Die Geburtshilfe
Autoren
G. Manegold-Brauer, O. Lapaire, I. Hösli und S. Hahn

Pränatale Diagnostik: Molekularbiologische Methoden

Neben der klassischen Chromosomenuntersuchung im Karyogramm – auch heute noch Goldstandard in der invasiven Pränataldiagnostik – gibt es neuere molekularbiologische Methoden wie z. B. die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), die die pränatalen diagnostischen Optionen wesentlich erweitert haben und auch in der Präimplantations- und Polkörperchendiagnostik eingesetzt werden, da damit auch monogene Erkrankungen in einzelnen Zellen diagnostiziert werden können.
Durch die Fortschritte bei der Analyse von zellfreier DNA im mütterlichen Blut hat die nichtinvasive pränatale Diagnostik Einzug in den klinischen Alltag gefunden. Mit der massiven parallelen Sequenzierung wird zellfreie DNA von Mutter und Fetus im mütterlichen Blut ohne Risiko für die bestehende Schwangerschaft analysiert. Es ist damit zu rechnen, dass in naher Zukunft neben Chromosomenaberrationen noch viele weitere Erkrankungen mit nichtinvasiven Techniken detektiert werden können.

Zum Einstieg

Die heute routinemäßig angebotene pränatale Diagnostik zum Ausschluss von fetalen Aneuploidien und die sonographische Detektion von strukturellen Anomalien sind seit den 1970-er Jahren in der Klinik etabliert. Bei der invasiven Diagnostik mittels Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie besteht jedoch ein Abortrisiko von 0,5–1 %. Dies ist ein wichtiger Grund, weshalb weltweit seit vielen Jahren an neuen, effektiven, verlässlichen und risikofreien Methoden, sowie zusätzlichen Markern für ein pränatales Screening und für die pränatale Diagnostik (Holzgreve und Hahn 2001) geforscht wird. Mit der Entwicklung des sog. „deep sequencing“ („massiv-parallel genomic sequencing“), mit welcher zellfreie fetale und mütterliche DNA analysiert werden kann, hat sich eine vielversprechende Methode im Gebiet der nichtinvasiven pränatalen Diagnostik im klinischen Alltag etabliert (Manegold-Brauer et al. 2014).
Weiter ist mit PCR und FISH auch eine genetische Analyse von Blastomerzellen in der Präimplantationsdiagnostik sowie die indirekte genetische Analyse von Oozyten bei In-vitro-Fertilisation (IVF) mittels Polkörperchendiagnostik möglich.
Ein interdisziplinärer Austausch der Disziplinen pränatale Ultraschalldiagnostik, Reproduktionsmedizin, medizinische Genetik und fetomaternale Medizin (z. B. im Rahmen regelmäßiger sog. „fetal boards“) ist für einen optimalen klinischen Einsatz dieser neuen Errungenschaften essenziell.

Methoden zur Chromosomenzahlbestimmung

Traditionelle Zytogenetik

Chromosom
Ein menschlicher Chromosomensatz besteht aus 23 Chromosomenpaaren. Insgesamt gibt es 22 Autosomen-Paare und ein geschlechtsbestimmendes Gonosomenpaar. Das männliche Geschlecht wird durch das Vorliegen eines Y-Chromosoms bestimmt – in der Karyotypformel dargestellt als 46,XY, während das weibliche Geschlecht 2 X-Chromosomen hat und als 46,XX formuliert wird.
Abweichungen von der normalen Chromosomenzahl, sog. Aneuploidie n, sind die häufigsten Chromosomenanomalien. Dabei wird das Vorliegen von 3 Kopien eines Chromosoms als Trisomie, das Fehlen eines Chromosoms, also das Vorliegen nur einer Kopie, als Monosomie bezeichnet.
Aneuploidien sind die häufigste Ursache für einen intrauterinen Fruchttod. Die Karyotypformel für Aneuploidien beschreibt neben der Chromosomenanzahl und dem Geschlecht spezifisch die vorliegende Aberration, z. B. ein zusätzliches oder fehlendes Chromosom (z. B. 47,XX,+21; 45,XX,–18). Nur wenige Aneuploidien sind mit dem Leben vereinbar, dazu gehören bei den autosomalen Veränderungen die Trisomie 21 (Down-Syndrom), die Trisomie 13 (Pätau-Syndrom) und die Trisomie 18 (Edwards-Syndrom). Unter den gonosomalen Trisomien kommen 47,XXY (Klinefelter-Syndrom), 47,XXX oder 47,XYY vor. Aufgrund der schwerwiegenden Fehlbildungen haben Patienten mit Trisomie 13 oder 18 nur eine geringe Überlebenschance.
Gonosomale Trisomien zeigen meist keine phänotypische Ausprägung und werden oft nur als Zufallsbefund später im Leben diagnostiziert oder als Nebenbefund in einer pränatalen Chromosomenuntersuchung festgestellt. Trisomien der Chromosomen 7 und 16 führen in der Regel zu einem Spontanabort. Die einzige lebensfähige Monosomie ist das Turner-Syndrom (45,X).
Eine wichtige Ursache für die zunehmende Inzidenz fetaler Aneuploidien ist das steigende mütterliche Alter bei der Konzeption, das zu einer Zunahme der Fehlverteilung der Chromosomen in der mütterlichen Meiose führt.
Bei einem mütterlichen Alter von 35 Jahren ergibt sich ein statistisches Risiko für eine Trisomie 21 von ca. 1:250. Bei einer 42-jährigen Frau steigt dieses statistische Risiko auf ca. 1:40 an. Seit Ende der 1990-er Jahre ist der Ersttrimestertest (ETT) in der 12–14. Schwangerschaftswoche verfügbar. Beim ETT erfolgt eine individuelle Risikoermittlung für Chromosomenanomalien. Dabei wird unter Berücksichtigung des maternalen Alters, der sonographisch ermittelten fetalen Nackentransparenzmessung und der Analyse spezifischer plazentarer Hormone im mütterlichen Blut („pregnancy-associated plasma protein A“ (PAPP-A), „free beta-HCG“) ein individuelles Risiko für Aneuploidien in der bestehenden Schwangerschaft ermittelt. Der ETT ist gegenwärtig der am häufigsten eingesetzte Screeningtest zur individuellen Risikoabschätzung für Chromosomenstörungen und kann die Anzahl unnötiger invasiver Untersuchungen deutlich reduzieren (Ekelund et al. 2008).
Praxistipp
Neben der standardisierten sonographischen Untersuchungstechnik zur Ermittlung der Nackentransparenz sollte größter Wert auf die ausführliche Information und Beratung der Schwangeren vor Durchführung des ETT sowie auf die Qualitätssicherung gelegt werden.
Um den Chromosomensatz mittels konventioneller Zytogenetik zu bestimmen, wird während des Zellzyklus das Stadium maximaler Chromosomenkondensation, die sog. Metaphase, künstlich arretiert. An diesen Chromosomen kann mit verschiedenen Farbstoffen (z. B. Quinacrin für Q-Banden, Giemsa für G-Banden) ein charakteristisches Bandmuster erzeugt werden, das es erlaubt, die 23 Chromosomenpaare im Lichtmikroskop voneinander zu unterscheiden.
Neben den genannten numerischen Aberrationen können auch strukturelle Aberrationen im Rahmen der Bänderungs- und lichtmikroskopischen Auflösung, z. B. Translokationen, Deletionen oder Duplikationen, erkannt werden (Abb. 1).
Karyotypisiert werden kann aus allen Geweben, die aktiv teilende Zellen enthalten, oder aus Zellen die sich zur Teilung anregen lassen (z. B. Lymphozyten aus Blut, Hautfibroblasten u. a.).
Eine Herausforderung der Pränataldiagnostik war es, die Gewinnung und Kultivierung fetaler Zellen ohne Schädigung des Fetus zu erreichen. Dies wurde durch die Etablierung der Amniozentese möglich. Ab der 16. Schwangerschaftswoche kann so durch eine sonographisch gesteuerte transabdominale Punktion Fruchtwasser gewonnen werden. Mit dieser Methode konnte 1968 erstmals die Diagnose eines Down-Syndroms gestellt werden (Valenti et al. 1968). Seither hat sich die Amniozentese zum Goldstandard entwickelt, an der andere Methoden der Pränataldiagnostik gemessen werden. Ein gewisser Nachteil dieser Methode ist, dass das Kultivieren der Amniozyten mehrere Tage dauert und deshalb die Ergebnisse der Karyotypisierung nicht sofort vorliegen.
In den meisten Zentren ist heute ein schnelles vorläufiges Ergebnis mit der quantitativen fluoreszierenden (QF)-PCR möglich. Die Detektionsrate der QF-PCR für die häufigsten Chromosomenanomalien (Chromosom 13, 18 und 21 sowie X und Y) liegt bei 98,6 % (Nicolini et al. 2004).
Eine Alternative zur Amniozentese ist die Chorionzottenbiopsie (CVS), bei der ab der 11 + 0 Schwangerschaftswoche eine Probe des Zottengewebes der sich entwickelnden Plazenta entnommen wird. Der Vorteil hier liegt in der früheren Durchführbarkeit der Untersuchung. Des Weiteren kann das gewonnene Zottengewebe schneller analysiert werden und liefert innerhalb von 1–2 Tagen ein zuverlässiges Ergebnis. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass sich in der Plazenta z. T. Chormosomenmosaike finden, die nur auf die Plazenta beschränkt sind und zu unklaren Untersuchungsergebnissen führen und weitere Eingriffe erforderlich machen. Sowohl die Durchführung dieses Eingriffs als auch die Chromosomenpräparation und Auswertung erfordern ein Team von erfahrenen Untersuchern. Aus diesem Grund können diese Untersuchungen nur in spezialisierten Zentren angeboten werden.
Bei bestimmten Indikationen (z. B. bei fetaler Anämie) im späten 2. Trimenon kann auch eine diagnostische Chordozentese zur Gewinnung einer fetalen Blutprobe durchgeführt werden. Hier kann z. B. parallel etwas Blut aus der Nabelschnur entnommen werden, um die fetale Hämoglobinkonzentration zu bestimmen, und in der gleichen Sitzung gewichtsadaptiert fremdes Blut transfundiert werden.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Die oben diskutierten konventionellen zytogenetischen Verfahren sind im klinischen Alltag heute fest etabliert. Sie sind jedoch zeitaufwendig und erfordern einen hohen personellen Einsatz und spezialisiertes Personal.
Die Möglichkeit, rekombinant hergestellte Chromosomenfragmente mit Fluoreszenzfarbstoffen, z. B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), oder Rhodamine zu konjugieren, erlaubt unter gezielter Fragestellungen auch die Chromosomenanalyse ruhender Interphasezellen (Abb. 2). Die sog. FISH-Sonde, welche für eine bestimmte Region auf dem Chromosom spezifisch ist, wird in situ direkt auf die Zellkernchromosomen hybridisiert, wobei sich je nach Sondencharakter verschiedene Bereiche der Chromosomen für unterschiedliche Fragestellungen analysieren lassen: Man unterscheidet Zentromersonden zur Detektion von Aneuploidien der Chromosomen 13,18, 21, X und Y, sowie Sonden für spezifische Chromosomenabschnitte (Mikrodeletionen, z. B. Di-George-Syndrom [22q11]).
Heute werden auch FISH-Schnelltests für die Analyse von unkultivierten Amniozyten kommerziell angeboten (Eiben et al. 1998), mit denen die 5 häufigsten numerischen Chromosomenaberrationen für die Chromosomen 13, 18, 21, X und Y analysiert werden können. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass ein vorläufiges Ergebnis innerhalb von 24 h nach der Amniozentese geliefert werden kann, das die häufigsten Chromosomenstörungen ausschließt. So kann in gewissen Fällen bei Paaren, die ein sehr hohes Risiko für eine fetale Chromosomenstörung haben, ein schnelles Ergebnis erzielt werden und so die mit Ängsten besetzte Zeit bis zum Ergebnis der vollständigen Karyotypisierung reduziert werden.
Praxistipp
Es muss darauf hingewiesen werden, dass die FISH-Sonden nur spezifische Chromosomenloci markieren und nicht wie bei der Karyotypisierung eine vollständige Genomanalyse darstellen. Strukturelle Aberrationen können nicht detektiert werden.
Aufgrund der Gefahr eines falsch-negativen Ergebnisses im FISH-Schnelltest ist es immer obligat, diese Methode an eine konventionelle Chromosomenanalyse zu koppeln. Auch muss eine Verfälschung des Resultates durch eine maternale Kontamination ausgeschlossen werden.
Eine Weiterentwicklung der FISH-Technologie ist das sog. „whole chromosome-painting“ (WCP) ) oder multicolour-FISH-Verfahren (M- FISH ) (Ried et al. 1998). Bei diesem Verfahren können gleichzeitig alle 24 Chromosomen (1–22, X, Y) in unterschiedlichen Farben dargestellt werden. Dies geschieht mit Hilfe von FISH-Sonden, die über die gesamte Länge des Metaphasechromosoms binden und es dadurch einheitlich färben.
Eine ähnliche Technologie ist die spektrale Karyotypisierung (SKY) (Schröck et al. 1996). Statt 5 Aufnahmen mit verschiedenen Farbfiltern und deren Überlagerung wie bei M-FISH wird bei SKY nur ein Digitalbild des M-FISH-Präparates mittels Spektralphotometrie aufgenommen und anschließend mittels Fourier-Transformation analysiert. Dabei wird das fluorimetrische Spektrum jedes einzelnen Bildpixels mit Hilfe eines Interpherometers vermessen. Die Daten werden zur Erstellung eines pseudofarbigen Bildes, auf dem alle Chromosomen zu erkennen sind, ausgewertet. Anwendung finden beide Techniken v. a. in der Tumorzytogenetik, weniger in der Pränataldiagnostik.
Als weitere Methode haben array-basierte Verfahren wie „comparitive genomic hybridisation“ (CGH) bei bestimmten Fragestellungen Einzug in die Praxis erhalten (Lapaire et al. 2007b). Hier handelt es sich um eine hochauflösende fluoreszenzbasierte Methode, bei der Dosisabweichungen (Deletionen und Duplikationen) des zu untersuchenden Genoms im Vergleich zu einem Referenzgenom detektiert werden.

Quantitative fluoreszierende PCR (QF-PCR)

Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Entwicklung der Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine der bedeutendsten Innovationen der modernen Molekularbiologie (Mullis et al. 1986). Bei diesem Verfahren wird eine bestimmte Gensequenz durch wiederholte Reaktion mit einer DNA-Polymerase tausendfach amplifiziert. Dies ermöglicht die Untersuchung von DNA-Sequenzen aus nur wenigen oder sogar aus nur einer einzelnen Zelle.
Die numerischen Chromosomenanalyse mittels QF-PCR wird anhand der Amplifikation von Mikrosatelliten auch „short tandem repeats“ (STR) genannt, innerhalb eines Chromosoms ermittelt. STR sind meist nichtkodierende DNA-Sequenzen, die über das gesamte Genom verteilt auftreten (Verma et al. 1998). Sie sind jeweils durch ihre spezifische Position auf den Chromosomen definiert und bestehen aus sich wiederholenden kurzen Nukleotidsequenzeinheiten, deren Wiederholungsanzahl sich interindividuell unterscheidet. Verschiedene Individuen und auch beide Kopien desselben Chromosoms eines Individuums haben mit hoher Wahrscheinlichkeit unterschiedliche STR-Wiederholungsanzahlen und unterscheiden sich daher geringfügig in ihrer Größe. Da die DNA-Sequenzen, die einen bestimmte STR-Sequenz flankieren, sehr spezifisch für das gegebene Chromosom sind, können diese STR-Allele leicht PCR-amplifiziert und analysiert werden.
Zur fetalen Chromosomenanalyse werden zuvor vom fraglichen Chromosom die elterlichen STR-Allele aus dem Blut typisiert, um ihre Anwesenheit anschließend im fetalen Gewebe zu analysieren. Die Länge der amplifizierten Allele wird mit einem automatischen Sequenzierer bestimmt, der es ermöglicht, PCR-Produkte zu differenzieren, die sich nur in einem Nukleotid unterscheiden. Durch diese Analyse ist es möglich, das jeweils dazugehörige Chromosom zu detektieren. So unterscheidet sich die Analyse eines aneuploiden Chromosomensatzes von einem normalen Chromosomensatz insofern, dass 3 anstelle von 2 STR-Markern vorhanden sind. Dies wird entweder sichtbar durch 3 verschiedene STR-Allele (Abb. 3) oder durch die doppelte Menge eines der STR-Allele.
Da die QF-PCR Methode ebenfalls sehr schnell in einem automatischen Verfahren erfolgt, hat sie sich als Konkurrenz zum FISH-Schnelltest etabliert und konnte auch in diversen großen Studien ihre Verlässlichkeit nachweisen (Mann et al. 2001; Verma et al. 1998). Sie hat aber auch deutlich die Limitierungen gezeigt (Evans et al. 1999).

Real-time-PCR (Echtzeit-PCR)

Eine neue Methode zur Bestimmung fetaler Aneuploidien beruht auf der sog. Echtzeit-PCR („real time PCR“; Heid et al. 1996). Bei dieser PCR-Methode wird die Menge der amplifizierten Sequenz nach jedem Zyklus der PCR-Reaktion einzeln über Fluoreszenzmessung analysiert, was eine präzise Rückquantifizierung der Menge an Ausgangsprodukt im Bereich der exponentiellen PCR-Phase ermöglicht. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Methode zwischen einer oder zwei Kopien eines bestimmten Gens oder Genprodukts unterscheiden kann. So kann im Falle einer Rhesus-D-Homozygotie des Vaters im Vergleich zu einer Heterozygotie die doppelte Menge an Rhesus-D-Erbgut nachgewiesen und so die Gefahr einer Rhesus-D-Inkompatibilität frühzeitig erfasst werden (Abb. 4; Chiu et al. 2001; Li et al. 2005a).
Ebenso kann z. B. ein Anstieg an Erbgut um 50 % bei einer Trisomie gezeigt werden (Hahn et al. 2010). Derzeit beschränkt sich der Einsatz dieses Tests noch auf Chromosom 21, zukünftig soll er aber auch auf die anderen wichtigen Chromosomenstörungen erweitert werden (Abb. 5). Aufgrund fehlender Studien steht eine Anwendung dieser Tests in der Klinik noch aus.

Diagnostik von Einzelgenerkrankungen mittels PCR

Die konventionelle Zytogenetik mit einer Auflösung von 5–10 Mio. Basenpaaren eignet sich nicht für die Untersuchung von monogenen Erkrankungen, die auf Veränderungen (Mutationen) in einzelnen Genen beruhen. Die Entwicklung der PCR hat die molekulargenetische Diagnostik revolutioniert, indem sie ermöglichte, anhand sehr kleiner Mengen von Gewebe, sogar an einzelnen Zellen, in kurzer Zeit bestimmte gesuchte DNA-Sequenzen zu vervielfältigen und bis auf die Genauigkeit eines Basenpaars zu untersuchen.
Bei der Diagnostik des fetalen Rhesus-D-Status sollte bei einem Rhesus-negativen Kind und einer Rhesus negativen Mutter kein PCR-Produkt amplifiziert werden, da diesen Individuen das Rhesus-D-Gen generell fehlt (Abb. 6). Davon abzugrenzen ist die Anwesenheit des sehr ähnlichen Rhesus-C/E-Gens, wobei auch zusätzlich Sequenzunterschiede zwischen diesen beiden Genen zur Diskriminierung herangezogen werden können.
Zur Analyse von Genmutation en kann entweder die automatische PCR-Sequenzanalyse, die die veränderten Nukleotidsequenzen erfasst (Abb. 7), oder – falls die Mutation bekannt ist – eine allelspezifische PCR durchgeführt werden (Newton et al. 1989). Letztere Methode – auch ARMS-PCR („amplification refractory amplification system PCR“) genannt – erlaubt den Nachweis bereits bekannter Punktmutationen durch spezifische Primer für die gesuchte Mutation. Liegt keine Mutation vor, wird kein PCR-Produkt generiert. Auf diese Art können normale Allele und Mutationen diagnostiziert werden. Mutationsanalysen für bekannte Gene wie z. B. bei Mukoviszidose, β-Thalassämie sind auf diese Weise möglich.
Die ARMS-PCR findet z. B. in der Geburtshilfe Anwendung, um zwischen den zwei sehr ähnlichen Kell-K- und kell-k-Allelen zu diskriminieren, da diese zwei Allele sich nur in einem Nukleotid unterscheiden.
Sind nur flankierende Sequenzen von krankheitsrelevanten Genen bekannt, dann kann eine Mutationsanalyse evtl. indirekt über eine familiäre Haplotypenanalyse durchgeführt werden (Abb. 6 und 7).
Voraussetzung für diese Untersuchungen ist reines fetales Gewebe ohne Verunreinigung durch mütterliches Material, das u. U. eine Fehldiagnose zur Folge hätte. Durch die sehr hohe Empfindlichkeit der PCR können schon kleinste Kontaminationen das Resultat beeinträchtigen.

Präimplantationsdiagnostik (PID) und Polkörperchendiagnostik

Frühere Experimente in Tiermodellen haben gezeigt, dass die Entnahme von 1–2 Einzelzellen aus einem Präimplantationsembryo im 6- bis 10-Zell-Stadium sich nicht nachteilig auf die spätere Entwicklung des Fetus auswirkt (Hardy et al 1990). Da sowohl die FISH- als auch die PCR-Methode die Untersuchung einzelner Zellen erlaubt (Hahn et al. 2000), ist die Präimplantationsdiagnostik –abhängig von der Gesetzgebung – zur Realität geworden. Sie ist in der Klinik eine mögliche Option bei Paaren, die Träger schwerer Erbkrankheiten sind.
Die erste Studie bezüglich der klinischen Anwendung einer PID wurde von (Handyside et al. 1989) in London durchgeführt. Sie bestimmten bei Paaren mit einem erhöhten Risiko für X-chromosomale genetische Störungen wie z. B. die Duchenne-Muskeldystrophie, das fragile X-Syndrom oder die Hämophilie A das Geschlecht des Fetus vor der Implantation.
Inzwischen ist es technisch möglich, monogene Erkrankungen durch PCR-Analyse vor der Implantation festzustellen, z. B. autosomal dominante Störungen wie die Chorea Huntington, aber auch rezessive Erkrankungen wie die Mukoviszidose, Hämoglobinopathien und die Tay-Sachs-Erkrankung (Wells und Delhanty 2001).
Als weitere Möglichkeit bietet sich bei der IVF, die z. B. bei einem erhöhten mütterlichen Alter, einer Fertilitätsstörung oder bei bekanntem Risiko für eine Erbkrankheit durchgeführt wird, die sequenzielle Untersuchung einzelner Zellen durch FISH mit anschließender genspezifischer PCR an, um einen aneuploiden Feten zu detektieren (Hahn et al. 2000).
Obwohl weltweit schon mehrere hundert dieser Untersuchungen durchgeführt worden sind (Verlinsky et al. 2004), bleibt diese Methode den Hochrisikofällen vorbehalten, da es sich um technisch sehr anspruchsvolle und nur in wenigen Laboratorien durchführbare Untersuchungen handelt. Aus diesem Grund erweisen sich die Ängste, diese Technik könne zu einer „Flut an Designer-Babys“ führen, als unbegründet.
Nach jahrelangen Debatten wurde 2014 nun die Präimplantationsdiagnostik in einem engen gesetzlichen Rahmen in Deutschland eingeführt. Seit diesem Zeitpunkt kann dann bei Risikosituationen, in denen nach einer Sterilitätstherapie aufgrund der Erbanlagen eine Tot-/Fehlgeburt oder eine schwere Erkrankung des Kindes wahrscheinlich ist, eine Präimplantationsdiagnostik durchgeführt werden.
Eine eingeschränkte Alternative bietet die sog. Polkörperchendiagnostik die die während der Oozytenteilung entstehenden Polkörperchen zur genetischen Analyse heranzieht. Dieses indirekte Verfahren untersucht nur das genetische Komplement der Eizelle, sodass Aberrationen in der Eizelle selbst nicht zu 100 % ausgeschlossen werden können. Weiterhin wird nur der mütterliche Beitrag zur Zygote untersucht, und der enge Zeitplan einer IVF/ICSI lässt nur wenig Zeit für die technisch anspruchsvolle Untersuchung.

Nichtinvasive Methoden

Fetale Zellen im mütterlichen Blut

Derzeit stehen nur invasive Verfahren wie die oben beschriebene Amniozentese oder die Chorionzottenbiopsie als klinisch etablierte Methoden für die Gewinnung von fetalem Gewebe zur Pränataldiagnostik zur Verfügung. Beide bergen jedoch Risiken für Mutter und Kind, weshalb aktiv seit vielen Jahren an sicheren nichtinvasiven Alternativen geforscht wird (Holzgreve 1997). Eine Möglichkeit ist die selektive Anreicherung intakter fetaler Zellen aus mütterlichem Blut (Holzgreve und Hahn 2001), deren Vorhandensein schon seit dem 19. Jahrhundert bekannt ist (Lapaire et al. 2007). Das seltene Vorkommen (1 in 106–107 mütterlichen Zellen mit Zellkern) erschwert jedoch ihre gezielte Isolation und Analyse (Holzgreve und Hahn 2001) und ist deshalb bis heute nicht klinischen einsetzbar (Hahn et al. 2009).
Die magnetaktivierte Zellsortierung (MACS) (Radbruch et al. 1994) unter Verwendung von Antikörpern gegen die spezifischen Oberflächenproteine CD71 und Glycophorin A zeigte in einer Multizenterstudie eine effizientere Anreicherung fetaler Erythroblasten als die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) (Hulett et al. 1969; Bianchi et al. 2002).
Neueste Anreicherungstechniken wie mittels Sojabohnen-Agglutinin-Galactose-spezifischem Lectin, beschrieben von Kitagawa et al. (2002), resultieren im Vergleich zu MACS in 8-fach höheren Erythroblastenzahlen (Babochkina et al. 2005). Die fetalen Erythroblasten – Erythrozyten mit Zellkern – erscheinen als ideale Zielzellen, da sie früh in der Entwicklung im fetalen Blut vorkommen und recht spezifische Antigene exprimieren, die ihre Erkennung und Anreicherung vereinfachen. Gegenüber fetalen Lymphozyten haben sie eine kurze Lebensdauer, was verhindert, dass fetale Zellen aus vorherigen Schwangerschaften in die Untersuchung miteinbezogen werden (Hahn et al. 1998). Mittels FISH und PCR können einzelne Zellen erfasst und rasch fetale Aneuploidien und monogene Erkrankungen diagnostiziert werden (Hahn et al. 1999; Troeger et al. 1999).
Studienbox
Die initial vielversprechenden Ergebnisse haben die amerikanische Gesundheitsbehörde (National Institutes of Health [NIH]) veranlasst, eine groß angelegte Multizenterstudie zu fördern, die zum Ziel hat, die Wirksamkeit dieser Technologien im Vergleich zu den herkömmlichen invasiven Methoden zu belegen (Bianchi et al. 2002). Die Ergebnisse dieser Studie mit einer Sensitivität von 74 % (95 %-CI: 61–87 %) deuten darauf hin, dass das fetale Geschlecht und eine fetale Aneuploidie mit einer Sensitivität und Spezifität entdeckt werden kann, die einem einzelnen Serummarker gleichkommt. Signifikante technische Fortschritte sind deswegen notwendig – so die Autoren –, damit diese Technik sich im klinischen Alltag etablieren kann (Bianchi et al. 2002).
Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Erfassung von fetalen Genen während der Schwangerschaft, wie dem fetalen Rhesus-D-Gen, dem SRY-Lokus auf dem Y-Chromosom oder dem β-Globin-Lokus bei der Thalassämie erzielt (Troeger et al. 1999; Di Naro et al. 2000).
Im adulten Organismus sind Erythroblasten auf das Knochenmark beschränkt, jedoch wandern sie in der Schwangerschaft auch in den Blutkreislauf ein, sodass die aus dem maternalen Blut isolierten Erythroblasten eine Mischpopulation fetaler und mütterlicher Herkunft darstellen. Fetale Erythroblasten exprimieren intrazelluläre Proteine wie das fetale Hämoglobin, oder Oberflächenantigene (z. B. Transferrinrezeptor, Blutgruppenantigene), die zur Detektion und Anreicherung genutzt werden können. Vor der genetischen Analyse muss also eine Abklärung zum Ursprung der vorliegenden Erythroblasten stehen, wobei ca. 50 % maternaler Herkunft sind (Troeger et al. 1999). Noch sind keine Erythroblastenantigene mit rein fetaler Spezifität bekannt, die eine Unterscheidung direkt während der Anreicherung ermöglichen würden.
Weiterhin haben neuere Studien gezeigt, dass fetale Erythroblasten gegenüber maternalen Erythroblasten mittels FISH nur bedingt analysierbar sind (Mergenthaler et al. 2005). Dies wird u. a. auf die fetale Erythroblastenmorphologie, induziert durch unterschiedliche O2-Konzentrationen in fetalem und mütterlichem Blutkreislauf, zurückgeführt. Diese Methoden zur fetalen Zellanalyse sind derzeit noch zu arbeitsintensiv und langwierig, um sie in der Routinediagnostik einsetzen zu können. Die Ausarbeitung effizienter und automatischer Anreicherungsmethoden sowie spezielle softwaregesteuerte Mikroskope zur schnelleren und automatischen Auffindung und Relokalisation der Erythroblasten sind notwendig (Kim und Makar 2012).

Zirkulierende fetale DNA

Seit Jahrzehnten ist das Vorhandensein zellfreier zirkulierender Desoxyribonukleinsäure (DNA) bekannt (Anker und Stroun 2000). Durch die Entdeckung zellfreier Tumor-DNA im Plasma von Krebspatienten hat dieses Gebiet stark an Bedeutung gewonnen (Chen et al. 1996). Diese DNA scheint ein Abbauprodukt des apoptotischen Zelltodes zu sein.
Angeregt durch die Ähnlichkeiten der Plazenta mit Tumoren konnten Lo et al. (1997) zeigen, dass zellfreie fetale DNA im Kreislauf von Schwangeren vorhanden ist.
Diese Arbeitsgruppe konnte mit der Bestimmung des Y-Chromosoms männlicher Feten demonstrieren, dass fetale DNA im mütterlichen Blut in einer viel höheren Konzentration vorhanden ist als fetale Zellen. Mittels quantitativer PCR konnten hohe mittlere Konzentrationen an fetaler DNA (bis zu 10 % der totalen DNA) in der frühen und späten Schwangerschaft nachgewiesen werden. Wie auch bei den Erythroblasten in maternalem Blut besteht die zellfreie DNA ebenfalls aus fetaler und maternaler DNA.
Daher ist die Analyse von fetalen Genloci, die im maternalen Genom nicht vorhanden sind wie das Y-Chromosom und Rhesus-D-Gen bei Rhesus-D-negativen Schwangeren (Lo et al. 1999; Zhong et al. 2001a, b), einfacher als z. B. die Analyse von Punktmutationen in Genen, die auch in der mütterlichen DNA vorliegen. Der Test zur Rhesusabklärung wird aufgrund seiner hohen Genauigkeit in mehreren Zentren kommerziell angeboten (Clausen et al. 2012).
Aufgrund von unterschiedlichen Varianten des RHD-D-Gens ist eine sog. „Multiplex-PCR“ notwendig, in der verschiedene Regionen des Rhesus-D-Gens amplifiziert werden. Eine Deletion des Rhesus-D-Gens ist die häufigste Form bei Rhesus-D-negativen Kaukasierinnen. Im Gegensatz dazu trägt z. B. die Mehrheit der Rhesus-D-negativen afrikanischen Patientinnen ein Pseudogen (RHDψ) oder ein (C)cdes-Allel. In beiden Allelen sind Rhesus-D-spezifische Sequenzen vorhanden. Aufgrund der Anwesenheit eines Stop-Codons RHDψ) oder des Ersatzes der Rhesus-D-spezifischen Sequenzen bei Rhesus-CE-spezifischen Sequenzen ([C]cdes) sind keine feststellbaren D-Epitope auf den Erythrozyten vorhanden. Diese Sonderformen müssen bei der Multiplex-PCR mitberücksichtigt werden, um eine Sensitivität von >99 % zu erreichen (Lapaire et al. 2008).
Um die fetale DNA auch für in der Mutter ähnlich vorliegende Gensequenzen spezifisch untersuchen zu können, werden aktuell die Möglichkeiten zur Unterscheidung beider zellfreier DNA untersucht, um Parameter zu identifizieren, die die selektive Anreicherung der fetalen DNA erleichtern. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass >90 % der fetalen zellfreien DNA in Fragmenten <0,3 kb vorliegen, wohingegen die mütterlichen Fragmente im Durchschnitt wesentlich >1 kb sind (Li et al. 2004). Nach Größenabtrennung der fetalen DNA aus dem DNA-Gesamtgemisch konnten mütterliche bzw. väterliche ererbte STR leicht detektiert werden (Li et al. 2004). Weiterhin konnten, basierend auf dieser fetalen DNA-Anreicherung, mittels allelspezifischer PCR mit 93,8 % Spezifität und 100 % Sensitivität fetale β-Thalassämiemutationen (Li et al. 2005a) ebenso wie ein Fall mit einer fetalen Achondroplasiemutation nachgewiesen werden (Li et al. 2005b).
Studienbox
Die fetale DNA lässt sich mittels der oben erwähnten Echtzeit-PCR sehr genau quantifizieren (Lo et al. 1998). Studien unseres Labors und anderer Forschungsgruppen haben gezeigt, dass die Menge an zellfreier fetaler DNA erhöht ist bei Schwangerschaften mit bestimmten Aneuploidien, wie bei der Trisomie 21, nicht aber bei der Trisomie 18 (Lo et al. 1999; Zhong et al. 2000). Weiterhin zeigt sich eine Erhöhung der zellfreien DNA bereits im 2. Trimenon bei Schwangerschaften, in denen sich später eine Präeklampsie entwickelt (Leung et al. 2001; Zhong et al. 2001b). Dies deutet darauf hin, dass die Quantifizierung der zellfreien fetalen DNA im mütterlichen Blut als zusätzlicher Marker in der Schwangerschaft dienen könnte (Holzgreve und Hahn 1999).

Nichtinvasive molekulargenetische Pränataltests (NIPT)

Die Einführung der nichtinvasiven Methode zur Detektion der häufigsten fetalen Aneuploidien (Trisomie 21, 18, 13) anhand von fetaler DNA im mütterlichen Blut bietet seit kurzem eine risikolose Alternative zur invasiven Diagnostik mittels Chorionzottenbiopsie (CVS) oder Amniozentese (AC).
Durch die Technik des „massively parallel genomic sequencing testing“ „next generation sequencing“, NGS), „deep sequencing“ oder auch „massive parallel sequencing“, MPS) konnten kommerziell verfügbare nichtinvasive molekulargenetische Pränataltests („non-invasive prenatal testing“, NIPT) in den klinischen Alltag eingeführt werden.
Mit dieser Methode werden Millionen von Fragmenten der maternalen und fetalen DNA sequenziert und mittels komplexen bioinformatischen Analyseschritten den jeweiligen Chromosomen zugeordnet. Aufgrund der extrem großen Datenmenge können im Fall einer Aneuploidie (z. B. Trisomie 21) sehr diskrete Mengenunterschiede festgestellt werden (Abb. 8). So können alleine für das Chromosom 21 über 100.000 Messungen von Sequenzierungen analysiert werden.
Kommen bei einer Schwangeren mit euploidem Feten ca. 1,25 % der Messungsergebnisse vom Chromosom 21, so sind es im Fall einer Trisomie 21 ca. 1,32 %. Der Cut-off-Wert zu einem abnormen Resultat liegt bei 3 Standardabweichungen eines euploiden Fetus (Abb. 9).

Indikation

Es besteht ein weitreichender Konsens, dass dieser komplexe und kostenintensive Test erst nach ausführlicher Beratung und nach Vorliegen eines Ersttrimesterscreenings durchgeführt werden sollte (Benn et al. 2012; Kagan et al. 2012), wobei mittels sonographischer Messung der fetalen Nackenfalte, den beiden biochemischen Markern PAPP-A und β-HCG sowie dem mütterlichen Alter eine individuelle Risikoberechnung als Basis für das weiterführende Beratungsgespräch dient.
Aufgrund des Risikos eines falsch-positiven Test-Resultates von 0,5 % (Kagan et al. 2012) und den Konsequenzen und Risiken einer weiterführenden invasiven Diagnostik wird ein nichtinvasiver molekulargenetischer Pränataltests nur bei einem mittleren Risiko nach ETT empfohlen. Bei einem hohen Risiko (>1:50) sollte weiterhin eine invasive Diagnostik diskutiert und empfohlen werden.
Studienbox
Mehrere Validierungsstudien wiesen eine Detektionsrate für Trisomie 21 von >99 %, 98 % für Trisomie 18 und 89 % für Trisomie 13, dies bei einer falsch positiv Rate (FPR) von 0.1 %, 0.1 % und 0.4 % (Chiu et al. 2011; Ehrich et al. 2011; Sparks et al. 2012; Palomaki et al. 2011; Chen et al. 2011; Bianchi et al. 2012; Norton et al. 2012; Guex et al. 2013).
Neue kleinere Studien zeigen, dass auch andere Chromosomenstörungen wie eine Trisomie 16, 22, Turner Syndrom (45 X0) sowie 47 XXX mit hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden können (Guex et al. 2013).

Ausblick

Die Pränataldiagnostik wurde in den letzten 4 Jahren durch die gewaltigen Fortschritte auf dem Gebiet der nichtinvasiven pränatalen Diagnostik revolutioniert.
Gegenüber den langjährigen Schwierigkeiten mit der Analyse fetaler Zellen aus maternalem Blut haben aufgrund der technischen Fortschritte nichtinvasive molekulargenetische Pränataltests, die aus dem mütterlichen Blut extrahierte fetale zirkulierende DNA mittels Sequenzierung analysieren, einen erstaunlich schnellen Einzug in den klinischen Alltag gefunden (Holzgreve 2013). Damit ist eine langjährige Vision vieler Pränatalmediziner in Erfüllung gegangen.
Schwierigkeiten bereitet im Alltag die immer komplexer werdende Beratung der Schwangeren. Eine weitere Herausforderung stellt die Entwicklung von Algorithmen dar, die den klinischen Einsatz der sich sehr rasch entwickelnden nichtinvasiven molekulargenetischen Pränataltests regeln, sowie die Integration derselben in internationale Guidelines, die es letztlich ermöglichen sollten, dass die Methode allen Schwangeren bei korrekter Indikation zur Verfügung steht. Die Diskussionen bezüglich der Kostenübernahme und der möglichen Indikationen werden aktuell in Deutschland wie in der Schweiz mit den jeweiligen Gesundheitsbehörden geführt (Manegold-Brauer et al. 2014, Manegold-Brauer et al. 2015).
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