Die Urologie
Autoren
A. Paradowska-Dogan und V. Ziller

Assistierte Reproduktion - andrologische Aspekte

In der assistierten Reproduktion hat vor allem die Weiterentwicklung diverser Techniken wie der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) bei männlichen Fertilitätsstörungen eine optimale Behandlung des unerfüllten Kinderwunsches ermöglicht. Aus andrologischer Sicht ist primär die diagnostische Einschätzung des Fertilisierungspotenzials der Spermien mit Hilfe einer Spermiogramm-Analyse oder einer histologischen Untersuchung der Spermatogenese aus Stanzbiopsien (diagnostische Hodenbiopsie) entscheidend, um den Schwergrad einer männlichen Subfertilität zu erfassen und danach die geeignete Therapie zu wählen. Selbst bei einer Azoospermie stehen heute verschiedene operative Methoden zur Rekonstruktion oder zur Spermatozoengewinnung zur Verfügung. Weiterhin ist die testikuläre Spermienextraktion (TESE) die Methode der Wahl zur Spermiengewinnung für die ICSI. Sie wird ergänzt durch mikroskopische Verfahren (mTESE) oder auch diagnostische Methoden wie dem molekularen Nachweis von Protamin aus dem Biopsat. Protamin lässt sich nicht nur als zuverlässiger Marker für die Anwesenheit von Spermatozoen in Hodenbiopsien nutzen, sondern auch als Biomarker für deren Fertilisierungspotenzial. In Zukunft werden voraussichtlich Verfahren zur Produktion von Spermatozoen aus Stammzellen eine weitere Option bieten.
Seit der revolutionären Einführung der 1. erfolgreichen In-vitro-Fertilisation durch Robert Edwards und Patrick Steptoe am 25.10.1978 konnten nicht nur die weiblichen Fertilitätsprobleme wie der Tubenschaden behandelt werden. Die Weiterentwicklung diverser Techniken wie der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI, Abb. 1) bieten heute vor allem auch bei einer männlichen Fertilitätsstörung eine optimale Therapieoption zur Behandlung eines unerfüllten Kinderwunsches.
Aus andrologischer Sicht ist die Einschätzung des Fertilisierungspotenzials der Spermien mit Hilfe einer Spermiogramm-Analyse oder einer histologischen Untersuchung der Spermatogenese aus Stanzbiopsien (diagnostische Hodenbiopsie) entscheidend, um den Schwergrad einer männlichen Subfertilität zu erfassen und danach die geeignete Therapie zu wählen. Unter befruchtungskompetenten Spermien versteht man motile, normal geformte Spermatozoen mit intakter Membranstruktur und oberflächlichen Zona-pellucida-Interaktionsproteinen, die in der Lage sind, die Eizelle durch die Motorik der Flagellum zu erreichen, mit den Oozyten-Rezeptoren zu interagieren, die Oolema zu durchdringen und mit dem haploiden Chromosomensatz die genetischen und epigenetischen Faktoren für die Embryogenese zu transportieren.
Je nach Ausprägung einer Störung können therapeutische Maßnahmen geplant werden (Abb. 2). Grundsätzlich stehen bei andrologischen Störungen neben den konservativen und den operativen Optionen beim Mann, die Maßnahmen der assistierten Reproduktion zur Verfügung. Maßgeblich sind dies heutzutage
  • die intrauterine Insemination (IUI),
  • die In-vitro-Fertilisation (IVF) und
  • die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI).
Ergänzt werden diese Verfahren durch verschiedene Aufbereitungstechniken, Spermienselektionsmethoden oder Spezialmedien zur Unterstützung der Befruchtung. Bei geringfügigen Einschränkungen betreffend Spermienzahl, Spermienkonzentration, Motilität und Morphologie entsprechend den WHO-Referenzwerten (WHO 2010), kann eine IUI ins Auge gefasst werden. Wird ein Oligo-Astheno-Teratozoospermie(OAT)-Syndrom diagnostiziert, das mit erheblichen Einschränkungen der Spermienqualität einhergeht, so ist die Indikation zur IVF mit ICSI gegeben.
Das vollständige Fehlen von Samenreifungszellen und Samenzellen im Ejakulat bezeichnet man als Azoospermie, die schwerste Art der männlichen Infertilität, die bei 12 % aller Infertilitätspatienten vorkommt. Aufgrund der Ätiologie kann zwischen
  • einer obstruktiven Azoospermie (Verschluss der ableitenden Samenwege, Transportstörung) und
  • einer nichtobstruktiven Azoospermie (testikulär bedingte Azoospermie, Keimzellprodu-ktionsstörung)
unterschieden werden.
Bei ca. 2 % der Männer tritt ein Verschluss des Vas deferens auf. Im Nebenhoden ist ein Verschluss an verschiedenen Lokalisationen möglich, einschließlich einer Obstruktion des Ductus ejaculatorius. Das Hauptziel einer operativen Maßnahme ist die Wiederherstellung der natürlichen Konzeption durch die Rekonstruktion der durch einen Verschluss betroffenen Samenwege. Zu den refertilisierenden Eingriffen gehören
  • die Vasovasostomie,
  • die Tubulo(epididymo)-Vasostomie und
  • die transurethrale Resektion des Ductus ejaculatorius (TURED).
Durch Einsatz der genannten Operationstechniken wird die Freistellung der Samenwege generell in 70–90 % der Fälle erreicht, die Schwangerschaftsraten liegen bei 30–50 % kumulativ. Bei Versagen rekonstruktiver Techniken stehen folgende operative Methoden zur Spermatozoengewinnung bei Verschlussazoospermie zur Verfügung:
  • perkutane epididymale Spermatozoenaspiration (PESA),
  • perkutane testikuläre Spermatozoenaspiration (TESA)
  • Aspiration des Vas deferens,
  • mikrochirurgische epididymale Spermatozoenaspiration (MESA).
Das Standardverfahren nach der Spermatozoengewinnung ist die Kryokonservierung der Aspirate zur späteren Verwendung im Rahmen des ICSI-Zyklus.
Im Gegensatz zur obstruktiver Azoospermie sind bei schweren Formen von Spermatogenesedefekten (quantitative oder qualitative Störung der Spermatogenese, Spermatogenesearrest, Sertoli-cell-only-Syndrom [SCO], bunte Atrophie [sog. mixed atrophy, heterogene Phänotypen der Keimzellen in verschiedenen Tubuli im histologischen Schnitt erkennbar. Neben der Tubuli mit intakter Spermatogenese können sich Tubuli mit gestörter Spermatogenese bis zum Sertoli-cell-only Phänotyp finden lassen; Sigg und Hedinger 1981], Klinefelter-Syndrom, hypergonadotrope Azoospermie) meistens nicht genügend oder keine Spermatozoen in Aspiraten auffindbar. Trotzdem kommen bei 35–50 % der Patienten sog. Spermatogeneseinseln, d. h. fokale Regionen innerhalb des Hodens mit zumindest qualitativ intakter Spermatogenese vor.
Die testikuläre Spermienextraktion (TESE) ist im Rahmen reproduktionsmedizinischer Maßnahmen die Methode der Wahl zur Spermiengewinnung für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI), bei der testikulären Azoospermie oder erfolgloser ICSI mit Ejakulatspermien bei Kryptozoospermie (<1 Mio. Spermien/ml) als auch bei Nekrozoospermie (keine Beweglichkeit der Spermien). Unter TESE versteht man eine multifokale chirurgische Hodenbiopsie, die auf Entnahme von maximal 3 mm großen Gewebestücken basiert. Zur Verbesserung der Prognose wird zusätzlich jede Lokalisation mit unterschiedlichen Verfahren getestet, um fest zu stellen in welcher Lokalisation die höchste Wahrscheinlichkeit besteht, Spermatozoen für eine ICSI zu isolieren. Ein Gewebestückchen wird für die histologische Beurteilung der Spermatogenese nach Bergmann Score entnommen. (Bergmann und Kliesch, 2009). Der 2. Teil der gleichen Lokalisation dient für die TESE-Aufbereitung und zur Kryokonservierung. Neben der histologischen Aufbereitung und Beurteilung nach Bergmann besteht die Möglichkeit des molekularen Nachweises von Protamin aus dem übrigen Gewebeteil (Steger 2008). Der Nachweis von Protamin hat sich nicht nur als zuverlässiger Marker für die Anwesenheit von Spermatozoen in Hodenbiopsien erwiesen, sondern nachfolgend auch das Protamin-1 zu Protamin-2 Verhältnis als Biomarker für das Fertilisierungspotenzial von Spermatozoen (Rogenhofer et al. 2013).
Die mit einem Operationsmikroskop assistierte TESE bezeichnet man als Mikro TESE (mTESE). Aufgrund der geringeren Gewebeentnahme und der hohen Spermiengewinnungsrate von ca. 50 % wird die mTESE heute bevorzugt für die Therapie der nichtobstruktiven Azoospermie angewendet. Während der mTESE werden nach der Öffnung der Tunica albuginea mit mittlerer Inzision unter dem Operationsmikroskop gezielt solche Tubuli seminiferi isoliert, die eine bestimmte morphologische Dilatation im Vergleich zu umliegenden nicht Spermatiden enthaltende Tubuli aufweisen. Mehreren Studien zufolge erlaubt diese Selektion spermatogenetisch aktive Regionen zu identifizieren und erhöht die Wahrscheinlichkeit, reife elongierte Spermatiden zu finden und zu extrahieren von 45 % auf 63 % (Schlegel 2013).

Methoden zur Selektion befruchtungsfähiger Spermien für ART (assistierte Reproduktionstechniken)

Eine Voraussetzung für die erfolgreiche Durchführung einer IUI (intrauterine Insemination)/ITI (intratubare Insemination) oder IVF-Technik ist sowohl die Anreichung und Selektion von linear progressiv motilen Spermatozoen, als auch die Trennung von der Seminalplasmafraktion, in der sich die immotilen Zellen, Leukozyten, unreife Spermatogenesezellen befinden. Routinemäßig werden dazu folgende Verfahren angewendet:
  • Ejakulataufbereitung durch Zentrifugation in IVF-Medien,
  • Swim-up (Die beweglichen Spermatozoen schwimmen vom Seminalplasma in das oben beschichtete Kulturmedium),
  • Glaswollfiltration,
  • Dichtegradientenzentrifugation.
Diese Methoden erlauben zwar die Isolation motiler Spermatozoen, liefern jedoch nur begrenzt eine Aussage über die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen. Andere spezielle Verfahren der Spermienselektion basieren auf der Oberflächenladung (Microflow-Elektrophorese, Zeta-Potenzial) der Spermatozoen oder den Nachweis der Membranrezeptoren zur Unterscheidung von reifen von unreifen Spermien (Hyaluronsäure-Bindungsassay). Aufgrund der Erkenntnis, dass diejenigen Spermatozoen, die in Apoptose eintreten, ein verändertes Membranpotenzial, Caspase-3-Aktivität und Phosphatidylserin aufweisen, kann die Eliminierung von den „apoptotischen“ Spermien über magnetic activated cell sorting (MACS) mit Annexin-V-gekoppelter beads oder molekularer Glaswollfiltration erfolgen.
Problematisch ist, dass zu den genannten Methoden zwar grundsätzlich viel versprechende Studien vorliegen, aber nur unzureichende Daten im klinischen Einsatz und vor allem zur Verbesserung der Lebendgeburtraten und der Sicherheit vorliegen.
Wichtig
Es kann daher nach aktuellem Stand auch keine generelle Empfehlung zur Anwendung solcher Methoden gegeben werden.
Im Gegensatz zur IVF, bei der Motilität, Kapazitation, akrosomale Reaktion und Exposition von Spermium-Oozyte-Rezeptoren für die Fertilisierung eine bedeutende Rolle spielen, werden durch mikroskopisch assistierte Injektion eines Spermiums in die Eizelle bei ICSI diese Prozesse umgangen. Die Abklärung der vollständigen Chromatinkondensation im Nukleus, Anteil der Protamine und Histone, DNA-Defragmentationsrate, Rolle der genetischen und epigenetischen Faktoren, erscheinen als vielversprechende Prognosemarker. Die molekularbiologische Methoden basieren meistens auf DNA/RNA-Isolation und einer anschließenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Daher ist die In-vivo- Analyse der Spermatozoen, die für die ICSI verwendet werden soll, nicht möglich. Im Hinblick auf eine ICSI ist die gezielte Selektion eines morphologisch intakten Spermiums für die Mikroinjektion am ehesten erfolgsversprechend. Der Zusammenhang mit pathologischer Morphologie und einer abberanten Chromatinkondensation und DNA-Instabilität, welche sich negativ auf die Fertilisierungsrate auswirken kann, wird bereits vielfach diskutiert. Mit Einsatz der IMSI-Methode (intrazytoplasmische morphologisch selektierte Spermieninjektion) wird mit Hilfe eines Invertmikroskops in Echtzeit unter 6.000-facher Vergrößerung aufgrund der morphologischen Kopfeigenschaften insbesondere von Vakuolen und anderen Organellen (MSOME, microscopic sperm organelle morphology examination) eine Vorselektion der zu injizierenden Spermien durchgeführt. Allerdings ließen sich auch diese Untersuchungen in klinischen Studien nur unzureichend verifizieren und ein evidenzbasierter Nachweis einer Steigerung der Lebendgeburtraten steht noch aus.
Weiterhin ist die Entwicklung und Validierung neuer Technologien zur Abklärung der DNA-Schädigung in den lebendigen Zellen, wie z. B. Raman-Mikrospektroskopie (Mallidis et al. 2011) für die Selektion der befruchtungskompetenten Spermien vielversprechend.

Isolierung der befruchtungsfähigen Spermatiden aus TESE/mTESE Material

Der kritische Punkt der TESE/mTESE, der über Erfolg oder Misserfolg der Therapie entscheidet, ist die Gewinnung befruchtungsfähiger Spermien für die ICSI.
Die Spermatogenesequalität spiegelt die Chancen wider, Spermatiden im Hodengewebe zu finden. So beträgt die Spermatozoenausbeute 100 % bei Hypospermatogenese, 48 % bei Spermatogenesearrest und 19 % bei SCO (Tournaye et al. 1999). Eine besonders effektive Methode zur Detektion testikulärer Spermatozoen stellt der Nachweis von Protaminen mittels Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) dar (Steger et al. 2008). Die Methode ist
  • spezifisch, da Protamine ausschließlich in postmeiotischen Keimzellen exprimiert werden,
  • sensitiv, da bereits die Anwesenheit weniger Spermatozoen für einen positiven Nachweis ausreicht,
  • effizient, da mehrere Proben parallel getestet, Zeit- und Kostenaufwand somit relativ gering gehalten werden können, und
  • repräsentativer als die histologische Evaluation, da ein größeres Areal untersucht wird.
Ein positives Signal für Protamin weist auf die Anwesenheit von elongierten Spermatiden hin. Darüber hinaus kommt dem Verhältnis von Protamin-1 zu Protamin-2 eine entscheidende Rolle für die männliche Fertilität zu. In Spermatozoen von fertilen Männern wurde eine mRNA-Ratio von (0.98 ± 0.3) nachgewissen. Bei den subfertilen Patienten dagegen, war die Protamin-1/2 Ratio signifikant niedriger 0.81 ± 0.1). Die Patienten mit Referenzwert für Protamine erreichen höhere Fertilisierungsraten bei IVF-und ICSI-Zyklen im Vergleich zu den subfertilen Männern mit gestörtem Protamin-Verhältnis.
Merke
Protamin repräsentiert somit einen guten Prognosefaktor für den Erfolg von ART.
Bei Patienten mit Spermatogenesearrest auf der Stufe von runden Spermatiden besteht die Möglichkeit, eine runde Spermatide auf die Eizelle im Rahmen eines ROSI-Verfahrens (round spermatid nucleus injection) zu übertragen. Obwohl Studien Fertilisierungsraten von ca. 45 % berichten, bleibt die Injektion von Spermien-Vorläuferzellen aus verschieden Gründen nicht unbedenklich. Zum einen ist die Unterscheidung zwischen diploiden Spermatogenesezellen und haploiden runden Spermatiden im Lichtmikroskop deutlich begrenzt. Zum anderen löst eine Befruchtung mit runden Spermatiden keine Oozytenaktivierung aus, sodass zusätzliche eine Inkubation mit Kalzium-Ionophoren nötig ist, um die Fertilisierung zu induzieren. Bei den runden Spermatiden besteht zudem das Risiko der unvollständigen Etablierung des genomischen Imprinting und als Folge eine Störung der embryonalen Entwicklung. Zech et al. (2000) warnen ausdrücklich vor den steigenden Risiken der kongenitaler Deformationen in der Schwangerschaft nach ROSI-Befruchtung.

Spermatogoniale Stammzellen – Zukunftsperspektiven

Patienten mit genetisch bedingter Sterilität, Männer mit Sertoli-cell-only-Syndrom, bei denen auch eine TESE-/mTESE Therapie nicht zum Erfolg führte, oder Tumorpatienten, die einer gonadotoxischen Therapie unterzogen wurden, würden hinsichtlich der Entwicklung von spermatogonialen Stammzellen eine Chance bekommen, mit Hilfe von ART-Methoden ein genetisch eigenes Kind zu zeugen.
Obwohl die In-vivo-Generierung von Spermatozoen noch nicht die ethischen und klinischen Kriterien für die Applikationen beim Menschen erfüllt hat, repräsentieren die Experimente in Tier-Modellen und Zellkulturen einen großen Fortschritt auf diesem Gebiet.
In der Literatur werden 3 Verfahren zur Produktion von Spermatozoen aus Stammzellen beschrieben:
  • Transplantation spermatogonialer Stammzelle n: Spermatogoniale Stammzellen (spermatogonial stem cells, SSCs) sind pluripotente Zellen in den Tubuli seminiferi im Testis, die an der Lamina propria lokalisiert sind und die Fähigkeit zur Erneuerung und Differenzierung in Spermatogenesestadien besitzen. SSCs gehen während der Embryonalentwicklung aus primordialen Keimzellen (primordial germ cells, PGCs) hervor. Die Option für die klinische Anwendung ist, SSCs aus der Biopsie der präpubertären Hoden zu gewinnen, diese zu kryokonservieren oder nach Bedarf bis zur Transplantation in die Testes des Patienten in Zellkulturen zu züchten.
  • Züchten von Keimzellen in Xenograften: Zur Produktion von Keimzellen werden in diesem Fall SSCs von Patienten unter die Haut von genetisch veränderten Mäusen, die keine Immunität besitzen, injiziert. Die Transplantation von humanem Hodengewebe von 3 Monate alten Jungen unter die Haut von Nacktmäusen resultierte in der Differenzierung von Spermatogonien bis pachytänen Spermatozyten.
  • In-vitro-Kultivierung von Samenzellen: Den Forschern ist es bereits im Maus-Modell gelungen, eine reprogrammierte Spermatogenesezelllinie aus embryonalen Stammzellen oder spermatogonialen Stammzellen in vivo zu generieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass diese In-vitro-Kultur alle prämeiotischen Marker exprimierten und nach Induktion mit Retinsäure die Meiose durchlaufen. Die haploide spermatozoenförmigen Zellen konnten in vivo produziert werden und nach Injektion der Eizelle mit dem gewonnen Spermium (ICSI) die Befruchtung bis zum 2-Zell-Stadium beobachtet werden. Die rasante Expansion der Forschung an spermatogonialen Stammzellen resultiert in einer Vielzahl neuer Erkenntnisse über die Regulation der Spermatogenese, jedoch bevor die Therapie von Infertilität auf der Basis von Stammzellen routinemäßig eingeführt wird, müssen noch viele grundlegenden Fragen zur Keimzelldifferenzierung, der Genetik, der Epigenetik und der Entwicklungsbiologie geklärt werden.

Zusammenfassung

  • In der assistierten Reproduktion spielt die andrologische Diagnostik eine zentrale Rolle zur Einschätzung der Fertilität und Planung der erfolgversprechendsten Therapie.
  • Bei ausgeprägten Einschränkungen der Ejakulatqualität, insbesondere Spermienmotilität und -morphologie, ist ICSI gegenüber IVF die bessere Therapieoption für die Behandlung der andrologischen Infertilität.
  • Die operativen Techniken zur Spermiengewinnung werden häufig bei Azoospermie-Patienten in Kombination mit ART-Verfahren verwendet.
  • Trotz enormer Fortschritte in der Diagnostik der Spermatogenesestörungen, existieren bisher keine non-invasiven Prognosefaktoren für die Vorhersage des TESE-/mTESE-Erfolgs.
  • Die Entwicklung einer Methodik zur Einschätzung der molekularen und epigenetischen Aspekte des Fertilisierungspotenzials von lebendigen Spermatozoen würde zweifelslos zur der Verbesserung der Schwangerschaftsraten nach ART beitragen.
  • Zukünftige Entwicklungen könnten mit der Möglichkeit der Spermatogenese aus Stammzellen auch bei aufgehobener Fertilität neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen.
Literatur
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