Die Urinmikrobiologie ist ein elementarer Bestandteil der Diagnostik und Therapie urologischer Infektionskrankheiten. Eine Vielzahl pathogener und fakultativ pathogener Erreger ist in der Lage, den Urogenitaltrakt zu besiedeln und Krankheiten zu verursachen. Eine sorgfältige Diagnostik seitens des Urologen ist notwendig, um das Vorhandensein einer Infektion zu erkennen und im Falle einer klinischen Relevanz den Erreger zu identifizieren und seine Resistenzlage zu ermitteln. Gerade in Zeiten einer zunehmenden Resistenzbildung ist ein aussagekräftiges Antibiogramm die unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer rationalen Antibiotika-Therapie.
Harnwegsinfektionen gehören zu den häufigsten nosokomialen und ambulant erworbenen bakteriellen Infektionen (Hörl 2011; Magistro et al. 2017) und zählen zu den häufigsten Ursachen für einen Arztbesuch. Sie sind nach den Atemwegsinfektionen der zweithäufigste Grund für ambulante Antibiotikaverordnungen. Ihre individuelle und sozio-ökonomische Bedeutung nimmt stetig zu, da nicht zuletzt aufgrund des demografischen Wandels immer mehr ältere Menschen als Risikopatienten für Harnwegsinfekte in Betracht kommen (Stamm und Norrby 2001; Foxman und Buxton 2013).
Die meisten Erreger von Harnwegsinfektionen(Uropathogene Erreger) sind relativ leicht aus Körperproben zu isolieren. Üblicherweise wird hierfür Urin genutzt, aber auch andere Materialien werden untersucht, wie Sperma, Abstriche, Exprimate und Punktate sowie Blutkulturen. Bei der ambulanten Patientenversorgung ermöglicht das Labor in der Urologischen Praxis eine patientennahe und differenzierte mikrobiologische Diagnostik. Diese ist eine wesentliche Voraussetzung für eine rasche, testgerechte und mithin effiziente antimikrobielle Therapie.
In Zeiten steigender Antibiotika-Resistenzen ist eine schnelle und fachgerechte Diagnostik der HWI-Erreger in der Urologie wichtiger denn je (Magistro et al. 2017).
Praxislabor
Das Vorgehen bei der Labordiagnostik teilt die Urologen in zwei Gruppen, nämlich in solche mit einem eigenen Labor und in diejenigen, die ihre Erreger in ein Fachlabor einschicken und von diesem die Identifizierung und die Resistenzbeurteilung erhalten. Beides hat Vor- und Nachteile. Fachlabore sind hochspezialisiert und weisen daher eine geringere Fehlerquote bei der Erregeridentifizierung und Antibiogrammerstellung auf. Dafür ist im Praxislabor eine patienten-nahe Diagnostik möglich, so dass der Urologe schneller und flexibler bei der Beurteilung und in der Umsetzung der therapeutischen Konsequenzen agieren kann. Auch gemischte Konzepte haben sich bewährt. So sollte die Hilfe eines Fachlabors in Anspruch genommen werden, wenn die Mittel und Möglichkeiten des Praxislabors ausgeschöpft sind. Unabhängig vom Labor gehört die korrekte Interpretation des Untersuchungsergebnisses zur fachlichen Kompetenz des Urologen. Dies setzt ein solides mikrobiologisches Grundwissen voraus.
Die Einrichtung eines Praxislabors erfordert den Einsatz von Kapital und Arbeit. Der Aufwand ist jedoch gering verglichen mit den sich dadurch bietenden Möglichkeiten. Tab. 1 gibt eine Übersicht über die wichtigsten Voraussetzungen für die Einrichtung eines mikrobiologischen Labors in der Urologischen Praxis.
Tab. 1
Einrichtung eines Praxislabors
Voraussetzungen
Ausstattung
• ausreichend großer Raum
• gut desinfizierbare Arbeitsflächen
• verschließbare Tür (Zugangs-begrenzungen notwendig)
• Kennzeichnung für Biogefährdung („Biohazard“)
• Gefahrlose Entsorgung des kontaminierten Materials (am besten durch eine professionelle Firma)
• Handfreie Bedienung der Armaturen der Waschbecken und Spender (Flüssigseife, Desinfektionsmittel)
Hilfestellung bei formalen Vorgaben kann immer auch das Robert-Koch Institut (RKI) geben. Auf der Homepage (www.rki.de) sind RKI-Richtlinien zu verschiedenen Themen zu finden, die eine gute Verfahrensanleitung für die Einrichtung und den Betrieb eines mikrobiologischen Labors darstellen und üblicherweise auch von Behörden anerkannt werden. In der Planungsphase empfiehlt sich eine frühzeitige Abstimmung mit den zuständigen behördlichen Genehmigungs- und Kontrollinstanzen (Gewerbeaufsichtsamt/Gesundheitsamt).
Uropathogene Erreger
Bakterielle Infektionen des Harntraktes sind meistens endogenen Ursprungs, können aber selten auch exogen bedingt sein (Nielubowicz und Mobley 2010). Endogene Infektionen werden meistens von Darmbakterien aus dem Gastrointestinaltrakt verursacht, während die Erreger exogener Infektionen aus der Umgebung des Patienten stammen. Letztere können einerseits Bakterien der belebten und unbelebten Umwelt sein, andererseits vor allem unter schlechten hygienischen Verhältnissen aber auch die Darmbakterien anderer Menschen. In seltenen Fällen können Infektionen des Urogenitaltrakts auch hämatogen aus einem anderen körpereigenen Infektfokus entstehen.
Die meisten Erreger von Harnwegsinfektionen sind fakultativ pathogen (sog. Opportunisten), also keine obligaten Krankheitserreger, sondern Keime der Normalflora oder der Umwelt, die unter bestimmten Umständen eine Erkrankung verursachen können. Ausschlaggebend für den Ausbruch und den Verlauf einer durch Bakterien verursachten Infektionskrankheit sind neben Art und Eigenschaften des Erregers immer auch der Allgemeinzustand und die Immunkompetenz des Patienten (Nielubowicz und Mobley 2010). Neben den Opportunisten gibt es auch eine Reihe von sexuell übertragbaren Erregern (STI), die an einen menschlichen Wirt gebunden sind und daher als obligat pathogen gelten. Zu ihnen gehören Erreger wie beispielsweise Gonokokken, Chlamydien, Ureaplasmen oder auch Spirochäten (WHO 2001).
Ausschlaggebend für die Bedeutung bzw. Virulenz eines Erregers sind seine Pathogenitätsfaktoren (Magistro et al. 2017). Diese ermöglichen ihm, in den Körper oder sogar bis in die Wirtszellen zu gelangen, dort zu überleben, sich zu vermehren und sich gegen das Immunsystem des Wirtsorganismus zu behaupten. Manche dieser Pathogenitätsfaktoren von Bakterien können schon beim Wachstum auf Agarplatten direkt erkannt werden. Dazu gehören die Fähigkeit zur Spaltung von Harnstoff, erkennbar am Ammoniakgeruch (Proteus), oder die Bildung von Schleimkapseln (Klebsiella), welche den Erreger vor feindlicher Umwelt und damit auch vor dem menschlichen Immunsystem schützen. Auch die Beweglichkeit eines Bakteriums gilt als Pathogenitätsfaktor, welche sich bereits auf einer Agarplatte abschätzen lässt.
Bakterien
Prinzipiell werden Bakterien in zwei große Gruppen unterteilt: Die Grampositiven (G+) und die Gramnegativen (G-) (Hucker und Conn 1923). Streng genommen sind die G+ verglichen mit den G− eine sehr kleine und spezielle Gruppe, doch haben sie eine so große Bedeutung in der Medizin, dass sie den G− fast gleichwertig gegenüberstehen. Die Gruppen werden durch die Methode der Gramfärbung unterschieden, eine traditionelle Färbemethode, die erstmals 1884 von dem dänischen Internisten Hans Christian Gram beschrieben wurde. Ausschlaggebend für das Färbeverhalten ist dabei die Beschaffenheit der Zellwand (Abb. 1). Der blaue Farbstoff bleibt bei den G+ in der dicken Zellwand haften und färbt die Zellen blau. Die G- mit der dünneren Mureinschicht müssen mit rot gegengefärbt werden, da der blaue Farbstoff nicht greift. Außerdem ist es möglich, die Gruppen auf Selektivmedien zu unterscheiden (siehe unten), oder durch einen Test mit Kalilauge (G− Bakterien ziehen in Kalilauge gerührt Fäden) (Tab. 2).
Abb. 1
Aufbau der Zellwand bei grampositiven (G+) und gramnegativen (G−) Erregern
Tab. 2
Gegenüberstellung von grampositiven (G+) und gramnegativen (G−) Erregern
Merkmal
Grampositive (G+)
Gramnegative (G−)
Erscheinung in der Gramfärbung
Blau (auch dunkelviolett)
Rot (auch hellrosa oder hell lila)
Beweglichkeit
Meist unbeweglich (Ausnahmen z. B. Bacillus spezies)
Meist beweglich (Ausnahmen z. B. Klebsiella, Acinetobacter)
Koloniemorphologie
Kleine, tropfenartige, oft unscheinbare Kolonien
Häufig große, ausgefranste „Kriechkolonien“
Zellwand
Dicke, mehrlagige Wand aus Murein
Dünne, einschichtige Wand aus Murein, zusätzlich eine Lipopolysaccharidschicht
Reaktion auf Kalilauge
Ziehen Fäden
Keine Reaktion
Wachstum auf typischen Nährmedien
CLED, Blut-CNA
CLED, MacConkey
×
Gramnegative Bakterien (G−)
Die meisten G− lassen sich prinzipiell in zwei Hauptgruppen untergliedern, die Enterobakteriazeen (Enterics) (Sandersen 1976) und die Nicht-Enterobakteriazeen oder Non-Enterics (Anmerkung: Heute wird teilweise auch die taxonomische Einheit Enterobacteriales gegenüber den Enterobakteriazeen zur Gruppenunterteilung bevorzugt). Die Enterics bilden die große taxonomische Gruppe der Darmbakterien (alle Enterics sind Darmbakterien, aber nicht alle Darmbakterien sind Enterics) mit folgenden Eigenschaften:
Es handelt sich durchweg um gramnegative Stäbchen.
Alle wachsen fakultativ aerob, d. h. sie brauchen keinen Sauerstoff, vertragen ihn aber.
Sie können Glukose und eventuell auch andere Zucker vergären und bilden dabei Säure.
Sie können Nitrat zu Nitrit abbauen.
Sie sind Oxidase-negativ, da sie das Enzym Cytochrom-Oxidase nicht besitzen.
Die Non-Enterics bilden keine einheitliche Verwandtschaftsgruppe, sondern umfassen alle gramnegativen Erreger, die nicht zu den Enterics gehören. Sie sind durch folgende Eigenschaften charakterisiert:
Es handelt sich um gramnegative Stäbchen oder aber um kokkoide, kurze Stäbchen.
Sie sind normalerweise obligat aerob, wachsen also nur in Anwesenheit von Sauerstoff.
Sie fermentieren bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Aeromonas) keine Glukose oder anderen Zucker.
Sie verfügen bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Acinetobacter) über eine Cytochrom-Oxidase, sind also Oxidase-positiv.
Der bedeutsamste Erreger von Harnwegsinfektionen ist Escherichia coli, der über 70 % aller Harnwegsinfektionen verursacht (Hacker 2002; Flores-Mireles et al. 2015). Danach folgen Erreger wie Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis und Proteus mirabilis (Flores-Mireles et al. 2015). Eine Übersicht der häufigsten bakteriellen uropathogenen Erreger liefert Tab. 3.
Tab. 3
Übersicht der häufigsten bakteriellen Erreger von Infektionen des Urogenitaltraktes (Uropathogene Erreger)
Chlamydien wurden vormals aufgrund ihrer intrazellulären Lebensweise für „große Viren“ gehalten. Es handelt sich allerdings um kleine gramnegative Bakterien mit einem reduzierten Genom (Jeffrey und Peipert 2003). Chlamydien sind auf klassischen Nährböden nicht anzüchtbar, da sie außerhalb der Wirtszellen nicht überleben. Sie gehören zu den STI-Erregern. Heute weiß man, dass Chlamydien-Infektionen oft symptomlos verlaufen (Stamm und Cole 1986). Man schätzt, dass 5 % aller Männer Chlamydien-Träger sind, ohne es zu wissen. Es gibt für die Urologische Praxis kommerzielle Schnelltests zum Nachweis von Chlamydien, die allerdings nicht besonders zuverlässig sind.
Coliforme Bakterien
Die Gruppe der coliformen Bakterien wird nach den wichtigsten Gattungen in dieser Gruppe auch salopp „Coli-ECKE“ genannt:
E. coli ist innerhalb dieser Gruppe der wichtigste und häufigste uropathogene Erreger (Hacker 2002). Die Coliformen sind allesamt klassische Darmbakterien und damit opportunistische Erreger (Parr 1939). Zusammen verursachen sie den Großteil aller Harnwegsinfektionen (>70 %). Sie ähneln sich in ihren Eigenschaften, und sind innerhalb der Gruppe in den meisten Fällen nur schwer anhand der Koloniemorphologie zu unterscheiden. Für eine weitere Differenzierung kann eine bunte Reihe erstellt werden und so anhand unterschiedlicher biochemischer Eigenschaften der Erreger näher bestimmt werden. Ein charakteristisches Merkmal der Coliformen ist der Abbau von Laktose zu Milchsäure: eine Reaktion, die auch auf verschiedenen Nährmedien nachgewiesen werden kann.
Proteus-Gruppe
Bakterien dieser Gruppe sind G-, hochbewegliche Stäbchen. Sie spalten Harnstoff, wobei Ammoniak entsteht. Das macht auch den charakteristischen unangenehmen Geruch aus und stellt gleichzeitig einen Pathogenitätsfaktor dar (Konieczna et al. 2012). Ammoniak, ein Zellgift, kann den Urin alkalisieren und zu Steinbildung führen. Der wichtigste Vertreter ist Proteus mirabilis, der häufig bei chronischen sekundären bzw. nosokomialen Harnwegsinfektionen anzutreffen ist. P. mirabilis ist oft sehr resistent und dadurch schwer therapierbar. Andere Vertreter der Gattung Proteus sind P. vulgaris, P. penneri (Hacker 2002). Zur Proteus-Gruppe zählen außerdem noch andere Gattungen wie Providencia, Morganella u. a.
Pseudomonaden
Der wichtigste Vertreter dieser Gruppe ist Pseudomonas aeruginosa. Bei Pseudomonas-Infektionen handelt es sich immer um exogene Infektionen. Pseudomonas ist häufig resistent gegenüber vielen Antibiotika (Takeyama et al. 2002; Prakash und Saxena 2012) und gleichzeitig ein sehr genügsamer „Asket“, der sogar in destilliertem Wasser leben kann. Aufgrund dieser Eigenschaft ist er als nosokomialer Erreger gefürchtet. P. aeruginosa hat viele charakteristische Merkmale (typischer Geruch, Glanz, Grünfärbung) und kann daher auch gut ohne „Bunte Reihe“ (s.u.) erkannt werden. Zu den Pseudomonas-Verwandten zählt noch die Gattung Burkholderia, die früher Teil der Gattung Pseudomonas war. Pseudomonaden können auch als Multiresistente Erreger (MRE) in Erscheinung treten (Prakash und Saxena 2012).
Acinetobacter
Acinetobacter ist im Krankenhaus nicht unbekannt und kann auch in der Urologischen Praxis vorkommen (Berry et al. 2013). Besonders erwähnenswert ist A. baumanii, der sich auch als Multiresistenter (MRE) einen Namen gemacht hat. Acinetobacter bildet kurze, kokkoide unbewegliche Stäbchen (von altgriechisch Akinese: hochgradige Bewegungsarmut bis Bewegungslosigkeit).
Spirochäten
Treponema pallidum, der Erreger der Syphilis, gehört zu den Spirochäten. Bisher konnte man den Erreger nicht auf Nährmedien anzüchten, der Nachweis erfolgt daher immunologisch. Die Syphilis war in Deutschland lange Zeit selten, die Infektionszahlen sind allerdings zwischen 2009 und 2015 auf mehr als das doppelte angestiegen (Bremer et al. 2017).
Neisserien
Neisserien sind G-, aerob wachsende, Oxidase-positive Diplokokken. Wichtigster Vertreter ist Neisseria gonorrhoeae, der Erreger der Gonorrhoe (= Gonokokken). Dieser ist nur auf speziellen Nährmedien („Kochblut-Agar“) und unter CO2-Anreicherung anzüchtbar. Die Gonokokken können viele Antibiotika-Resistenzen aufweisen (Bremer et al. 2017). Außer N. gonorrhoeae können noch weitere saprophytäre Neisserien vorkommen, die zum Teil auch auf CLED-Agar wachsen.
Grampositive Bakterien (G+)
Die meisten für die Urologie relevanten grampositiven Erreger gehören zu den grampositiven Kokken. Diese lassen sich grob unterteilen in die Staphylokokken und die Streptokokken mit jeweils zugehörigen Gattungen. Selten kommen auch pathogene grampositive Kokken vor, die nicht zu den Streptokokken oder Staphylokokken gehören (z. B. Aerococcus).
Staphylokokken
Für die urologische Mikrobiologie sind drei wichtige Staphylokokken-Spezies/Gruppen von Bedeutung, nämlich S. aureus, S. saprophyticus und S. epidermidis.
S. aureus ist sicher der bekannteste Vertreter der Staphylokokken, nicht zuletzt auch durch den MRSA (= Methicillin-Resistenter S.aureus, Gosbell 2012). S. aureus ist häufig bei Prostatitis, bei typischen Harnwegsinfektionen dagegen eher selten anzutreffen.
S. saprophyticus verursacht Zystitiden und Harnwegsinfektionen insbesondere bei jungen Frauen. Er vermehrt sich nicht gut im Urin, hat aber eine hohe Affinität zum Urothel.
S. epidermidis gehört zur normalen Standortflora der vorderen Harnröhre. Als Erreger von Harnwegsinfektionen ist er eher selten, kann aber auch hochresistente Stämme hervorbringen (MRSE = Methicillin-Resistenter S. epidermidis).
Mikrokokken
Die Mikrokokken gehören taxonomisch zwar nicht zu den Staphylokokken, können aber leicht mit diesen verwechselt werden. Sie bilden aber eine eigene Gattung (Wieser et al. 2002; Kocur et al. 2006). Sie gehören zu den wenigen Bakterien, die zwar im Urin vorkommen können, aber keine Erkrankungen verursachen (Baird-Parker 1965). Mikrokokken kommen auch als Kontaminanten aus der Luft z. B. auf schlecht gelagerten Agarplatten vor. Sie bilden oft auffällig farbige Kolonien (z. B. gelb, rosa). Beispiele sind Micrococcus luteus oder Micrococcus rosea.
Streptokokken
Streptokokken sind neben den Staphylokokken die wichtigste Gruppe der G+ Erreger. Ein typisches Merkmal der Streptokokken ist die Hämolyse, die gut an einer Aufhellung auf dem Blut- oder Blut-CNA-Agar zu erkennen ist. Die Streptokokken werden nach diesem Merkmal weiter in α-, β- und γ-hämolysierende Streptokokken klassifiziert:
α = vergrünende (unvollständige) Hämolyse
β = vollständige Hämolyse
γ = keine Hämolyse
Des Weiteren werden Streptokokken nach ihren Oberflächenantigenen in sog. Lancefield-Gruppen unterteilt. Wichtig für die urologische Mikrobiologie sind die Gruppe-B-Streptokokken (S. agalactiae), die vor allem in der weiblichen Normalflora der Vagina vorkommen, aber auch durchaus Harnwegsinfektionen (bei Mann und Frau) verursachen können (Mhalu 1977). Weiterhin bedeutsam sind die Enterokokken, die zu den D-Streptokokken gehören (s.o.). Gruppe-A-Streptokokken kommen dagegen selten als Erreger von Harnwegsinfektionen vor.
Enterokokken
Die Enterokokken gehören zu den wenigen G+ die im Darm leben, was durch das Präfix Entero- zum Ausdruck gebracht wird. Sie gehören zur Gruppe der D-Streptokokken (s.u.). Die wichtigsten Spezies in der Urinmikrobiologie sind E. faecium und vor allem E. faecalis; weitere Arten sind E. gallinarum, E. durans u. a.. Die Enterokokken und insbesonders E. faecium können sich als sehr resistent erweisen. Ein Unterscheidungsmerkmal zu den anderen („echten“) Streptokokken ist die Spaltung von Äskulin. Vancomycin-resistente Varianten von Enterokokken werden als VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) zu den multiresistenten Erregern (MRE) gezählt (Heintz et al. 2012).
Grampositive Stäbchen (G+)
Grampositive Stäbchen spielen bei Harnwegsinfektionen selten eine Rolle bis auf Corynebacterium urealyticum, ein harnspaltendes, häufig sehr resistentes Bakterium, das als Folge einer antimikrobiellen Fehlbehandlung Dauerformen bilden kann (Krishna et al. 2011). Neben C. urealyticum gibt es noch andere, apathogene Corynebakterien.
Weitere grampositive Stäbchen sind Lactobazillen (Döderlein’sche Stäbchen). Hier kann die Spezies L. rhamnosus gelegentlich pathogen sein. Meist sind Lactobazillen jedoch harmlos und haben vielmehr protektive Eigenschaften bei rezidivierenden Harnwegsinfektionen der Frau, die mittels oraler und vaginaler Applikationsformen therapeutisch genutzt werden (Baerheim et al. 1994; Beerepoot et al. 2012).
Mykoplasmen und Ureaplasmen
Mykoplasmen und Ureaplasmen sind G+ Stäbchen ohne Zellwand (Rogers et al. 1985). Sie benötigen besondere Bedingungen und sind auf den Standard-Nährmedien nicht anzüchtbar. Es eignen sich hier kommerzielle Systeme, welche die Erreger über Farbreaktionen nachweisen können. Da sie keine Zellwand besitzen, sind sie resistent gegenüber allen Antibiotika, die auf die Zellwandsynthese einwirken (z. B. alle β-Laktam-Antibiotika).
Multiresistente Erreger
Die multiresistenten Erreger (MRE) sind keine systematische Gruppe von Bakterien. Es handelt sich vielmehr um Erreger verschiedener Gruppen, die gegenüber den klassischen Antibiotika ein hohes Maß an Resistenzen aufweisen. Zur Definition von MRE werden sogenannte Leitsubstanzen festgelegt. Ein Keim, der gegen die betreffende Leitsubstanz resistent ist, wird als MRE definiert. Im Folgenden werden diejenigen Gruppen von MRE vorgestellt, welche die größte Bedeutung in der Urologie haben.
MRGN
MRGN steht für Multi-Resistente Gram-Negative. Unter diese Definition fallen verschiedene Gruppen von gramnegativen Stäbchen (Enterobakteriazeen, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter-Spezies), welche Resistenzen gegenüber verschiedenen Leitsubstanzen aufweisen. Dabei sind 3MRGN gegenüber drei von vier Leitsubstanzen resistent, 4MRGN gegenüber allen vier Leitsubstanzen. Die Leitsubstanzen repräsentieren dabei die vier wichtigsten Gruppen von Antibiotika. Das Auftreten von MRGN entwickelt sich zunehmend zu einem Problem in der Medizin, auch in der Urologie.
MRSA
MRSA steht für Methicillin-Resistente Staphylococcus aureus. Die zur Erkennung von MRSA zu testende Leitsubstanz ist Cefoxitin (Cauwelier et al. 2004), da Cefoxitin-resistente Staphylokokken auch gegenüber Methicillin resistent sind.
Neben den Bakterien gibt es auch eine Reihe von nichtbakteriellen Erregern, die Infektionen des Urogenitaltrakts verursachen können. Auf die meisten wird hier nur kurz eingegangen, da sie in einem klassischen Urinlabor nicht isoliert und identifiziert werden können. Die Erkennung erfolgt anhand des Krankheitsbildes, im Urinsediment, über molekularbiologische Methoden wie PCR oder über Antigentests. Eine Ausnahme bilden die Hefen, die ähnlich den Bakterien sehr gut auf Agarplatten angezüchtet werden können.
Hefen
Uropathogene Hefen sind in erster Linie Candida-Spezies, hier insbesondere Candida albicans (Behzadi et al. 2015). Candida-Infektionen treten vorwiegend bei immunsupprimierten Patienten oder im Gefolge einer Antibiotika-Therapie auf. Sie erscheinen auf Agarplatten als porzellanweiße, trockene oder cremige Kolonien, oft sehr klein, auf dem Sabouraud-Agar aber zum Teil auch groß, auffällig und schmierig. Im Grampräparat imponieren sie als große violette Zellen. Dabei ist das Zellinnere violett, die Zellwand selbst färbt rot.
Trichomonaden
Trichomonaden zählen nicht zu den Bakterien, sondern zu den Flagellaten (= Geißeltierchen, die zu den Einzellern zählen). Im Allgemeinen werden sie mikroskopisch nachgewiesen. Es existieren zwar auch spezielle Nährmedien, die Erfolgsquote der kulturellen Trichomonaden-Diagnostik ist jedoch zu gering für eine Routineanwendung.
Sonstige
Neben den Trichomonaden können grundsätzlich noch weitere uropathogene Protozoen und Viren im Urogenitalsystem vorkommen. Darüber hinaus gibt es gerade bei den STI-Erregern auch viele Viren. Da diese aber im Urologischen Praxislabor nicht anzücht- und isolierbar sind, wird an dieser Stelle nicht weiter darauf eingegangen.
Labordiagnostik von Harnwegsinfektionen
Grundlagen der Labordiagnostik
Am Anfang der mikrobiologischen Diagnostik (Abb. 2) steht die Probeentnahme (Gleckman et al. 1979) Diese erfolgt in der Urologischen Praxis unter Beachtung der bewährten Standards (vorzugsweise Morgenurin; Zeitintervall möglichst ≥4 h zwischen letzter Miktion und Probengewinnung; Reinigung des Meatus mit klarem Wasser; Mittelstrahlurin mit retrahiertem Präputium, bei Frauen mit gespreizten Labien od. Katheterurin). Aus mikrobiologischer Sicht sind folgende Aspekte besonders zu beachten (Lifshitz und Kramer 2000):
Die Kontaminationen durch die normale Standortflora der Schleimhaut ist zu minimieren, eine vollständige Vermeidung kann selten erreicht werden.
Urin ist ein gutes Wachstumsmedium für die üblichen uropathogenen Erreger. Daher muss die Urinprobe zügig weiterverarbeitet werden, um eine Verfälschung der Keimzahl zu vermeiden. Kommt es zu Verzögerungen (>1 h), so muss der Nativharn kühlgestellt werden (4 °C für max. 48 h), um das Erregerwachstum zu verlangsamen.
Die korrekte Gewinnung, Lagerung und Transport der Urinprobe sind essenzielle Voraussetzungen für eine zuverlässige mikrobiologische Harndiagnostik.
Im Vorfeld muss festgestellt werden, ob eine mikrobiologische Untersuchung angebracht ist. Dies erfolgt einerseits anhand klinisch-anamnestischer Kriterien, andererseits anhand des Urinsediments.
Abb. 2
Ablauf der mikrobiologischen Diagnostik im Urinlabor
Beim qualitativen Urinsediment werden ca. 10 ml gründlich durchmischten Urins aus einem sauberen Auffanggefäß für 3–5 min. bei 1500–2000 U/min. in einer Tischzentrifuge geschleudert. Nach Dekantieren des Überstandes wird die konzentrierte Probe mit einer Pipette auf einen Objektträger aufgebracht und einem Deckgläschen bedeckt. Die Lichtmikroskopie mit schwacher Vergrößerung (50–100-fach) verschafft zunächst einen Überblick. Bei stärkerer Vergrößerung (300–400-fach) werden die geformten Elemente identifiziert. Wesentlich ist die Anzahl an Leukozyten und Erythrozyten und deren Morphologie, aber es können ggf. noch eine Vielzahl anderer Strukturen gesehen werden, wie z. B. Zylinder, Kristalle oder Trichomonaden. Bei hoher Keimzahl sind auch Bakterien und Hefen im Sediment zu erkennen.
Zum Nitritnachweis werden üblicherweise Schnelltests in Form von Urinteststreifen verwendet (Fünfstück et al. 2012). Diese weisen die Umwandlung von Nitrat in Nitrit nach, was auf das Vorhandensein von Enterobakteriazeen hinweisen kann. Ein fehlender Nitritnachweis schließt eine bakterielle Infektion jedoch nicht aus, da viele Erreger Nitrat nicht zu Nitrit abbauen und die Testsysteme zudem eine nicht unerhebliche falsch-negative Fehlerquote aufweisen. Eine Positivreaktion kann daher allenfalls als Hinweis auf eine Harnwegsinfektion gewertet werden.
Urinkultur
Bei der Erstanlage einer Urinkultur wird die Urinprobe auf einem entsprechenden Satz Agarplatten (= Nährboden, Medium; Einweg-Petrischale gefüllt mit einem festen Nährmedium) ausgestrichen (Wilson und Gaido 2004). Ziel ist dabei die Vereinzelung des Erregers und eine Einteilung in Gruppen (G+, G− und Hefen), um bereits mit diesem ersten Schritt eine vorläufige Identifizierung zu ermöglichen. Hierzu empfiehlt sich die Verwendung eines Universalmediums (als Positivkontrolle, zur Keimzahlbestimmung und zum Vereinzeln des Erregers) und der Einsatz von Selektivmedien (zur Erkennung der Großgruppen). Folgende Nährmedien sind hierzu geeignet:
1.
CLED-Agar (Cystin-Lactose-Elektrolyte-Deficient)
ist das am weitesten verbreitete Universalmedium. Gegenüber anderen Universalmedien wie Blut oder Mueller-Hinton hat dieser Agar zwei vorteilhafte Eigenschaften: seine niedrige Elektrolytkonzentration schränkt die Bakterienbewegung ein und hindert dadurch Proteus am Schwärmen. Der Indikator Bromthymolblau zeigt durch einen Farbumschlag nach gelb die Laktoseverwertung von Bakterien an (Neblett 1976).
2.
MacConkey-Agar (Gallensalz-Laktose-Indikator nach MacConkey)
dient als Selektivmedium für die meisten G− Bakterien. Begleitkeime werden durch hohe Gallensalzkonzentrationen und ggf. Kristallviolett gehemmt. Der Indikator zeigt eine Laktoseverwertung durch einen Farbumschlag nach rot an. Bei stark ausgeprägter Laktoseverwertung erfolgt eine Trübung durch die ausgefällten Gallensalze, was vor allem bei E. coli häufig der Fall ist.
3.
Blut-CNA-Agar
Ein Blut-Agar wird durch die Zugabe von Colistin und Nalidixin-Säure (CNA) selektiv für den Nachweis von G+. Durch den Blutzusatz wachsen die G+ besser und deutlicher als auf CLED-Agar. Cave: Proteus-Arten sind resistent gegen Colistin. Manche sind auch resistent gegen Nalidixinsäure und können dann auch auf Blut-CNA-Agar wachsen.
4.
Sabouraud-G/C-Agar (mit Chloramphenicol und Gentamicin),
benannt nach seinem Erfinder, dem französischen Dermatologen Sabouraud, wird durch die Zugabe von Breitbandantibiotika (Chloramphenicol, Gentamicin) selektiv für Hefen und Pilze. Das Wachstum von Bakterien wird gehemmt. Auch hier kann es in sehr seltenen Fällen vorkommen, dass sehr resistente Bakterien auf dem Medium wachsen.
Zur Beimpfung der Nährmedien wird das Untersuchungsmaterial mit der sterilen Öse aufgenommen und auf die Oberfläche der Agarplatten gebracht. Dann wird das Material ausgestrichen (Abb. 3).
Abb. 3
Urinkultur-Erstanlage
×
Einige Praxislabore verwenden anstatt eines Agarplattensatzes chromogene Nährböden für die Erstanlage der Urinkultur. Diese Medien sind normalerweise nicht selektiv. Durch in dem Medium enthaltene farbgebende Substanzen entwickeln verschiedene Erreger spezifische Farben auf dem Medium und ermöglichen so eine schnelle Identifizierung. Erfahrungsgemäß eigenen sich diese Medien nicht für eine Erstanlage, sondern eher zur Bestätigung der Identifizierung nach der Vereinzelung.
Zur Erstanlage gehört auch der sogenannte Hemmstofftest. Der Test ist eine sinnvolle Methode, um durch die Hemmung eines Referenzerregers (Bacillus subtilis) das Vorhandensein von Hemmstoffen aufzuzeigen. Bei der Durchführung des Hemmstofftests wird ein B. subtilis auf einer Mueller-Hinton Platte flächig ausgestrichen. Je ein Tropfen Patientenurin wird auf die Agarplatte aufgetropft. Besitzt der Urin Hemmwirkung, so bildet sich nach Bebrüten um den Tropfen ein Hemmhof. Mit dem Test auf Hemmstoffe wird überprüft, ob der Patient möglicherweise schon vor der Urinabgabe antimikrobiell wirksame Medikamente erhalten hat. Bei einem positiven Hemmstofftest hat bakterielles Wachstum auf den anderen Platten eine höhere Wertigkeit, da sich die Erreger resistent gegenüber der vorangehenden Therapie erwiesen haben. In diesem Fall müssen auch geringere Keimzahlen (<103/ml) als mögliche Infektion gewertet werden. Der Hemmstofftest kann außerdem eingesetzt werden um zu prüfen, ob der Patient ein verschriebenes Medikament tatsächlich eingenommen hat.
Ablesen der Urinkultur
Nach Übernacht-Bebrütung bei 36 ± 1 °C können die Agarplatten abgelesen werden. Auf der CLED-Platte erfolgt als erstes die Keimzahlbestimmung. Diese ist wichtig, um bei bakteriellem Wachstum zu differenzieren, ob es sich um eine Infektion oder eine Kontamination durch Begleitflora handelt (Tab. 4). Allgemein gilt eine Keimzahl von 105 KBE/ml (Kolonien bildende Einheiten) als signifikant und damit als Indikator für eine Infektion. Früher wurde dieser Maßstab sehr ernst genommen; heute gilt die Keimzahl nur als einer von mehreren Beurteilungsmaßstäben für eine Infektion. In Einzelfällen kann auch bei geringeren Keimzahlen eine klinisch signifikante Infektion vorliegen, wie zum Beispiel bei
Anwesenheit von antimikrobiell wirksamen Substanzen im Urin (positiver Hemmstofftest).
Erregern, die sich im Urin grundsätzlich nicht gut vermehren, z. B. Staphylococcus saprophyticus.
kurzer Verweildauer des Urins in der Harnblase (Probengewinnung zu kurz nach der letzten Miktion, z. B. bei infektbedingter Pollakisurie).
Dilution der Bakterienkonzentration im Urin durch forcierte Diurese/Polyurie.
Biofilmbildung auf Katheteroberflächen, wo die meisten Bakterienzellen adhärent sind und nur wenige planktonisch im Urin schwimmen.
Tab. 4
Bedeutung der Erregerzahl
Erregerzahl/ml
Bedeutung
≥105
signifikante Bakteriurie, asymptomatisch oder aber Harnwegsinfektion (HWI)
≥104
verdächtiger Befund
<104
meist keine Infektion
<103
Kontamination des Urins, in der Regel keine HWI außer bei charakteristischen klinischen und laborchemischen (Leukozyturie) Infektzeichen
Erregerzahlbestimmung
Gemessen wird die Erregerzahl in KBE = Kolonien bildende Einheiten. Eine Kolonie auf der Platte steht dabei für eine KBE im Urin. Gerundet wird immer auf die Zehnerstelle. Um auf KBE/ml zu kommen, muss das auf die Platte aufgebrachte Probenvolumen eingerechnet werden. Bei 100 μl Einsaat muss die Zahl demnach verzehnfacht werden, um auf einen Milliliter zu kommen (= 1000 μl), bei einer Einsaat von 10 μl wird verhundertfacht.
Beispiele:
Kolonien auf Platte
Volumen Einsaat
resultierende Erregerzahl pro ml
ca. 10
100 μl
102
ca. 100
100 μl
103
ca. 1000
100 μl
104
mehrere 10.000
100 μl
105
10
10 μl
103
100
10 μl
104
1000
10 μl
105
10.000
10 μl
106
Da Koloniezahlen von 100 und mehr nicht ausgezählt werden können, wird hier geschätzt oder mit Bildern verglichen (Abb. 4):
Abb. 4
Kolonienzahlen auf Nährplatten
×
Die Erregerzahl wird auf der einen (ersten) Hälfte der CLED-Agarplatte bestimmt. Auf der anderen Hälfte kann die Koloniemorphologie betrachtet und im Ausstrich festgestellt werden, ob es sich um eine Rein- oder eine Mischkultur handelt.
Auf den Selektivmedien wird vor allem das Vorhandensein von Wachstum überprüft. Dadurch kann auch die Großgruppenzugehörigkeit des Erregers eingeschätzt werden.
Wachstum auf:
MacConkey-Agar:
Es sind G− vorhanden, meistens Stäbchen
Blut-CNA-Agar:
Es sind G+ vorhanden, meistens Kokken, sofern kein gleichzeitiges Wachstum auf Sabouraud G/C-Agar festzustellen ist
Sabouraud G/C-Agar:
Es sind Hefen vorhanden
Falls auf mehreren Selektivmedien gleichzeitiges Wachstum vorliegt, handelt es sich vermutlich um eine Mischkultur oder einen sehr resistenten G− Erreger. Vorsicht: Bei Wachstum nur auf MacConkey- oder Blut-CNA-Agar kann ebenfalls eine Mischkultur vorliegen, sofern beide Erreger auf der gleichen Platte wachsen (beide G- oder beide G+). Vor allem Mischkulturen aus G− Erregern können problematisch sein. Wird nur eines der Selektivmedien verwendet (also MacConkey- ODER Blut-CNA-Agar), wird die Mischung oft nicht erkannt und im ungünstigsten Fall der „falsche“, d. h. der unwichtigere oder weniger pathogene Erreger behandelt. Bei Mischkulturen muss entschieden werden, ob es sich um eine Mischinfektion im Urin oder um eine Kontamination durch die Haut- oder Schleimhautflora bei der Probengewinnung oder -verarbeitung handelt. Dabei ist die Erregerzahl entscheidend. So weist beispielsweise das vereinzelte Auftauchen von G+ in einer hochkonzentrierten G- Kultur auf eine Kontamination von der Haut oder Schleimhaut hin.
Neben der Dreiteilung in G+, G− und Hefen kann mit einfachen Mitteln eine weitere Gruppenunterteilung vorgenommen werden. Folgende Differenzierungen bieten sich direkt bei der Ablesung an:
Grampositive: Die G+ Kokken können mit einer einfachen biochemischen Reaktion in Streptokokken und Staphylokokken unterteilt werden. Staphylokokken besitzen ein Enzym (Katalase) welches Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff spaltet. Reibt man eine Kolonie in einen Tropfen 3 %ige Wasserstoffperoxidlösung, so bilden sich bei Staphylokokken demnach Blasen (Schaumbildung), bei Streptokokken hingegen nicht.
Gramnegative: Auf der CLED- und der MacConkey-Platte kann die Verwertung von Laktose am Farbumschlag abgelesen werden. Laktose-verwertende G- gehören normalerweise zu den Coliformen (es gibt Ausnahmen, die aber in der Routinediagnostik kaum eine Rolle spielen).
Die Laktose-negativen G− Erreger können über eine weitere einfache Reaktion in zwei Gruppen unterteilt werden, nämlich die Proteus-Gruppe und die Pseudomonas-Gruppe. Pseudomonas und Verwandte besitzen ein Enzym namens Cytochromoxidase, das auf entsprechenden Teststreifen nachgewiesen werden kann. Proteus und seine Verwandten sind dagegen Oxidase-negativ.
Darüber hinaus können auf den Agarplatten viele offensichtliche Merkmale des Erregers bestimmt werden, welche die weitere Identifizierung erleichtern (Tab. 5). Ergänzend können auch die biochemischen Reaktionen mit der makroskopischen Sichtung verglichen werden. Besteht beispielsweise aufgrund von Glanz und Geruch der Verdacht auf Pseudomonas, so kann dieser durch eine positive Oxidase-Reaktion verifiziert werden.
Tab. 5
Identifizierungsmerkmale von Bakterien und Hefen auf Agarplatten
Merkmal
Deutet hin auf
Bedeutung für die Identifizierung
Gestuftes Wachstum
Terrassenwachstum, „Schwärmen“
Charakteristisch für Proteus-Spezies
„Flatschige“, zerfranste oder sternförmige Kolonien
Motilität der Erreger, die von der Kolonie aus über den Agar kriechen
Klassisches Merkmal von B-Streptokokken, aber auch von S. aureus
Blut-CNA hellt sich auf, mit Grünverfärbung
α-Hämolyse
Typisches Merkmal der Gruppe A-Streptokokken
Starker, unangenehmer Geruch
Ammoniakbildung, Harnspaltung
Klassisch für Proteus-Arten
Auffälliger, nicht unbedingt schlechter Geruch
Geruch nach „Lindenblütentee“
Merkmal von Pseudomonas
Erregeridentifizierung
Nicht zuletzt aus Kostengründen wird der Stellenwert der genauen Erregerdifferenzierung immer wieder in Frage gestellt, da für die Therapie in erster Linie das Antibiogramm entscheidend ist. Dennoch gibt es wichtige Argumente für eine exakte Identifikation der infektionsauslösenden Erreger:
Nach den aktuellen Regelwerken für die Antibiogramm-Erstellung (z. B. EUCAST) muss die Gruppe des Erregers für eine Einstufung der Resistenz bereits bekannt sein.
Die Identifizierung des Erregers ist eine wesentliche Voraussetzung für die Ermittlung der Infektionsquelle (z. B. endogen bei E. coli, exogen bei Pseudomonas) im Einzelfall und bei Ausbruchsituationen.
Die Kenntnis des Erregers hilft den weiteren Verlauf der Infektion abzuschätzen (z. B. leicht chronisch bei Klebsiella, oder mögliche komplizierende Folgen wie Steinbildung bei Proteus).
Bei einer zeitnahen erneut auftretenden Infektion kann aus der Erregeridentifizierung ersehen werden, ob es sich um eine Reinfektion oder eine Neuinfektion handelt.
Die RiliBÄK 2013 schreibt das Führen einer Erregerstatistik vor.
Die Identifizierung eines Erregers gibt Hinweis auf seine Resistenzeigenschaften.
Umgekehrt kann auch das Antibiogramm Aufschluss über die Identität des Erregers geben. Idealerweise sollte die exakte Identifizierung durch einen Abgleich von Erregerdifferenzierung und Antibiogramm erfolgen.
Anhand des Wachstums auf den Selektivplatten und den o. g. biochemischen Reaktionen lassen sich sechs große uropathogene Erregergruppen unterschieden:
Hefen (Wachstum auf Sabouraud-G/C)
Staphylokokken (Wachstum auf Blut-CNA, Katalase-positiv)
Streptokokken (Wachstum auf Blut-CNA, Katalase-negativ)
Coliforme (Wachstum auf MacConkey, Laktose-positiv)
Proteus-Gruppe (Wachstum aus MacConkey, Laktose-negativ, Oxidase-negativ)
Die Coliformen und die Proteus-Gruppe gehören beide zu den Enterobakteriazeen.
Pseudomonas und Verwandte (Wachstum auf MacConkey, Laktose-negativ, Oxidase-positiv)
Das vorstehende Schema hat sich für die Routinedifferenzierung bewährt, bedarf jedoch bei selteneren Erregern wie Acinetobacter, Stenotrophomonas oder grampositiven Stäbchen einer untersuchungstechnischen Weiterung. Nach der ersten vorläufigen Identifizierung wird dazu parallel zum Antibiogramm eine weiterführende Identifizierung angelegt. Hierfür gibt es zahlreiche kommerzielle Systeme, die eine Vielzahl biochemischer Eigenschaften abprüfen. Für die bereits bestimmten Gruppen ist die weitere Vorgehensweise wie folgt:
Hefen bedürfen in der Urologie normalerweise keiner weiteren Identifizierung. Sollte eine solche dennoch gewünscht sein, so kann man auf chromogene Nährmedien zur Bestimmung von Candida-Spezies zurückgreifen. Mittels Agardiffusion kann grundsätzlich auch ein Antimykogramm angelegt werden.
Staphylokokken Traditionell wird bei den Staphylokokken zwischen koagulase-positiven und koagulase-negativen Staphylokokken (s.o.) unterschieden. S. aureus ist koagulase-positiv und koaguliert Fibrinogen in einer durch Schnelltests nachweisbaren Reaktion. So gut wie alle anderen Staphylokokken sind koagulase-negativ. Diese Differenzierung genügt den aktuellen Anforderungen nur bedingt, da S. saprophyticus laut EUCAST im Antibiogramm gesondert beurteilt werden muss. Besser ist es, die genaue Staphylokokken-Spezies mit Hilfe alleinstellender Eigenschaften zu ermitteln:
Mikrokokken:
Sensibel gegen Bacitracin.
S. saprophyticus:
Resistent gegen Novobiocin.
S. aureus:
Mannit-Abbau: Erkennbar auf Mannit-Kochsalz-Platten. Koagulase-positiv. Novobiocin-sensibel.
S. epidermidis:
Wird nach dem Ausschlussprinzip identifiziert: S. epidermidis ist Bacitracin-resistent, Novobiocin-sensibel sowie Koagulase- und Mannit-negativ.
Die Reaktionen können separat z. B. mit Antibiotika-Plättchen und auf Mannit-Kochsalz-Platten durchgeführt werden. Es bieten sich aber auch kommerzielle Systeme an, welche die Reaktionen anwenderfreundlich verbinden. Dabei gibt auch richtige Bunte Reihen mit 10 und mehr Reaktionen für die Staphylokokken.
Streptokokken Mehr als bei anderen Erregern stellt sich bei den Streptokokken die Frage, ob eine weitere Identifizierung notwendig ist. Zumindest die wichtigsten beiden Streptokokken-Gruppen sollten differenziert werden.
B-Streptokokken:
Zeigen eine manchmal nur schwache β-Hämolyse. Eine Identifizierung kann über den so genannten CAMP-Test erfolgen.
Enterokokken können durch ihre Fähigkeit zur Äskulin-Spaltung von anderen Streptokokken unterschieden werden (Swan 1954). Diese Reaktion ist Bestandteil bestimmter bunter Reihen, sie kann aber auch auf entsprechenden Agarplatten ermittelt werden („Enterokokkenplatte“).
Coliforme Die Coliformen gehören wie die Proteus-Spezies zur großen Familie der Enterobakteriazeen. Zur Differenzierung dieser Gruppe bieten verschiedene Hersteller sog. Bunte Reihen an, die über eine Sequenz von 10–20 Reaktionen die allermeisten Spezies identifizieren können. Die auf dem Markt vorhandenen Systeme unterscheiden sich zum Teil stark im Preis, in der Handhabbarkeit und der Qualität der Identifizierung. Bei den bunten Reihen muss berücksichtigt werden, dass es auch atypische Stämme geben kann, die für Ihre Art ungewöhnliche biochemische Reaktionen aufweisen. An solchen „Abweichlern“ scheitern auch Systeme, die ansonsten eine zuverlässige Identifizierung bieten.
Typische in bunten Reihen getestete Reaktionen
Glukose-Abbau
Indol-Produktion
H2S-Produktion
Mannitol-Abbau
Sorbitol-Abbau
Harnstoff-Abbau zu Ammoniak
Ornithin- und Lysin-Abbau
Zitrat-Verwertung
Phenylalanin-Produktion
LANA (L-Alanin Nitroalinid)
Pseudomonas und Verwandte Bei den Pseudomonaden ist eine weitere Identifizierung nicht zwingend erforderlich. Sollte diese jedoch gewünscht ein, gibt es kommerzielle bunte Reihen zur Identifizierung von Nicht-Enterobakteriazeen. Auch automatisierte Systeme können verschiedene Spezies von Nicht-Enterobakteriazeen identifizieren.
Proteus-Gruppe Auch Mitglieder dieser Gruppe werden üblicherweise mit einer Bunten Reihe für Enterobakteriazeen weiter untersucht. Während Proteus-Arten oft gut anhand von charakteristischen Eigenschaften auf der Agarplatte erkannt werden können, ist dies bei Proteus-Verwandten wie Providencia oder Morganella nur schlecht möglich.
Bakteriensystematik
Die Systematik (Taxonomie) der Bakterien ist kompliziert und bisweilen unübersichtlich. Das liegt an der asexuellen Vermehrung von Bakterien durch Zellteilung. Während die meisten Tiere und Pflanzen aufgrund Ihrer geschlechtlichen Vermehrung in Arten unterteilt werden, kann dieses Merkmal bei den sich vegetativ vermehrenden Bakterien nicht angewendet werden. Stattdessen werden traditionell morphologische und biochemische Merkmale zur Klassifizierung genutzt. Heute verwendet man genetische Merkmale zur Gruppeneinteilung. Dies führt immer wieder zu Umbenennungen und neuen Einteilungen und spiegelt den Versuch wieder, eine Systematik zu finden, die auf der biologischen Verwandtschaft der Bakterien gründet.
Antibiogramm
Mit dem Antibiogramm wird im Labor ausgetestet, welche antimikrobiellen Substanzen („Antibiotika“) gegen den nachgewiesenen Erreger wirksam sind. Die gewonnenen in vitro-Ergebnisse sind zum Teil nicht uneingeschränkt auf das lebende System übertragbar, aber es handelt sich in der Regel um eine für die klinische Situation ausreichende Abschätzung. Gerade heute in Zeiten zunehmender Multiresistenzen ist die sorgfältige Erstellung eines Antibiogramms vor Beginn einer rationalen medikamentösen Therapie so wichtig wie noch nie (Gyssens 2011; Pulcini und Gyssens 2013). Für die Durchführung des Antibiogramms werden klassischerweise der Agardiffusionstest und das Dilutionsverfahren verwendet.
Beim Dilutionstest werden zwei Konzentrationen des Antibiotikums auf ihre Hemmwirkung gegen den Erreger getestet. Die Ergebnisse führen zur Resistenzeinstufung (Abb. 5) auf der Basis der Grenzkonzentrationen, Breakpoints genannt. Aus den Breakpoints werden auch die zugehörigen Grenzen für die Hemmhofdurchmesser im Agardiffusionstest ermittelt.
Abb. 5
Breakpoint-Methode: Wachstum bei beiden Konzentrationen heißt, dass auch die maximale Konzentration für eine Hemmung nicht ausreichend ist: der Erreger ist resistent (R). Wachstum bei keiner Konzentration bedeutet, dass auch die niedrige Konzentration schon für eine Wachstumshemmung ausreicht: der Erreger ist sensibel (S). Wachstum bei der minimalen Konzentration, aber nicht bei der maximalen bedeutet, dass die zur Hemmung notwendige Konzentration irgendwo zwischen den beiden Grenzkonzentrationen liegt. Es kann daher nicht abgeschätzt werden, ob eine Therapie erfolgreich sein kann: der Erreger ist intermediär (I), nach EUCAST-Norm: Empfindlich bei erhöhter Konzentration (Increased exposure susceptible). Wachstum bei der höheren Konzentration, aber kein Wachstum bei der niedrigeren Konzentration macht keinen Sinn („Nonsense“ (N)). Dieses Ergebnis weist auf einen Untersuchungsfehler hin
×
Beim Agardiffusionstest (ADT) werden mit einem Antibiotikum beschickte Plättchen auf einer Mueller-Hinton-Agarplatte platziert. Der Wirkstoff diffundiert in den Agar (Agardiffusion) wobei die Konzentration mit zunehmendem Abstand zum Plättchen abnimmt. Dadurch bildet sich ein Konzentrationsgradient um das Plättchen herum aus. Zuvor wurde der auszutestende Erreger flächig auf der Platte ausgestrichen. Beim Bebrüten wachsen die Bakterien an das Plättchen heran bis eine zur Wachstumshemmung ausreichende Konzentration des Antibiotikums vorliegt, so dass ein sog. Hemmhof um das Plättchen herum entsteht. Für jedes Antibiotikum gibt es äußere und innere Soll-Hemmhofgrößen. Liegt der ermittelte Hemmhof außerhalb des äußeren Sollwertes, so ist der Erreger sensibel. Liegt der Hemmhof innerhalb des inneren Sollwertes, so ist der Erreger resistent. Liegt der Hemmhof zwischen der äußeren und inneren Sollwertgrenze, so wird der Erreger als intermediär eingestuft (Anmerkung: in der EUCAST heißt die mittlere Resistenzstufe jetzt nicht mehr „intermediär“, sondern „increased exposure susceptible“). Nach EUCAST sind die Soll-Hemmhofgrößen nicht nur abhängig vom Antibiotikum, sondern auch vom Erreger bzw. der Erregergruppe. Dadurch wird die Beurteilung noch spezifischer als es bisher der Fall war.
Der ADT ist ein abgeleitetes System für die Resistenzbestimmung, da Grenzkonzentrationen in Hemmhofdurchmesser umgerechnet werden müssen. Diese Hemmhofgrenzen haben jedoch nur dann Gültigkeit, wenn die Methode standardisiert eingesetzt wird. Jede Schwankung oder Abweichung verfälscht die Ablesung. Wichtig ist deshalb auch gerade hier die interne Qualitätskontrolle (s.u.). Zu den wichtigsten Fehlerquellen beim ADT gehören:
Dicke der Agarplatten: Bei zu dünnen Agarplatten breitet sich das Antibiotikum mehr zur Seite als nach unten aus und die Hemmhöfe werden zu groß. Bei zu dicken Platten verhält es sich umgekehrt.
Erregerdichte in der Suspension: Bei einer zu hohen Erregerdichte wachsen die Bakterien zu schnell zu sichtbaren Kolonien heran, bevor der Wirkstoffgradient greifen und das Wachstum hemmen kann. Die Hemmhöfe werden kleiner. Bei einer zu dünnen Suspension verhält es sich umgekehrt.
Einwirkzeit bis zur Bebrütung: Verzögert sich der Transfer der Platten in den Brutschrank, dann bildet sich der Konzentrationsgradient zu schnell aus, also noch bevor die Bakterien anfangen zu wachsen. Das Antibiotikum bekommt so einen „Wirkungsvorsprung“ und die Hemmhöfe werden größer.
Die Breakpoints und die Grenzen für die Hemmhofdurchmesser werden experimentell ermittelt und in Form von Normen veröffentlicht. Zu den entsprechenden Grenzwerten gehört dann auch immer eine Anleitung für die korrekte Anlage des Antibiogramms. Werden die normierten Grenzwerte in der Praxis verwendet, so muss auch das zugehörige Regelwerk genutzt werden. Die in Europa am häufigsten verwendete Norm ist die EUCAST-Norm (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Alternativ kann auch die CLSI-Norm (Clinical Laboratory Institute) verwendet werden. In beiden Normen gibt es nicht mehr für alle Antibiotika-Austestungen zwei verschiedene Grenzwerte: häufig wird nur ein Wert herangezogen. In solchen Fällen entfällt die mittlere Austestung (Intermediär/Increased Exposure Susceptible)
Das Antibiogramm überprüft die in vitro-Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen gegen einen nachgewiesenen Erreger. Die endgültige Auswahl des Antibiotikums basiert dann auf der individuellen klinischen Konstellation eines jeden Patienten und den einschlägigen Richtlinien und Therapieempfehlungen (z. B. S3-Leitlinie „Unkomplizierte Harnwegsinfektionen“ AWMF 043/044 (2010); Stiefelhagen 2012). Die Notwendigkeit und Art der antimikrobiellen Therapie wird letztlich vom Arzt nach klinischen Kriterien und nicht allein durch eine positive Urinkultur bestimmt: demnach ist eine asymptomatische Bakteriurie grundsätzlich kein Anlass für eine Behandlung.
Für die internen Qualitätskontrollen enthält die Rili-BÄK Vorgaben in Tabellen und Listen, welche Untersuchungsmethoden mit welcher Frequenz zu testen sind. Grundsätzlich unterliegen alle Verfahren der Qualitätskontrolle und unterscheiden sich im Wesentlichen durch die Intervalle der Überprüfung. Alle Überprüfungen sind zu protokollieren und die Prüfprotokolle über 5 Jahre aufzubewahren.
Unabdingbar für die internen Qualitätskontrollen sind definierte Kontrollstämme (Referenzkulturen), die im Labor vorliegen müssen. Nur wer bekannte Erreger mit bekannten Resistenzeigenschaften testet, kann auf diese Weise seine Methodik validieren. Die Rili-BÄK schreibt die Verwendung von Kontrollstämmen vor, ohne diese zu spezifizieren. Folgende vier Stämme haben sich in der Urinmikrobiologie bewährt:
E. coli
DSMZ 1103 (identisch mit ATCC 25922)
S. aureus
DSMZ 2569 (identisch mit ATCC 29213)
P. aeruginosa
DSMZ 1117 (identisch mit ATCC 27853)
E. faecalis
DSMZ 2570 (identisch mit ATCC 29212)
Die Kontrollstämme können auf Platten gehalten werden, wobei sie jede Woche einmal neu überimpft werden müssen. Nach viermaligem Überimpfen (also einmal im Monat) muss der Kontrollstamm neu aus einer Kryokultur angezüchtet (oder aber neu erworben) werden.
Zur externen Qualitätssicherung sind die sogenannten Ringversuche vorgeschrieben. Unabhängig von den verschiedenen Zulassungs- oder Abrechnungsmodalitäten ist die Teilnahme an einem Ringversuch für alle Laboreinrichtungen verpflichtend, wenn sie die entsprechenden Untersuchungsmethoden vorhalten. Neben dem Ringversuch Bakteriologie B für Identifizierung und Antibiogramm gibt es heute auch Ringversuche für die Gramfärbung und das Urinsediment. Die Ringversuche werden von zwei qualifizierten Instituten (Referenzinstitute) angeboten, namentlich der Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e. V. (INSTAND; www.instandev.de) und dem Referenzinstitut für Bioanalytik (RfB; www.dgkl-rfb.de).
Zukunft der Urinmikrobiologie
Technische Neuerungen
In den letzten Jahren werden für die Arbeit im Labor verstärkt automatisierte Systeme angeboten. Diese Großgeräte bieten eine exakte Erregeridentifizierung und ein umfassendes Antibiogramm an, ohne dass eine Beurteilung durch den Untersuchenden erfolgen muss. Die eigentliche, manuelle Laborarbeit beschränkt sich damit auf das Gewinnen einer Reinkultur. Die Geräte sind fachlich sehr hochwertig, exakt und bedienerfreundlich, häufig aber noch sehr kostenintensiv. Eine Anschaffung sollte vorher gut kalkuliert werden. Zudem besteht die latente Gefahr, dass sich der Urologe zu sehr auf die Expertise des Gerätes verlässt. Die automatisierte Identifizierung kann das medizinische Fachwissen im klinischen Kontext nur ergänzen und unterstützen, aber nicht ersetzen.
Vorteile automatisierter Systeme
Verkürzung der Analysezeiten durch die fotometrische Ablesung der Ergebnisse.
Identifikation eines breiten, praktisch lückenlosen Spektrums an Erregern, was mit den herkömmlichen bunten Reihen nur schwer zu erreichen ist.
Gleichzeitiges Austesten einer großen Bandbreite von Antibiotika.
Erstellung einer fortlaufenden Erreger- und Resistenz-Statistik durch digitale Auswertung.
Automatischer Abgleich von Identifizierungsergebnis und Antibiogramm.
Häufig ist eine direkte Anbindung an die Praxissoftware möglich, so dass auf eine handschriftliche Zwischendokumentation verzichtet werden kann.
Der Anwender kann sich zwischen sogenannten Halbautomaten und Vollautomaten entscheiden. Vollautomaten übernehmen normalerweise alle Arbeitsschritte, nachdem die Reinkultur gewonnen wurde, also Beimpfen, Bebrüten und Ablesen der Systeme für Antibiogramm und Identifizierung. Halbautomaten übernehmen vornehmlich den Schritt der Ablesung der photometrisch durchgeführt wird. Die Halbautomaten sind im Gegenzug gewöhnlich kostengünstiger in Anschaffung und Unterhalt.
Suche nach Antibiotika-Alternativen
Die Bedeutung multiresistenter Erreger wird immer wichtiger in der Medizin und insbesondere bei Harnwegsinfektionen in der Urologie (Foxman und Buxton 2013). Die Entwicklung neuer antimikrobieller Substanzen kann hier kaum schritthalten. Daher wird fieberhaft nach Behandlungsalternativen zur klassischen Antibiotikatherapie gesucht (Barber et al. 2013). In Erwägung gezogen wird hierbei die Verwendung von Bakteriophagen zur Bekämpfung von pathogenen Bakterien oder die Entwicklung von Substanzen, welche die bakterielle Kommunikation im Körper und damit die Manifestation von Pathogenitätsfaktoren verhindern (Harjai et al. 2010). Ein weiterer Ansatz ist die Immunstimulation zellulärer Erregerbestandteile. Auch pflanzliche Wirkstoffe erhalten zunehmend mehr Beachtung, wie beispielsweise die Wirkung von Cranberry-Produkten auf die Adhärenz und Beweglichkeit von E. coli-Bakterien (Di et al. 2006; Albrecht et al. 2007; Chung et al. 2012; Hidalgo et al. 2011). Inwiefern diese neuen Therapieansätze Eingang in die Resistenztestung finden werden, bleibt abzuwarten.
Zusammenfassung
Urogenitale Infektionen haben eine herausragende individuelle und sozio-ökonomische Bedeutung in der Medizin und speziell im Fachbereich der Urologie.
Bakterielle Erreger können in Gramnegative (G−) und Grampositive (G+) eingeteilt werden. Die G− Bakterien stammen meist aus dem Darm, in seltenen Fällen auch aus der Umwelt. G+ Bakterien stammen meist von der Hautoberfläche, in seltenen Fällen auch aus dem Darm (z. B. Enterokokken) oder aus der Umwelt.
Durch die Anlage von Patientenurin auf einem Satz Agarplatten kann das Vorhandensein von Bakterien im Harn erkannt und das Vorliegen einer Infektion beurteilt werden.
Im Falle einer Infektion dienen Selektivplatten und bestimmte Einzelreaktionen der Einteilung der Erreger in verschiedene Übergruppen.
Zur weiteren Identifizierung werden Identifizierungssysteme und bunte Reihen verwendet, die anhand der biochemischen Eigenschaften eines Erregers die Gattung oder Spezies desselben angeben können.
Die Identifizierung eines Erregers ist bedeutsam für die Abschätzung der Herkunft der Infektion und des mutmaßlichen weiteren Verlaufs. Sie ist außerdem eine notwendige Voraussetzung für die sachgemäße Durchführung des Antibiogramms.
Das Antibiogramm kann mittels Agardiffusionstest oder verschiedenen Dilutionssystemverfahren durchgeführt werden. Für Letztere gibt es auch automatisierte Systeme.
Es bildet die Grundlage für eine testgerechte antimikrobielle Behandlung (Syn.: antimiokrobielle Chemotherapie, „Antibiose“), deren Notwendigkeit und Art der Durchführung der klinisch-fachlichen Beurteilung des Urologen/Arztes obliegt.
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