasierungsrisikos von Brustkrebspatientinnen eingesetzt. Vor allem Niedrigrisiko-Patientinnen, die auch ohne adjuvante Chemotherapie eine 10-Jahres-Überlebensrate von 96 % haben, können durch diese Gensignatur identifiziert werden (van de Vijver et al. 2002; Xin et al. 2017). Diese Tests werden nun auch für andere Tumore wie das Prostatakarzinom angeboten. Jedoch sollte hier zunächst eine kritische Analyse des Nutzens in der spezifischen Indikation erfolgen (Cucchiara et al. 2018). Um mögliche Probleme der Tumorheterogenität sowohl im Primärtumor als auch in Metastasen umgehen zu können, rücken „liquid biopsies“ mehr und mehr in den Fokus der Diagnostik. Auch hier sind diverse Panels in der Entwicklung, die vor allem die Analyse zellfreier DNA (cfDNA) ermöglichen werden. Bisher sind jedoch nur Tests für Einzelgene (EGFR, RAS) zugelassen.
Literatur
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