Die Urologie
Autoren
I. Beyaert und G. Beyaert

Urologische Mikrobiologie

Die Urinmikrobiologie ist ein elementarer Bestandteil der Diagnostik und Therapie urologischer Infektionskrankheiten. Eine Vielzahl pathogener und fakultativ pathogener Erreger ist in der Lage den Urogenitaltrakt zu besiedeln und Krankheiten zu verursachen. Eine sorgfältige Diagnostik seitens des Urologen ist notwendig, um das Vorhandensein einer Infektion zu erkennen und im Falle einer klinischen Relevanz den Erreger zu identifizieren und seine Resistenzlage zu ermitteln. Gerade in Zeiten einer zunehmenden Resistenzbildung ist ein aussagekräftiges Antibiogramm die unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer rationalen Antibiotikatherapie.

Bedeutung der Urinmikrobiologie

Harnwegsinfektion en (HWI) gehören zu den häufigsten nosokomialen und ambulant erworbenen bakteriellen Infektionen (Hörl 2011) und zählen zu den häufigsten Ursachen für einen Arztbesuch. Sie sind nach den Atemwegsinfektionen der zweithäufigste Grund für ambulante Antibiotikaverordnungen. Ihre individuelle und sozio-ökonomische Bedeutung nimmt stetig zu, da nicht zuletzt aufgrund des demografischen Wandels immer mehr ältere Menschen als Risikopatienten für HWI in Betracht kommen (Stamm und Norrby 2001, Foxman und Buxton 2003).
Die meisten Erreger von HWI (uropathogene Erreger ) sind relativ leicht aus Körperproben zu isolieren. Üblicherweise wird hierfür Urin genutzt, aber auch andere Materialien werden untersucht, wie Abstriche, Exprimate und Punktate. Bei der ambulanten Patientenversorgung ermöglicht das Labor in der urologischen Praxis eine patientennahe und differenzierte mikrobiologische Diagnostik. Diese ist wesentliche Voraussetzung für eine rasche, testgerechte und mithin effiziente antimikrobielle Therapie. Das mikrobiologische Labor ist deshalb eine sehr hilfreiche und sinnvolle Einrichtung in der urologischen Praxis und begründet einen gewichtigen Versorgungsvorteil für ambulante Patienten gegenüber anderen Haus- und Fachärzten, die nicht über diese Möglichkeiten verfügen.

Praxislabor

Das Vorgehen bei der Labordiagnostik teilt die Urologen in 2 Gruppen, nämlich in solche mit einem eigenen Labor und in diejenigen, die ihre Erreger in ein Fachlabor einschicken und von diesem die Identifizierung und die Resistenzbeurteilung erhalten. Beides hat Vor- und Nachteile. Fachlabore sind hochspezialisiert und weisen daher eine geringere Fehlerquote bei der Erregeridentifizierung und Antibiogrammerstellung auf. Dafür ist im Praxislabor eine patientennahe Diagnostik möglich, sodass der Urologe schneller und flexibler bei der Beurteilung und in der Umsetzung der therapeutischen Konsequenzen agieren kann. Auch gemischte Konzepte haben sich bewährt. So sollte die Hilfe eines Fachlabors in Anspruch genommen werden, wenn die Mittel und Möglichkeiten des Praxislabors ausgeschöpft sind. Unabhängig vom Labor gehört die korrekte Interpretation des Untersuchungsergebnisses zur fachlichen Kompetenz des Urologen. Dies setzt ein solides mikrobiologisches Grundwissen voraus.
Die Einrichtung eines Praxislabors erfordert den Einsatz von Kapital und Arbeit. Der Aufwand ist jedoch gering verglichen mit den sich dadurch bietenden Möglichkeiten. Die folgende Übersicht beschreibt die wichtigsten Voraussetzungen für die Einrichtung sowie die Ausstattung eines mikrobiologischen Labors in der urologischen Praxis.
Einrichtung eines Praxislabors
Voraussetzungen
  • Ausreichend großer Raum
  • Gut desinfizierbare Arbeitsflächen
  • Verschließbare Tür (Zugangsbegrenzungen notwendig)
  • Kennzeichnung für Biogefährdung („biohazard“)
  • Gefahrlose Entsorgung des kontaminierten Materials (am besten durch eine professionelle Firma)
  • Handfreie Bedienung der Armaturen der Waschbecken und Spender (Flüssigseife, Desinfektionsmittel)
  • Entsprechend geschultes Personal
  • Qualitätsmanagementsystem inklusive Arbeitsanweisungen
Ausstattung
  • Mikroskop, unbedingt mit 100er-Öl-Immersionsobjektiv
  • Brutschrank, einstellbar auf 36° ± 1 °C Autoklaviergerät, falls Hilfsmittel sterilisiert werden
  • Pipetten, ggf. Kolbenhubpipetten mit den dazugehörigen Spitzen
  • Wattetupfer
  • Ösen
  • Platten/Nährböden
  • Sog. bunte Reihen für die gramnegativen Bakterien (G-) und entsprechende Reagenzien
  • Sog. bunte Reihen für die grampositiven Bakterien (G+) und entsprechende Reagenzien
  • System für das Antibiogramm
  • Desinfektionsmittelspender
Rechtlich-formale Verordnungen und Richtlinien für das Betreiben eines mikrobiologischen Labors sind zu beachten. Hierzu zählen:
Hilfestellung bei formalen Vorgaben kann immer auch das Robert-Koch-Institut (RKI) geben. Auf der Homepage (http://www.rki.de) sind RKI-Richtlinien zu verschiedenen Themen zu finden, die eine gute Verfahrensanleitung für die Einrichtung und den Betrieb eines mikrobiologischen Labors darstellen und üblicherweise auch von Behörden anerkannt werden. Die Abstimmung mit der lokalen Behörde (Gesundheitsamt) vorab erleichtert in der Regel die Erteilung der Betriebsgenehmigung.

Uropathogene Erreger

Bakterielle Infektionen im Urogenitalbereich sind meistens endogenen Ursprungs, können aber selten auch exogen bedingt sein. Endogene Infektionen werden meistens von Darmbakterien aus dem Gastrointestinaltrakt verursacht, während exogene Erreger aus der Umgebung des Patienten stammen. Dies können einerseits Bakterien der belebten und unbelebten Umwelt sein, andererseits vor allem unter schlechten hygienischen Verhältnissen aber auch die Darmbakterien anderer Menschen. In seltenen Fällen können Infektionen des Urogenitaltrakts auch hämatogen aus einem anderen körpereigenen Infektfokus entstehen (Tab. 1).
Tab. 1
Übersicht der häufigsten Erreger von HWI (uropathogene Erreger)
Spezies
Gramfärbung
Gruppeneinteilung
Acinetobacter baumanii
G-
Acinetobacter, Non-Enterics
Candida albicans
Hefe
Hefen
Corynebacterium urealyticum
G+
G+ Stäbchen
Enterobacter cloacae
G-
Koliforme, Enterics
Enterococcus faecalis
G+
Enterococcus faecium
G+
Enterokokken, Streptokokken
G-
Koliforme, Enterics
Klebsiella pneumoniae
G-
Koliforme, Enterics
Morganella morganii
G-
Proteus-Gruppe, Enterics
Neusseria gonorrhoeae
G-
Neisserien
Proteus mirabilis
G-
Proteus-Gruppe, Enterics
G-
Pseudomonaden
Serratia marcescens
G-
Serratia, Enterics
Staphylococcus aureus
G+
Staphylococcus epidermidis
G+
Staphylokokken
Staphylococcus saprophyticus
G+
Staphylokokken
G-
Stenotrophomonaden, Non-Enterics
Streptococcus agalactiae
G+
(echte) Streptokokken
HWI Harnwegsinfektionen, G+ grampositiv, G- gramnegativ
Die meisten Erreger von HWI sind fakultativ pathogen (sog. Opportunisten), also keine obligaten Krankheitserreger oder Parasiten an sich, sondern Erreger der Normalflora oder der Umwelt, die unter bestimmten Umständen eine Erkrankung verursachen können. Ausschlaggebend für den Ausbruch und den Verlauf einer durch Bakterien verursachten Infektionskrankheit sind neben Art und Eigenschaften des Erregers immer auch der Allgemeinzustand und die Immunkompetenz des Patienten. Neben den Opportunisten gibt es auch eine Reihe von sexuell übertragbaren Erregern (STI, sexually transmitted infection), die an einen menschlichen Wirt gebunden sind und daher als obligat pathogen gelten. Zu Ihnen gehören Erreger wie beispielsweise Gonokokken, Chlamydien oder Ureaplasmen (WHO 2001).
Ausschlaggebend für die Bedeutung bzw. Virulenz eines Erregers sind seine Pathogenitätsfaktor en. Diese ermöglichen ihm, in den Körper oder sogar bis in die Wirtszellen zu gelangen, dort zu überleben, sich zu vermehren und sich gegen das Immunsystem des Wirtsorganismus zu behaupten. Manche dieser Pathogenitätsfaktoren von Bakterien können schon beim Wachstum auf Agarplatten direkt erkannt werden. Dazu gehören die Fähigkeit zur Spaltung von Harnstoff, erkennbar am Ammoniakgeruch (Proteus), oder die Bildung von Schleimkapseln (Klebsiella), welche den Erreger vor feindlicher Umwelt und damit auch vor dem menschlichen Immunsystem schützen.

Bakterien

Prinzipiell werden Bakterien in 2 große Gruppen unterteilt: Die Grampositiven (G+) und die Gramnegativen (G-, Hucker 1923). Streng genommen sind die G+ verglichen mit den G- eine sehr kleine und spezielle Gruppe, doch haben sie eine so große Bedeutung in der Infektionsmedizin, dass sie den G- fast gleichwertig gegenüberstehen. Die Gruppen werden durch die Methode der Gramfärbung unterschieden, eine traditionelle Färbemethode, die erstmals 1884 von dem dänischen Internisten Hans Christian Gram beschrieben wurde. Ausschlaggebend für das Färbeverhalten ist dabei die Beschaffenheit der Zellwand Abb. 1. Der blaue Farbstoff bleibt bei den G+ in der dicken Zellwand haften und färbt die Zellen blau. Die G- mit der dünneren Mureinschicht müssen mit rot gegengefärbt werden, da der blaue Farbstoff nicht greift. Außerdem ist es möglich die Gruppen auf Selektivmedien zu unterscheiden (Abschn. 5.2) oder durch einen Test mit Kalilauge (G- Bakterien ziehen in Kalilauge gerührt Fäden, Tab. 2).
Tab. 2
Gegenüberstellung von grampositiven (G+) und gramnegativen (G-) Erregern
Merkmal
Grampositive (G+)
Gramnegative (G-)
Erscheinung in der Gramfärbung
Blau
Rot
Beweglichkeit
Meist unbeweglich (Ausnahmen z. B. Bacillus spezies)
Meist beweglich (Ausnahmen z. B. Klebsiella, Acinetobacter)
Koloniemorphologie
Kleine, tropfenartige, oft unscheinbare Kolonien
Häufig große, ausgefranste sog. Kriechkolonien
Zellwand
Dicke, mehrlagige Wand aus Murein
Dünne, einschichtige Wand aus Murein, Lipopolysaccharidschicht
Reaktion auf Kalilauge
Ziehen Fäden
Keine Reaktion
Wachstum auf Platten
CLED, Blut-CNA
CLED, MacConkey
CLED Cystin-Lactose-Elektrolyte-Deficient-Agar; CNA Colistin, Nalidixinsäure

Gramnegative Bakterien (G-)

Die G- lassen sich in 2 Hauptgruppen untergliedern, die Enterobakteriazeen (Enterics) und die Nicht-Enterobakteriazeen (Non-Enterics , Tab. 1).
Die Enterics bilden die große taxonomische Gruppe der Darmbakterien (Alle Enterics sind Darmbakterien, aber nicht alle Darmbakterien sind Enterics. Janda und Abbott 2006). Sie besitzen folgende Eigenschaften:
  • Es handelt sich durchweg um gramnegative Stäbchen.
  • Alle wachsen fakultativ aerob, d. h. sie brauchen keinen Sauerstoff, vertragen ihn aber.
  • Sie können Glukose und eventuell auch andere Zucker vergären und bilden dabei Säure.
  • Sie können Nitrat zu Nitrit abbauen.
  • Sie sind Oxidase-negativ, da sie keine Cytochrom-Oxidase besitzen.
Die Non-Enterics bilden keine einheitliche Verwandtschaftsgruppe, sondern umfassen alle gramnegativen Erreger, die nicht zu den Enterics gehören. Sie sind durch folgende Eigenschaften charakterisiert:
  • Es handelt sich um gramnegative Stäbchen oder aber um kokkoide, kurze Stäbchen.
  • Sie sind obligat aerob, wachsen also nur in Anwesenheit von Sauerstoff.
  • Sie fermentieren bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Aeromonas) keine Glukose oder anderen Zucker.
  • Sie verfügen bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Acinetobacter) über eine Cytochrom-Oxidase, sind also Oxidase-positiv.
Der bedeutsamste Erreger von HWI ist Escherichia coli (E. coli), der über 70 % aller HWI verursacht. Der zweithäufigste Erreger ist Proteus mirabilis und an 3. Stelle steht Staphylococcus saprophyticus.

Chlamydien

Chlamydien wurden vormals aufgrund ihrer intrazellulären Lebensweise für „große Viren“ gehalten. Es handelt sich allerdings um kleine gramnegative Bakterien mit einem reduzierten Genom (Jeffrey und Peipert 2003). Chlamydien sind nicht auf klassischen Nährböden, sondern nur in Zellkulturen anzüchtbar, da sie außerhalb der Wirtszellen nicht überleben. Sie gehören zu den STI-Erregern. Heute weiß man, dass Chlamydien-Infektionen oft symptomlos verlaufen. Man schätzt, dass 5 % aller Männer Chlamydien-Träger sind, ohne es zu wissen. Es gibt für die urologische Praxis kommerzielle Schnelltests zum Nachweis von Chlamydien, die allerdings nicht besonders zuverlässig sind.

Koliforme Bakterien

Die Gruppe der koliformen Bakterien wird nach den wichtigsten Gattungen in dieser Gruppe auch salopp aufgrund der Anfangsbuchstaben „Koli-Ecke“ genannt.
Koli-Ecke
  • E = Escherichia
  • C = Citrobacter
  • E = Enterobacter
E. coli ist innerhalb dieser Gruppe der wichtigste und häufigste uropathogene Erreger (Hacker 2002). Die Koliformen sind allesamt klassische Darmbakterien und damit opportunistische Erreger. Zusammen verursachen sie den Großteil aller HWI (>70 %). Sie ähneln sich in ihren Eigenschaften und sind innerhalb der Gruppe in den meisten Fällen nur schwer anhand der Koloniemorphologie zu unterscheiden. Ausnahme sind hier die Klebsiellen, die einerseits durch ihre Unbeweglichkeit auffallen und andererseits durch ihre Kapselbildung auf der Platte schleimig erscheinen. Für eine weitere Differenzierung kann eine bunte Reihe erstellt und so anhand unterschiedlicher biochemischer Eigenschaften der Erreger näher bestimmt werden.

Proteus-Gruppe

Bakterien dieser Gruppe sind G-, hochbewegliche Stäbchen. Sie spalten Harnstoff, wobei Ammoniak entsteht. Das macht auch den charakteristischen unangenehmen Geruch aus und stellt gleichzeitig einen Pathogenitätsfaktor dar (Konieczna et al. 2012). Ammoniak, ein Zellgift, kann den Urin alkalisieren und zu Steinbildung führen. Der wichtigste Vertreter ist Proteus mirabilis (P. mirabilis), der häufig bei chronischen sekundären bzw. nosokomialen HWI anzutreffen ist. P. mirabilis ist oft sehr resistent und dadurch schwer therapierbar. Andere Vertreter der Gattung Proteus sind P. vulgaris und P. penneri, dem eine zunehmende Bedeutung zugeschrieben wird (Hacker 2002). Zur Proteus-Gruppe zählen außerdem noch die Gattungen Providencia und Morganella.

Pseudomonaden

Der wichtigste Vertreter dieser Gruppe ist Pseudomonas aeruginosa. Bei Pseudomonas-Infektionen handelt es sich immer um exogene Infektionen. Pseudomonas ist häufig sehr resistent (Takeyama et al. 2002) und gleichzeitig ein sehr genügsamer „Asket“, der sogar in destilliertem Wasser leben kann. Daher ist er als nosokomialer Erreger gefürchtet. P. aeruginosa hat viele charakteristische Merkmale (typischer Geruch, Glanz, Grünfärbung) und kann daher gut ohne bunte Reihe erkannt werden. Zu den Pseudomonas-Verwandten zählt noch die Gattung Burkholderia, die früher Teil der Gattung Pseudomonas war.

Neisserien

Neisserien sind G-, aerob wachsende, Oxidase-positive Diplokokken. Wichtigster Vertreter ist Neisseria gonorrhoeae, der Erreger der Gonorrhö (Gonokokken). Dieser ist nur auf speziellen Nährmedien (sog. Kochblut-Agar) und unter CO2-Anreicherung anzüchtbar. Außer N. gonorrhoeae können noch weitere saprophytäre Neisserien vorkommen, die zum Teil auch auf CLED-Agar (Cystin-Lactose-Elektrolyte-Deficient-Agar) wachsen.

Spirochäten

Treponema pallidum, der Erreger der Syphilis, gehört zu den Spirochäten. Bisher konnte man den Erreger nicht auf Nährmedien anzüchten. Der Nachweis erfolgt immunologisch.

Acinetobacter

Acinetobacter ist im Krankenhaus nicht unbekannt und kann auch in der urologischen Praxis vorkommen (Berry et al. 2013). Besonders erwähnenswert ist A. baumanii, der sich auch als Multiresistenter einen Namen gemacht hat. Acinetobacter bildet kurze, kokkoide unbewegliche Stäbchen (von altgriech. Akinese: hochgradige Bewegungsarmut bis Bewegungslosigkeit).

Grampositve Bakterien (G+)

Die meisten für die Urologie relevanten grampositiven Erreger gehören zu den grampositiven Kokken. Diese lassen sich grob unterteilen in die Staphylokokken und die Streptokokken mit jeweils zugehörigen Gattungen.

Staphylokokken

Für die urologische Mikrobiologie sind 3 wichtige Staphylokokken-Spezies/-Gruppen von Bedeutung, nämlich S. aureus, S. saprophyticus und S. epidermidis. Darüber hinaus gibt es noch die Mikrokokken, die allerdings apathogen sind (Baird-Parker 1965).
  • S. aureus ist sicher der bekannteste Vertreter der Staphylokokken, nicht zuletzt auch durch den MRSA (Methicillin-resistenter S. aureus, Gosbell 2012). S. aureus ist häufig bei Prostatitis, bei typischen HWI dagegen eher selten anzutreffen.
  • S. saprophyticus verursacht Zystitiden und HWI, insbesondere bei jungen Frauen. Er vermehrt sich nicht gut im Urin, hat aber eine hohe Affinität zum Urothel.
  • S. epidermidis gehört zur normalen Standortflora der vorderen Harnröhre. Als Erreger von HWI ist er eher selten, kann aber auch hochresistente Stämme hervorbringen (MRSE, Methicillin-resistenter S. epidermidis).
Historisch wurde nach laborchemischen Kriterien nur S. aureus über eine Koagulase-Reaktion von allen anderen Staphylokokken unterschieden. Die anderen wurden als Koagulase-negative Staphylokokken zusammengefasst. Diese einfache Unterscheidung reicht heute nicht mehr aus, da z. B. S. saprophyticus aufgrund seiner besonderen Resistenzeigenschaften im Antibiogramm teils gesondert behandelt werden muss. In kommerziellen Identifizierungssystemen für Staphylokokken werden weitere Eigenschaften der Staphylokokken genutzt, wie z. B. Novobiocin-Resistenz von S. saprophyticus oder die Mannit-Spaltung von S. aureus.

Mikrokokken

Die Mikrokokken gehören ebenfalls zu den Staphylokokken, bilden aber eine eigene Gattung (Kocur et al. 2006). Sie gehören zu den wenigen Bakterien, die zwar im Urin vorkommen können, aber niemals eine Erkrankung verursachen. Mikrokokken kommen auch als Kontaminanten aus der Luft, z. B. auf schlecht gelagerten Agarplatten vor. Sie bilden oft auffällig farbige Kolonien (z. B. gelb, rosa).

Streptokokken

Streptokokken sind neben den Staphylokokken die wichtigste Gruppe der grampositiven Erreger. Ein typisches Merkmal der Streptokokken ist die Hämolyse, die gut an einer Aufhellung auf dem Blut- oder Blut-CNA-Agar (CNA, Colistin und Nalidixinsäure, Abschn. 5.2) zu erkennen ist. Die Streptokokken werden nach diesem Merkmal weiter in α-, β- und γ–hämolysierende Streptokokken klassifiziert:
  • α : vergrünende (unvollständige) Hämolyse
  • β : vollständige Hämolyse
  • γ : keine Hämolyse
Des Weiteren werden Streptokokken nach ihren Oberflächenantigenen in sog. Lancefield-Gruppen unterteilt. Wichtig für die urologische Mikrobiologie sind die Gruppe-B-Streptokokken (S. agalactiae) und die Enterokokken, die zu den D-Streptokokken gehören (s. o.). Gruppe-A Streptokokken kommen selten als Erreger von HWI vor.

Enterokokken

Die Enterokokken gehören zu den wenigen Grampositiven, die im Darm leben, was durch das Präfix Entero- zum Ausdruck gebracht wird. Sie gehören zur Gruppe der D-Streptokokken (Abschn. 5.2). Die wichtigsten Spezies in der Urinmikrobiologie sind E. faecium und vor allem E. faecalis. Weitere Arten sind E. gallinarum, E. durans u. a. Die Enterokokken und insbesondere E. faecium können sich als sehr resistent erweisen. Ein Unterscheidungsmerkmal zu den anderen („echten“) Streptokokken ist die Spaltung von Äskulin.

Grampositive Stäbchen (G+)

Grampositive Stäbchen spielen bei HWI selten eine Rolle bis auf Corynebacterium urealyticum, ein harnspaltendes, häufig sehr resistentes Bakterium, das als Folge einer antimikrobiellen Fehlbehandlung Dauerformen bilden kann (Krishna et al. 2011). Neben C. urealyticum gibt es noch andere, apathogene Corynebakterien.
Weitere grampositive Stäbchen sind Laktobazillen (Döderleinsche Stäbchen). Hier kann die Spezies L. rhamnosus gelegentlich pathogen sein. Meist sind Lactobazillen jedoch harmlos und haben vielmehr protektive Eigenschaften bei rezidivierenden HWI der Frau, die mittels oraler und vaginaler Applikationsformen therapeutisch genutzt werden.

Mykoplasmen und Ureaplasmen

Mykoplasmen und Ureaplasmen sind grampositive Stäbchenbakterien ohne Zellwand. Sie benötigen besondere Bedingungen und sind auf den Standard-Nährmedien nicht anzüchtbar. Es eignen sich hier kommerzielle Systeme, welche die Erreger über Farbreaktionen nachweisen können.

Nichtbakterielle Erreger

Neben den Bakterien gibt es auch eine Reihe von nichtbakteriellen Erregern, die Infektionen des Urogenitaltrakts verursachen können. Auf die meisten wird hier nur kurz eingegangen, da sie in einem klassischen Urinlabor nicht isoliert und identifiziert werden können. Die Erkennung erfolgt anhand des Krankheitsbildes und im Urinsediment. Eine Ausnahme bilden die Hefen, die ähnlich den Bakterien sehr gut auf Agarplatten angezüchtet werden können.

Hefen

Uropathogene Hefen sind in erster Linie Candida-Spezies, hier insbesondere Candida albicans. Candida-Infektionen treten vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten oder im Gefolge einer Antibiotikatherapie auf. Sie erscheinen auf Agarplatten als porzellanweiße, trockene oder cremige Kolonien, oft sehr klein, auf dem Sabouraud-Agar aber zum Teil auch groß, auffällig und schmierig. Im Grampräparat imponieren sie als große violette Zellen. Dabei ist das Zellinnere violett, die Zellwand selbst färbt rot.

Trichomonaden

Trichomonaden zählen nicht zu den Bakterien, sondern zu den Flagellaten (Geißeltierchen, die zu den Einzellern zählen). Im Allgemeinen werden sie mikroskopisch nachgewiesen. Es existieren zwar auch spezielle Nährmedien, die Erfolgsquote der kulturellen Trichomonaden-Diagnostik ist jedoch zu gering für eine Routineanwendung.

Sonstige

Neben den Trichomonaden können grundsätzlich noch weitere uropathogene Protozoen und Viren im Urogenitalsystem vorkommen. Da diese aber im urologischen Praxislabor nicht anzücht- und isolierbar sind, wird an dieser Stelle nicht weiter darauf eingegangen.

Labordiagnostik von Harnwegsinfektionen

Grundlagen der Labordiagnostik

Am Anfang der mikrobiologischen Diagnostik steht die Probeentnahme (Gleckman et al. 1979, Abb. 2). Diese erfolgt in der urologischen Praxis unter Beachtung der bewährten Standards (vorzugsweise Morgenurin; Zeitintervall möglichst ≥4 h zwischen letzter Miktion und Probengewinnung; Reinigung des Meatus mit klarem Wasser; Mittelstrahlurin mit retrahiertem Präputium, bei Frauen bei gespreizten Labien oder Katheterurin). Aus mikrobiologischer Sicht sind folgende Aspekte besonders zu beachten (Lifshitz und Kramer 2000):
  • Die Kontaminationen durch die Normalflora der Schleimhaut ist zu minimieren, was aber nur selten vollständig verhindert werden kann.
  • Urin ist ein gutes Wachstumsmedium für die üblichen uropathogenen Erreger. Daher muss die Urinprobe zügig weiterverarbeitet werden, um eine Verfälschung der Keimzahl zu vermeiden. Kommt es zur Verzögerungen (>4 h), so muss der Nativharn kühlgestellt werden (4 °C für max. 48 h), um das Erregerwachstum zu verlangsamen.
  • Die korrekte Gewinnung, Lagerung und Transport der Urinprobe sind essentielle Voraussetzungen für eine zuverlässige mikrobiologische Harndiagnostik.
Im Vorfeld muss festgestellt werden, ob eine mikrobiologische Untersuchung angebracht ist. Dies erfolgt einerseits anhand klinisch-anamnestischer Kriterien, andererseits anhand des Urinsediment s.
Beim qualitativen Urinsediment werden ca. 10 ml gründlich durchmischten Urins aus einem sauberen Auffanggefäß für 3–5 min bei 1.500–2.000 U/min in einer Tischzentrifuge geschleudert. Nach Dekantieren des Überstandes wird die konzentrierte Probe mit einer Pipette auf einen Objektträger aufgebracht und einem Deckgläschen bedeckt. Die Lichtmikroskopie mit schwacher Vergrößerung (50- bis100-fach) verschafft zunächst einen Überblick. Bei stärkerer Vergrößerung (300- bis 400-fach) werden die geformten Elemente identifiziert. Wesentlich ist die Anzahl an Leukozyten und Erythrozyten und deren Morphologie, aber es können ggf. noch eine Vielzahl anderer Strukturen gesehen werden, wie z. B. Zylinder, Kristalle oder Trichomonaden. Bei hoher Keimzahl sind auch Bakterien und Hefen im Sediment zu erkennen.
Zum Nitritnachweis werden auch nasschemische Schnelltests verwendet (Fünfstück et al. 2012). Diese weisen die Umwandlung von Nitrat in Nitrit nach, was auf das Vorhandensein von Enterobakteriazeen hinweisen kann. Ein fehlender Nitritnachweis schließt eine bakterielle Infektion jedoch nicht aus, da viele Erreger Nitrat nicht zu Nitrit abbauen und die Testsysteme zudem eine nicht unerhebliche falsch-negative Fehlerquote aufweisen. Eine Positivreaktion kann daher allenfalls als Hinweis auf eine HWI gewertet werden. Eine Negativreaktion kann eine Infektion hingegen nicht ausschließen.
Kriterien für das Anlegen einer Urinkultur
  • Positiver Nitritnachweis
  • Hohe Leukozytenzahl (>4.000–6.000/ml)
  • Proteinurie
  • Zystitische Miktionsbeschwerden (Dysurie, Algurie, Pollakisurie)
  • Erhöhtes Risiko einer HWI (Schwangerschaft, Diabetes mellitus, Immunsuppression)
  • Bekannte Nierenerkrankung, Urolithiasis, Harntraktanomalien
  • Urogenitale Operationen
  • Therapiekontrolle

Urinkultur

Bei der Erstanlage einer Urinkultur wird die Urinprobe auf einem entsprechenden Satz Agarplatten (Nährboden, Medium; Einweg-Petrischale gefüllt mit einem festen Nährmedium) ausgestrichen (Wilson und Gaido 2004). Ziel ist dabei die Vereinzelung des Erregers und eine Einteilung in Gruppen (G+, G- und Hefen), um bereits mit diesem 1. Schritt eine vorläufige Identifizierung zu ermöglichen. Hierzu empfiehlt sich die Verwendung eines Universalmediums als Positivkontrolle, zur Keimzahlbestimmung und zum Vereinzeln des Erregers und der Einsatz von Selektivmedien zur Erkennung der Großgruppen. Folgende Nährmedien sind hierzu geeignet:
1.
CLED-Agar (Cystin-Lactose-Elektrolyte-Deficient) ist das am weitesten verbreitete Universalmedium. Gegenüber anderen Universalmedien wie Blut oder Mueller-Hinton hat dieser Agar 2 vorteilhafte Eigenschaften: Seine niedrige Elektrolytkonzentration schränkt die Bakterienbewegung ein und hindert dadurch Proteus am Schwärmen. Der Indikator Bromthymolblau zeigt durch einen Farbumschlag nach gelb die Laktoseverwertung von Bakterien an (Neblett 1976).
 
2.
MacConkey-Agar (Gallensalz-Laktose-Indikator nach MacConkey) dient als Selektivmedium für die meisten G- Bakterien. Begleitkeime werden durch hohe Gallensalzkonzentrationen und ggf. Kristallviolett gehemmt. Der Indikator zeigt eine Laktoseverwertung durch einen Farbumschlag nach rot an. Bei stark ausgeprägter Laktoseverwertung erfolgt eine Trübung durch die ausgefällten Gallensalze, was vor allem bei E. coli häufig der Fall ist.
 
3.
Blut-CNA-Agar: Ein Blut-Agar wird durch die Zugabe von Colistin und Nalidixinsäure (CNA) selektiv für den Nachweis von G+. Durch den Blutzusatz wachsen die G+ besser und deutlicher als auf CLED-Agar. Cave: Proteus-Arten sind resistent gegen Colistin. Manche sind auch resistent gegen Nalidixinsäure und können dann auch auf Blut-CNA-Agar wachsen.
 
4.
Sabouraud-G/C-Agar (mit Gentamicin und Chloramphenicol), benannt nach seinem Erfinder dem französischen Dermatologen Sabouraud, wird durch die Zugabe von Breitbandantibiotika (Chloramphenicol, Gentamicin) selektiv für Hefen und Pilze. Das Wachstum von Bakterien wird gehemmt. Auch hier kann es in sehr seltenen Fällen vorkommen, dass sehr resistente Bakterien auf dem Medium wachsen.
 
Zur Beimpfung der Nährmedien wird das Untersuchungsmaterial mit der sterilen Öse aufgenommen und auf die Oberfläche der Agarplatten gebracht. Dann wird das Material ausgestrichen.
Empfohlene Methode zur Urinkultur-Erstanlage/Ausstreichen auf Agarplatten
  • CLED (1 Platte/Probe): Zunächst werden 100 μl Patientenurin auf eine Hälfte der CLED-Platte pipettiert und mit der Einweg-Öse flächendeckend auf dieser Hälfte verstrichen. Danach wird die Öse in den Agar gestochen. Mit der gleichen Öse wird der Urin per Zickzack-Ausstrich auf der anderen Hälfte der CLED-Platte fraktioniert.
  • MacConkey (1/2 Platte/Probe): Die Öse, die schon bei der CLED-Platte verwendet wurde, wird auch für die anderen Platten benutzt. Für die MacConkey-Platte wird sie noch einmal in den Urin getaucht und ein Zickzack-Ausstrich auf der mit der Nummer des Patientenurins beschrifteten Hälfte der Platte angefertigt.
  • Blut-CNA (1/4 Platte/Probe): Die Öse wird in den Urin getaucht und das entsprechende Feld auf der Platte im Zickzack ausgestrichen.
  • Sabouraud-G/C (1/4 Platte / Probe): Auch hier wird die Öse nochmals in den Urin getaucht und im Zickzack über das entsprechende Feld der Platte gestrichen.
Einige Praxislabore verwenden anstatt eines Agarplattensatzes chromogene Nährböden für die Erstanlage der Urinkultur. Diese Medien sind normalerweise nicht selektiv. Durch in dem Medium enthaltene farbgebende Substanzen entwickeln verschiedene Erreger spezifische Farben auf dem Medium und bieten so eine schnelle Identifizierung. Erfahrungsgemäß eigenen sich diese Medien nicht für eine Erstanlage, sondern eher zur Bestätigung der Identifizierung nach der Vereinzelung.
Zur Erstanlage gehört auch der Hemmstofftest. Der Test ist eine sinnvolle Methode, um durch die Hemmung eines Referenzerregers (Bacillus subtilis) das Vorhandensein von Hemmstoffen aufzuzeigen. Bei der Durchführung des Hemmstofftests wird ein B. subtilis auf einer Mueller-Hinton-Platte flächig ausgestrichen. Je ein Tropfen Patientenurin wird auf die Agarplatte aufgetropft. Besitzt der Urin Hemmwirkung, so bildet sich nach Bebrüten um den Tropfen ein Hemmhof. Um ein Wegfließen des Tropfens zu verhindern, kann entweder mit der Öse kurz in den Agar eingestochen werden, ansonsten gibt es auch saugfähige Plättchen zum Auflegen, die dann mit Urin betropft werden. Mit dem Test auf Hemmstoffe wird überprüft, ob der Patient möglicherweise schon vor der Urinabgabe antimikrobiell wirksame Medikamente erhalten hat. Bei einem positiven Hemmstofftest hat bakterielles Wachstum auf den anderen Platten eine höhere Wertigkeit, da sich die Erreger resistent gegenüber der vorangehenden Therapie erwiesen haben. In diesem Fall müssen auch geringere Keimzahlen (<103/ml) als mögliche Infektion gewertet werden. Der Hemmstofftest kann außerdem eingesetzt werden um zu prüfen, ob der Patient ein verschriebenes Medikament tatsächlich eingenommen hat.

Ablesen der Urinkultur

Nach Übernacht-Bebrütung bei 37 °C können die Agarplatten abgelesen werden. Auf dem CLED-Agar erfolgt als erstes die Keimzahlbestimmung. Diese ist wichtig um bei bakteriellem Wachstum zu differenzieren, ob es sich um eine Infektion oder eine Kontamination durch Begleitflora handelt (Tab. 3). Allgemein gilt eine Keimzahl von 105 KBE (koloniebildende Einheiten)/ml als signifikant und damit als Indikator für eine Infektion. In Einzelfällen kann auch bei geringeren Keimzahlen eine klinisch signifikante Infektion vorliegen, wie z. B. bei:
Tab. 3
Bedeutung der Erregerzahl
Erregerzahl/ml
Bedeutung
≥105
Signifikante Bakteriurie, HWI
≥104
Verdächtiger Befund
<104
Meist keine Infektion
<103
Kontamination des Urins, in der Regel keine HWI außer bei charakteristischen klinischen und laborchemischen (Leukozyturie) Infektzeichen
HWI Harnwegsinfektion
  • Anwesenheit von antimikrobiell wirksamen Substanzen im Urin.
  • Erregern, die sich im Urin grundsätzlich nicht gut vermehren, z. B. Staphylococcus saprophyticus.
  • Kurzer Verweildauer des Urins in der Harnblase (Probengewinnung zu kurz nach der letzten Miktion, z. B. bei infektbedingter Pollakisurie).
  • Dilution der Bakterienkonzentration im Urin durch forcierte Diurese/Polyurie.
  • Chronischen Pyelonephritiden.
  • Urin von Kindern.
  • Biofilmbildung auf Katheteroberflächen, wo die meisten Bakterienzellen adhärent sind und nur wenige planktonisch im Urin schwimmen.

Erregerzahlbestimmung

Gemessen wird die Erregerzahl in KBE (koloniebildende Einheiten). Eine Kolonie auf der Platte steht dabei für eine KBE im Urin. Gerundet wird immer auf die Zehnerstelle. Um auf KBE/ml zu kommen, muss das auf die Platte aufgebrachte Probenvolumen eingerechnet werden. Bei 100 μl Einsaat muss die Zahl demnach verzehnfacht werden, um auf 1 ml zu kommen (=1.000 μl), bei einer Einsaat von 10 μl wird verhundertfacht (Tab. 4).
Tab. 4
Erregerzahlbestimmung
Kolonien auf Platte
Volumen Einsaat
Resultierende Erregerzahl/ml
10
100 μl
102
100
100 μl
103
1.000
100 μl
104
10.000
100 μl
105
10
10 μl
103
100
10 μl
104
1.000
10 μl
105
10.000
10 μl
106
Da Koloniezahlen von 100 und mehr nicht ausgezählt werden können, wird hier geschätzt oder mit Bildern verglichen (Abb. 3).
Die Erregerzahl wird auf der einen Hälfte der CLED-Agarplatte bestimmt. Auf der anderen Hälfte kann die Koloniemorphologie betrachtet und im Ausstrich festgestellt werden, ob es sich um eine Rein- oder eine Mischkultur handelt.
Auf den Selektivmedien wird vor allem das Vorhandensein von Wachstum überprüft. Dadurch kann auch die Großgruppenzugehörigkeit des Erregers eingeschätzt werden. So bedeutet Wachstum auf:
  • MacConkey-Agar: Es sind G- vorhanden, meistens Stäbchen.
  • Blut-CNA-Agar: Es sind G+ vorhanden, meistens Kokken, sofern kein gleichzeitiges Wachstum auf Sabouraud-G/C-Agar.
  • Sabouraud-G/C-Agar: Es sind Hefen vorhanden.
Falls auf mehreren Selektivmedien gleichzeitiges Wachstum vorliegt, handelt es sich vermutlich um eine Mischkultur oder einen sehr resistenten G- Erreger. Vorsicht: Bei Wachstum nur auf MacConkey- oder Blut-CNA-Agar kann ebenfalls eine Mischkultur vorliegen, sofern beide Erreger auf der gleichen Platte wachsen (beide G- oder beide G+). Vor allem Mischkulturen aus G- Erregern können problematisch sein. Wird nur eines der Selektivmedien verwendet (also MacConkey- ODER Blut-CNA-Agar), wird die Mischung oft nicht erkannt und im ungünstigsten Fall der „falsche“, d. h. der unwichtigere oder weniger pathogene Erreger behandelt. Bei Mischkulturen muss entschieden werden, ob es sich um eine Mischinfektion im Urin oder um eine Kontamination durch die Haut- oder Schleimhautflora bei der Probengewinnung oder -verarbeitung handelt. Dabei ist die Erregerzahl entscheidend. So weist beispielsweise das vereinzelte Auftauchen von G+ in einer hochkonzentrierten G- Kultur auf eine Hautkontamination hin.
Neben der Dreiteilung in G+, G- und Hefen kann mit einfachen Mitteln eine weitere Gruppenunterteilung vorgenommen werden. Folgende Differenzierungen bieten sich direkt bei der Ablesung an:
  • Grampositive: Die G+ Kokken können mit einer einfachen biochemischen Reaktion in Streptokokken und Staphylokokken unterteilt werden. Staphylokokken besitzen ein Enzym (Katalase) welches Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff spaltet. Reibt man eine Kolonie in einen Tropfen 3%ige Wasserstoffperoxidlösung, so bilden sich bei Staphylokokken demnach Blasen (Schaumbildung), bei Streptokokken hingegen nicht.
  • Gramnegative: Auf der CLED- und der MacConkey-Platte kann die Verwertung von Laktose am Farbumschlag abgelesen werden. Laktose-verwertende G- gehören normalerweise zu den Koliformen (es gibt Ausnahmen, die aber in der Routinediagnostik kaum eine Rolle spielen).
  • Die Laktose-negativen G- Erreger können über eine weitere einfache Reaktion in 2 Gruppen unterteilt werden, nämlich die Proteus-Gruppe und die Pseudomonas-Gruppe. Pseudomonas und Verwandte besitzen ein Enzym namens Cytochromoxidase, das auf entsprechenden Teststreifen nachgewiesen werden kann. Proteus und seine Verwandten sind dagegen Oxidase-negativ.
Darüber hinaus können auf den Agarplatten viele offensichtliche Merkmale des Erregers bestimmt werden, welche die weitere Identifizierung erleichtern (Tab. 5). Ergänzend können auch die biochemischen Reaktionen mit der makroskopischen Sichtung verglichen werden. Besteht beispielsweise aufgrund von Glanz und Geruch der Verdacht auf Pseudomonas, so kann dieser durch eine positive Oxidase-Reaktion verifiziert werden.
Tab. 5
Identifizierungsmerkmale von Bakterien und Hefen auf Agarplatten
Merkmal
Deutet hin auf
Bedeutung für die Identifizierung
Gestuftes Wachstum
Terrassenwachstum, „Schwärmen“
Charakteristisch für Proteus-Spezies
„Flatschige“, zerfranste oder sternförmige Kolonien
Motilität der Erreger, die von der Kolonie aus über den Agar kriechen
Häufig bei G- Erregern, G+ sind meist unbeweglich
Große, tropfige, flüssig wirkende Kolonien
Schleimbildung, Kapselbildung
Typisches Merkmal von Klebsiella
Deutliche Rotfärbung, auch auf CLED
Bildung von Eigenfarbstoff
Charakteristisches Merkmal von Serratia, kann auch bei Klebsiella auftreten
Metallisch grünlicher Glanz
„Ofenrohrglanz“
Blut-CNA hellt sich auf, ohne Vergrünung
β-Hämolyse
Klassisches Merkmal von B-Streptokokken, aber auch von S. aureus
Blut-CNA hellt sich auf, mit Grünverfärbung
α-Hämolyse
Typisches Merkmal von Streptokokken der Gruppe A
Starker, unangenehmer Geruch
Ammoniakbildung, Harnspaltung
Klassisch für Proteus-Arten
Auffälliger, nicht unbedingt schlechter Geruch
Geruch nach „Lindenblütentee“
Merkmal von Pseudomonas
G+ Grampositive; G- Gramnegative; CLED Cystin-Lactose-Elektrolyt-Deficient-Agar; Blut-CNA Blut-Agar mit Colistin, Nalidixinsäure

Erregeridentifizierung

Nicht zuletzt aus Kostengründen wird der Stellenwert der genauen Erregerdifferenzierung immer wieder in Frage gestellt, da für die Therapie in erster Linie das Antibiogramm entscheidend ist. Dennoch gibt es wichtige Argumente für eine exakte Identifikation der infektionsauslösenden Erreger:
  • Nach den aktuellen Regelwerken für die Antibiogramm-Erstellung (z. B. EUCAST, European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) muss die Gruppe des Erregers für eine Einstufung der Resistenz bereits bekannt sein.
  • Die Identifizierung des Erregers ist eine wesentliche Voraussetzung für die Ermittlung der Infektionsquelle (z. B. endogen bei E. coli, exogen bei Pseudomonas) im Einzelfall und bei Ausbruchsituationen.
  • Die Kenntnis des Erregers hilft den weiteren Verlauf der Infektion abzuschätzen (z. B. leicht chronisch bei Klebsiella oder mögliche komplizierende Folgen wie Steinbildung bei Proteus).
  • Bei einer zeitnahen erneut auftretenden Infektion kann aus der Erregeridentifizierung ersehen werden, ob es sich um eine Reinfektion oder eine Neuinfektion handelt.
  • Die RiliBÄK (2013) (Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen) schreibt das Führen einer Erregerstatistik vor.
  • Die Identifizierung eines Erregers gibt Hinweis auf seine Resistenzeigenschaften.
Umgekehrt kann auch das Antibiogramm Aufschluss über die Identität des Erregers geben. Idealerweise sollte die exakte Identifizierung durch einen Abgleich von Erregerdifferenzierung und Antibiogramm erfolgen. Einige bekannte Muster sind:
  • Alle G- sind gegen Penicillin immer (!) resistent.
  • E. coli ist meist Ampicillin-/Amoxicillin-sensibel, Klebsiella ist meist resistent.
  • Proteus ist immer Colistin-resistent (Nachteil bei Verwendung von Blut-CNA-Platten).
  • Enterokokken sind meist Ampicillin-sensibel, Cephalosporin-resistent und immer Oxacillin-resistent.
  • Streptococcus pyogenes (= A-Streptokokken, u. a. Erreger von Scharlach, Angina, Pyelonephritis) sind stets Penicillin-sensibel und stellen einen der seltenen Fälle dar, bei dem das Antibiogramm überflüssig ist.
  • Pseudomonaden sind gegen viele antimikrobielle Wirkstoffe resistent und eventuell sensibel gegenüber Gentamycin und Ciprofloxacin.
Anhand des Wachstums auf den Selektivplatten und den o. g. biochemischen Reaktionen lassen sich 6 große uropathogene Erregergruppen unterscheiden:
  • Hefen (Wachstum auf Sabouraud-G/C).
  • Staphylokokken (Wachstum auf Blut-CNA, Katalase-positiv).
  • Streptokokken (Wachstum auf Blut-CNA, Katalase-negativ).
  • Koliforme (Wachstum auf MacConkey, Laktose-positiv).
  • Proteus-Gruppe (Wachstum aus MacConkey, Laktose-negativ, Oxidase-negativ).
  • Die Koliformen und die Proteus-Gruppe gehören beide zu den Enterobakteriazeen.
  • Pseudomonas und Verwandte (Wachstum auf MacConkey, Laktose-negativ, Oxidase-positiv).
Das vorstehende Schema hat sich für die Routinedifferenzierung bewährt, bedarf jedoch bei selteneren Erregern wie Acinetobacter, Stenotrophomonas oder grampositiven Stäbchen einer untersuchungstechnischen Weiterung. Nach der ersten vorläufigen Identifizierung wird dazu parallel zum Antibiogramm eine weiterführende Identifizierung angelegt. Hierfür gibt es zahlreiche kommerzielle Systeme, die eine Vielzahl biochemischer Eigenschaften abprüfen. Für die bereits bestimmten Gruppen ist die weitere Vorgehensweise wie folgt.
Hefen
Hefen bedürfen in der Urologie normalerweise keiner weiteren Identifizierung. Sollte eine solche dennoch gewünscht sein, so kann man auf chromogene Nährmedien zur Bestimmung von Candida-Spezies zurückgreifen.
Staphylokokken
Traditionell wird bei den Staphylokokken zwischen Koagulase-positiven und Koagulase-negativen Staphylokokken (Abschn. 4.2) unterschieden. S. aureus ist Koagulase-positiv und koaguliert Fibrinogen in einer durch Schnelltests nachweisbaren Reaktion. Alle anderen Staphylokokken sind Koagulase-negativ. Diese Differenzierung genügt den aktuellen Anforderungen nur bedingt, da S. saprophyticus laut EUCAST im Antibiogramm gesondert beurteilt werden muss. Besser ist es, die genaue Staphylokokken-Spezies mit Hilfe alleinstellender Eigenschaften zu ermitteln:
  • Mikrokokken: sensibel gegen Bacitracin.
  • S. saprophyticus: resistent gegen Novobiocin.
  • S. aureus: Mannit-Abbau, erkennbar auf Mannit-Kochsalz-Platten. Koagulase-positiv.
  • S. epidermidis: wird nach dem Ausschlussprinzip identifiziert, S. epidermidis ist Bacitracin-resistent, Novobiocin-sensibel sowie Koagulase- und Mannit-negativ.
Die Reaktionen können separat z. B. mit Antibiotika-Plättchen und auf Mannit-Kochsalz-Platten durchgeführt werden. Es bieten sich aber auch kommerzielle Systeme an, welche die Reaktionen anwenderfreundlich verbinden (z. B. TETRA-Staph).
Streptokokken
Mehr als bei anderen Erregern stellt sich bei den Streptokokken die Frage, ob eine weitere Identifizierung notwendig ist. Zumindest die wichtigsten beiden Streptokokken-Gruppen sollten differenziert werden.
  • B-Streptokokken: zeigen eine manchmal nur schwache β-Hämolyse. Eine Identifizierung kann über den sog. CAMP-Test (benannt nach seinen Erfindern Christie, Aktins und Munch-Petersen) erfolgen.
  • Enterokokken: Enterokokken können durch ihre Fähigkeit zur Äskulin-Spaltung von anderen Streptokokken unterschieden werden (Swan 1954). Diese Reaktion ist Bestandteil bestimmter bunter Reihen, sie kann aber auch auf entsprechenden Agarplatten ermittelt werden (sog. Enterokokkenplatte).
Koliforme
Die Koliformen gehören wie die Proteus-Spezies zur großen Familie der Enterobakteriazeen. Zur Differenzierung dieser Gruppe bieten verschiedene Hersteller sog. bunte Reihen an, die über eine Sequenz von 10–20 Reaktionen die allermeisten Spezies identifizieren können. Die auf dem Markt vorhandenen Systeme unterscheiden sich z. T. stark im Preis, in der Handhabbarkeit und der Qualität der Identifizierung. Jeder Anwender muss daher für sich selbst ein System finden, das ihm zusagt und sollte dieses auch im Rahmen einer internen Qualitätskontrolle überprüfen. Bei den bunten Reihen muss berücksichtigt werden, dass es auch atypische Stämme geben kann, die für Ihre Art ungewöhnliche biochemische Reaktionen aufweisen. An solchen „Abweichlern“ scheitern auch Systeme, die ansonsten eine zuverlässige Identifizierung bieten.
Typische in bunten Reihen getestete Reaktionen
  • Glukose-Abbau
  • Indol-Produktion
  • H2S-Produktion
  • Mannitol-Abbau
  • Sorbitol-Abbau
  • Harnstoff-Abbau zu Ammoniak
  • Ornithin- und Lysin-Abbau
  • Zitrat-Verwertung
  • Phenylalanin-Produktion
  • LANA (L-Alanin Nitroalinid)
Pseudomonas und Verwandte
Bei den Pseudomonaden ist eine weitere Identifizierung nicht zwingend erforderlich. Sollte diese jedoch gewünscht ein, gibt es kommerzielle bunte Reihen zur Identifizierung von Nicht-Enterobakteriazeen. Mit Hilfe dieser kann auch bei Pseudomonas und verwandten Erregern die genaue Art ermittelt werden.
Proteus-Gruppe
Auch bei Proteus stellt sich wie bei den Koliformen die Frage, inwieweit die genaue Spezies bestimmt werden muss, zumal der Erreger gut an seinen charakteristischen Merkmalen zu erkennen ist. Grundsätzlich sollte zur Überprüfung der eigenen Urteilsfähigkeit und Qualitätskontrolle dann und wann eine bunte Reihe angelegt werden.

Bakteriensystematik

Die Systematik (Taxonomie) der Bakterien ist kompliziert und bisweilen unübersichtlich. Das liegt an der asexuellen Vermehrung von Bakterien durch Teilung. Während die meisten Tiere und Pflanzen aufgrund Ihrer geschlechtlichen Vermehrung in Arten unterteilt werden, kann dieses Merkmal bei den sich vegetativ vermehrenden Bakterien nicht angewendet werden. Stattdessen werden traditionell morphologische und biochemische Merkmale zur Klassifizierung genutzt. Heute verwendet man die genetische DNS-Ähnlichkeit. Diese Methodik führt immer wieder zu Umbenennungen und neuen Einteilungen und spiegelt den Versuch wieder, eine Systematik zu finden, die auf der biologischen Verwandtschaft der Bakterien gründet.

Antibiogramm

Mit dem Antibiogramm wird im Labor ausgetestet, welche antimikrobiellen Substanzen (Antibiotika) gegen den nachgewiesenen Erreger wirksam sind. Die gewonnenen In-vitro-Ergebnisse sind z. T. nicht uneingeschränkt auf das lebende System übertragbar, aber es handelt sich in der Regel um eine für die klinische Situation ausreichende Abschätzung. Gerade heute in Zeiten zunehmender Multiresistenzen ist die sorgfältige Erstellung eines Antibiogramms vor Beginn einer rationalen medikamentösen Therapie so wichtig wie noch nie (Gyssens 2011, Pulcini und Gyssens 2013). Für die Durchführung des Antibiogramms werden klassischerweise der Agardiffusionstest und das Dilutionsverfahren verwendet.
Beim Dilutionstest werden 2 Konzentrationen des Antibiotikums auf ihre Hemmwirkung gegen den Erreger getestet. Die Ergebnisse führen zur Resistenzeinstufung (Abb. 4) auf der Basis der Grenzkonzentrationen, Breakpoints genannt. Aus den Breakpoints werden auch die zugehörigen Grenzen für die Hemmhofdurchmesser im Agardiffusionstest (ADT) ermittelt.
Beim Agardiffusionstest (ADT) werden mit einem Antibiotikum beschickte Plättchen auf einer Mueller-Hinton-Agarplatte platziert. Der Wirkstoff diffundiert in den Agar (Agardiffusion), wobei die Konzentration mit dem Abstand zum Plättchen abnimmt. Dadurch bildet sich ein Konzentrationsgradient um das Plättchen herum aus. Zuvor wurde der auszutestende Erreger flächig auf der Platte ausgestrichen. Beim Bebrüten wachsen die Bakterien an das Plättchen heran, bis eine zur Wachstumshemmung ausreichende Konzentration des Antibiotikums vorliegt, sodass ein sog. Hemmhof um das Plättchen herum entsteht. Für jedes Antibiotikum gibt es äußere und innere Soll-Hemmhofgrößen. Liegt der ermittelte Hemmhof außerhalb des äußeren Sollwertes, so ist der Erreger sensibel. Liegt der Hemmhof innerhalb des inneren Sollwertes, so ist der Erreger resistent. Liegt der Hemmhof zwischen der äußeren und inneren Sollwertgrenze, so wird der Erreger als intermediär eingestuft. Nach EUCAST sind die Soll-Hemmhofgrößen nicht nur abhängig vom Antibiotikum, sondern auch vom Erreger bzw. der Erregergruppe. Dadurch wird die Beurteilung noch spezifischer als es bisher der Fall war.
Der ADT ist ein abgeleitetes System für die Resistenzbestimmung, da Grenzkonzentrationen in Hemmhofdurchmesser umgerechnet werden müssen. Diese Hemmhofgrenzen haben jedoch nur dann Gültigkeit, wenn die Methode standardisiert eingesetzt wird. Jede Schwankung oder Abweichung verfälscht die Ablesung. Wichtig ist deshalb auch gerade hier die interne Qualitätskontrolle (s. u.). Zu den wichtigsten Fehlerquellen beim ADT gehören:
  • Dicke der Agarplatten: Bei zu dünnen Agarplatten breitet sich das Antibiotikum mehr zur Seite als nach unten aus und die Hemmhöfe werden zu groß. Bei zu dicken Platten verhält es sich umgekehrt.
  • Erregerdichte in der Suspension: Bei einer zu hohen Erregerdichte wachsen die Bakterien zu schnell zu sichtbaren Kolonien heran, bevor der Wirkstoffgradient greifen und das Wachstum hemmen kann. Die Hemmhöfe werden kleiner. Bei einer zu dünnen Suspension verhält es sich umgekehrt.
  • Einwirkzeit bis zur Bebrütung: Verzögert sich der Transfer der Platten in den Brutschrank, dann bildet sich der Konzentrationsgradient zu schnell aus, also noch bevor die Bakterien anfangen zu wachsen. Das Antibiotikum bekommt so einen „Wirkungsvorsprung“ und die Hemmhöfe werden größer.
Trotz dieser potenziellen Fehlerquellen und Unwägbarkeiten hat der ADT einige entscheidende Vorteile gegenüber den Dilutionssystemen:
  • Der Test verzeiht kleinere Kontaminationen, da diese von der hohen Erregerdichte im Inokulum überwuchert werden. Im Dilutionssystem dagegen können auch kleinere Verunreinigungen das Ergebnis verfälschen.
  • Die Ablesung erfolgt „semiquantitativ“, d. h. es kann nicht nur eine Resistenzeinstufung vorgenommen, sondern anhand der Hemmhofgrößen auch das Ausmaß der Sensibilität abgeschätzt werden. Verschiedene Antibiotika, die beide als sensibel eingestuft werden, können so noch gegeneinander abgewogen werden.
  • Wird akzidentell eine Mischkultur in die Suspension gebracht, erkennt man dies an doppelten Hemmhöfen auf der Platte. Das Ergebnis ist dann zwar nicht verwertbar, der Fehler jedoch klar ersichtlich, was im Dilutionssystem nicht möglich ist.
Die Breakpoints und die Grenzen für die Hemmhofdurchmesser werden experimentell ermittelt und in Form von Normen veröffentlicht. Zu den entsprechenden Grenzwerten gehört dann auch immer eine Anleitung für die korrekte Anlage des Antibiogramms. Werden die normierten Grenzwerte in der Praxis verwendet, so muss auch das zugehörige Regelwerk genutzt werden. Passt beides nicht zusammen, so werden die Ergebnisse verfälscht und verlieren ihre Aussagekraft. Die in Deutschland gemeinhin verwendete Norm war bisher die DIN-Norm (DIN 58940-3:2007-10). Diese soll jetzt durch die EUCAST abgelöst werden, um die Methode des Antibiogramms europaweit zu harmonisieren.
Das Antibiogramm überprüft die In-vitro-Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen gegen einen nachgewiesenen Erreger. Die endgültige Auswahl des Antibiotikums basiert dann auf der individuellen klinischen Konstellation eines jeden Patienten und den einschlägigen Richtlinien und Therapieempfehlungen (z. B. S3-Leitlinie Unkomplizierte HWI, AWMF 043/044 2010, Stiefelhagen 2012)). Die Notwendigkeit und Art der antimikrobiellen Therapie wird letztlich vom Arzt nach klinischen Kriterien und nicht allein durch eine positive Urinkultur bestimmt: Demnach ist eine asymptomatische Bakteriurie grundsätzlich kein Anlass für eine Behandlung.

Qualitätssicherung

Die Qualitätssicherung im Urinlabor hat einen hohen Stellenwert. Dazu trägt die 2013 in Kraft getretene RiliBÄK (Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen B3) bei, in der Vorgaben zur Qualitätssicherung klar spezifiziert werden. Gefordert werden für die Arbeit im Labor sowohl interne als auch externe Qualitätskontrollen.
Für die internen Qualitätskontrollen enthält die RiliBÄK dezidierte Hinweise in Tabellen und Listen, welche Untersuchungsmethoden mit welcher Frequenz zu testen sind. Grundsätzlich unterliegen alle Verfahren der Qualitätskontrolle und unterscheiden sich im Wesentlichen durch die Intervalle der Überprüfung. Die einzige Ausnahme sind Systeme mit einer „eingebauten“ Qualitätskontrolle wie viele Schnelltest (z. B. für Chlamydien) die auf Antikörperbindung basieren. Alle Überprüfungen sind zu protokollieren und die Prüfprotokolle über 5 Jahre aufzubewahren. Unabdingbar für die internen Qualitätskontrollen sind definierte Kontrollstämm e, die im Labor vorliegen müssen. Nur wer bekannte Erreger mit bekannten Resistenzeigenschaften testet, kann auf diese Weise seine Methodik validieren. Die RiliBÄK schreibt die Verwendung von Kontrollstämmen vor, ohne diese zu spezifizieren. Folgende 3 Erreger erscheinen besonders gut geeignet:
  • E. coli, DSM 1103 (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, identisch mit ATCC [American Type Culture Collection] 25922)
  • S. aureus, DSM 1104 (identisch mit ATCC 25923)
  • P. aeruginosa, DSM 1117 (identisch mit ATCC 27853)
Die Kontrollstämme können auf Platten gehalten werden, wobei sie jede Woche einmal neu überimpft werden müssen. Nach 3-maligem Überimpfen (also einmal im Monat) muss der Kontrollstamm neu aus einer Kryokultur angezüchtet werden. Eine Kryokultur kann leicht mittels entsprechender Stammhaltungssysteme angelegt werden, bei denen der Erreger in kleinen Kunststoffkugeln in einem Röhrchen eingefroren wird.
Zur externen Qualitätssicherung sind Ringversuch e vorgeschrieben. Unabhängig von den verschiedenen Zulassungs- oder Abrechnungsmodalitäten ist die Teilnahme für alle Laboreinrichtungen verpflichtend, wenn sie die entsprechenden Untersuchungsmethoden vorhalten. Neben dem Ringversuch Bakteriologie B für Identifizierung und Antibiogramm gibt es heute auch Ringversuche für die Gramfärbung und das Urinsediment. Die Ringversuche werden von 2 qualifizierten Instituten angeboten, namentlich der Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.V. (INSTAND; http://www.instandev.de; früher Institut für Standardisierung und Dokumentation im medizinischen Laboratorium e. V., die Abkürzung hat sich gehalten) und dem Referenzinstitut für Bioanalytik (RfB; http://www.dgkl-rfb.de).

Zukunft der Urinmikrobiologie

Technische Neuerungen

In den letzten Jahren werden für die Arbeit im Labor verstärkt automatisierte Systeme angeboten. Diese Großgeräte bieten eine exakte Erregeridentifizierung und ein umfassendes Antibiogramm an, ohne dass eine Beurteilung durch den Untersuchenden erfolgen muss. Die eigentliche, manuelle Laborarbeit beschränkt sich damit auf das Gewinnen einer Reinkultur. Die Geräte sind fachlich sehr gut und ausgereift, aber häufig sehr kostenintensiv. Eine Anschaffung sollte vorher gut kalkuliert werden. Zudem besteht die latente Gefahr, dass sich der Urologe zu sehr auf die Expertise des Gerätes verlässt. Die automatisierte Identifizierung kann das medizinische Fachwissen im klinischen Kontext nur ergänzen und unterstützen, aber nicht ersetzen.
Vorteile automatisierter Systeme
  • Verkürzung der Analysezeiten durch die fotometrische Ablesung der Ergebnisse
  • Identifikation eines breiten, praktisch lückenlosen Spektrums an Erregern, was mit den herkömmlichen bunten Reihen nur schwer zu erreichen ist
  • Gleichzeitiges Austesten einer großen Bandbreite von Antibiotika
  • Integrierte Erkennung von multiresistenten Erregern wie MRSA (Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus) oder MRGN (multiresistente Gramnegative).
  • Die Erstellung einer fortlaufenden Erreger- und Resistenzstatistik wird durch die digitale Auswertung erleichtert
  • Automatischer Abgleich von Identifizierungsergebnis und Antibiogramm

Resistenzlage der bakteriellen Erreger

Die Bedeutung multiresistenter Erreger wird immer wichtiger in der Medizin und insbesondere bei HWI in der Urologie (Foxman und Buxton 2003). Die Entwicklung neuer antimikrobieller Substanzen kann hier kaum schritthalten. Daher wird fieberhaft nach Behandlungsalternativen zur klassischen Antibiotikatherapie gesucht (Barber et al. 2013). In Erwägung gezogen wird hierbei die Verwendung von Bakteriophagen zur Bekämpfung von pathogenen Bakterien oder die Entwicklung von Substanzen, welche die bakterielle Kommunikation im Körper und damit die Manifestation von Pathogenitätsfaktoren verhindern (Harjai et al. 2010). Ein weiterer Ansatz ist die Immunstimulation zellulärer Erregerbestandteile. Auch pflanzliche Wirkstoffe erhalten zunehmend mehr Beachtung, wie beispielsweise die Wirkung von Cranberry-Produkten auf die Adhärenz und Beweglichkeit von E. coli-Bakterien (Di et al. 2006, Albrecht et al. 2007, Chung et al. 2012). Inwiefern diese neuen Therapieansätze Eingang in die Resistenztestung finden werden, bleibt abzuwarten.

Zusammenfassung

  • Urogenitale Infektionen: herausragende individuelle und sozio-ökonomische Bedeutung in der Medizin und speziell im Fachbereich der Urologie.
  • Wichtigste Erreger urogenitaler Infektionen: Bakterien, dazu kommen Hefen, Viren und Protozoen.
  • Bakterielle Erreger: Unterscheidung zwischen Gramnegativen (G-, meist aus dem Darm, in seltenen Fällen auch aus der Umwelt) und Grampositiven (G+, meist von der Hautoberfläche, in seltenen Fällen auch aus dem Darm oder aus der Umwelt).
  • Anlage von Patientenurin auf Agarplatten: Vorhandensein von Bakterien im Harn erkennen und Vorliegen einer Infektion beurteilen.
  • Bei Infektion: Erregereinteilung in verschiedene Übergruppen mittels Selektivplatten und bestimmter Einzelreaktionen, zur weiteren Identifizierung Identifizierungssysteme und bunte Reihen verwenden (Bestimmung von Erregergattung/-spezies anhand biochemischer Eigenschaften.
  • Erregeridentifizierung bedeutsam für Abschätzung der Infektionsherkunft und des mutmaßlichen weiteren Verlaufs, außerdem notwendige Voraussetzung für sachgemäße Durchführung des Antibiogramms.
  • Antibiogramm: Durchführung mittels Agardiffusionstest oder Dilutionssystemverfahren. Grundlage für testgerechte antimikrobielle Behandlung (Syn.: antimiokrobielle Chemotherapie, „Antibiose“), Notwendigkeit und Art der Durchführung obliegt der klinisch-fachlichen Beurteilung des Urologen/Arztes.
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