Der immunfluoreszenzoptische Nachweis von Autoantikörpern hat für die Diagnostik blasenbildender Autoimmunerkrankungen eine zentrale Bedeutung. Auch bei anderen Erkrankungen, wie Epidermolysis bullosa hereditaria, Lupus erythematodes, leukozytoklastischer Vaskulitis und dem Lichen ruber stellt die Immunfluoreszenzmikroskopie einen wichtigen diagnostischen Baustein dar.
Der immunfluoreszenzoptische Nachweis von Autoantikörpern hat für die Diagnostik blasenbildender Autoimmunerkrankungen eine zentrale Bedeutung. Auch bei anderen Erkrankungen, wie Epidermolysis bullosa hereditaria, Lupus erythematodes, leukozytoklastischer Vaskulitis und dem Lichen ruber stellt die Immunfluoreszenzmikroskopie einen wichtigen diagnostischen Baustein dar.
Unter Verwendung der Immunfluoreszenztechnik werden Antigene, Antikörper, Komplementfaktoren oder Fibrin mittels spezifisch bindender fluoreszenzmarkierter Antikörper mikroskopisch sichtbar gemacht. Man unterscheidet die direkte von der indirekten Immunfluoreszenz (IF)
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Direkte Immunfluoreszenz
Bei der direkten IF werden gewebegebundene Antikörper, Komplementfaktoren oder Fibrin in einer Haut- oder Schleimhautbiopsie oder einem Abstrich des Patienten nachgewiesen. Ganz entscheidend für die Aussagekraft der Untersuchung ist die Biopsieentnahmestelle. Bei blasenbildenden Autoimmundermatosen sollte periläsionale Haut, also gesund erscheinende Haut in unmittelbarer Umgebung einer frischen Blase, biopsiert werden. Bei diesen Erkrankungen ist läsionale Haut nicht geeignet, da im Bereich der Blase die Immunglobulinablagerungen durch Entzündungszellen abgebaut werden können (falsch negatives Ergebnis) oder unspezifisch an die Blasendecke oder Blasenboden binden, so dass falsch positive Ergebnisse resultieren können. Bei allen anderen Indikationen sollte die Probe direkt (läsional) aus einer möglichst frischen Läsion entnommen werden. Bei der Epidermolysis bullosa hereditaria ist zu beachten, dass neben einer frischen spontanen oder frisch induzierten Blase auch ein Stückchen normale Haut mit entnommen wird, damit die Blasendecke auch nach der Prozessierung noch in loco vorliegt.
Für die direkte IF ist eine Stanzbiopsie mit einem Durchmesser von 4 mm ausreichend. Diese kann in isotoner Kochsalzlösung oder in modifiziertem Michel Medium für bis zu 96 h bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahrt werden. Alternativ kann die native Biopsie für einige Tage bei −20 °C gelagert werden oder praktisch unbegrenzt in flüssigem Stickstoff.
Von den unfixierten, gefrorenen Biopsien werden dann 6 μm dicke Kyroschnitte angefertigt. Diese werden über Nacht im Kühlschrank getrocknet, 10 min in 95 % Ethanol oder Aceton fixiert und dann erneut getrocknet. Die Schnitte werden mit dem jeweiligen fluoreszenzmarkierten Konjugat (Anti-IgG, Anti-IgM, Anti-IgA, Anti-C3 und Anti-Fibrinogen) in der entsprechenden Verdünnung überschichtet und im Dunkeln in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 45 min inkubiert. Anschließend wird ungebundenes Konjugat durch Waschen mit einem Phosphatpuffer entfernt. Die Präparate werden mit Glyzerinmedium eingedeckt, bei Dunkelheit und im Kühlschrank bleibt die Fluoreszenz für mindestens 2 Tage erhalten. Bestimmte Eindeckmedien ermöglichen eine längere Ausbleichzeit. Die Auswertung erfolgt durch Betrachtung an einem Durchlicht Fluoreszenzmikroskop mit geeignetem Filtersystem. Neben der Epidermis/dem Epithel werden die dermo-epidermale Junktionszone (DEJ) sowie die Blutgefäße des Koriums analysiert.
Indirekte Immunfluoreszenz
Mit Hilfe der indirekten IF können zirkulierende Autoantikörper im Patientenserum untersucht werden. Hierzu kommen verschiedene Substrate, meist Organschnitte oder antigenreiche Zellen, zum Einsatz. Die fixierten Substrate werden mit dem verdünnten Patientenserum (initiale Verdünnung in der Regel 1:10) in einer feuchten Kammer bei 37 °C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit Phosphatpuffer wird mit fluoreszenzkonjugiertem Anti-IgG oder Anti-IgA für 30 min bei Dunkelheit ebenfalls in einer feuchten Kammer bei 37 °C inkubiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und mit Glyzerinmedium eingedeckt.
Epidermolysis bullosa hereditaria
Mit Hilfe des Antigen- oder Immunomapping lassen sich an Hand einer vom Patienten entnommenen Hautbiopsie zwei Aussagen treffen. Zum einen kann die Höhe der Spaltbildung (suprabasal, Lamina lucida, Sublamina densa) und somit der Untertyp der hereditären Epidermolysis bullosa bestimmt werden (simplex, junctionalis, dystrophicans; Tab. 1). Hierfür ist es notwendig, dass eine frische Blase biopsiert wird.
Tab. 1
Immunomapping einer läsionalen Probebiopsie bei Epidermolysis bullosa hereditaria
Zum anderen weist eine reduzierte oder fehlende Bindung nach Inkubation mit Antikörpern gegen das jeweilig betroffene Strukturprotein (Keratin-5, Keratin-14, Plakophilin-1, Desmoplakin I/II, Plektin, Kollagen XVII, α6β4 Integrin, Laminin 332, Kollagen VII, Kindlin-1) auf das jeweils betroffene Gen hin.
Für diese Untersuchung empfiehlt es sich, möglichst monoklonale Antikörper zu verwenden. Geeignete Antikörper sind auf der Homepage der Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association (www.debra-international.org) aufgelistet. Als Positivkontrolle sollte jeweils ein Schnitt normaler Haut mitgeführt werden. Das Antigen-/Immunomapping ist wichtig für die Eingrenzung des betroffenen Strukturproteins und Basis für die anschließende molekulare Diagnostik.
Pemphiguserkrankungen
Der Pemphigus ist durch Bindung von Autoantikörpern gegen Strukturproteine der epidermalen und hautnahen mukosalen Desmosomen und den nachfolgenden Verlust des intraepithelialen Zell-Zell Kontakts charakterisiert (Tab. 2). Histologisch imponiert eine intraepidermale Spaltbildung sowie Akantholyse. Der Pemphigus umfasst 4 Hauptformen: Pemphigus vulgaris, Pemphigus foliaceus, IgA Pemphigus und paraneoplastischen Pemphigus (Tab. 2).
Tab. 2
Typische Befunde der direkten Immunfluoreszenz beim Pemphigus
Erkrankung
Direkte Immunfluoreszenz
Pemphigus vulgaris
Interzellulär IgG/C3
Pemphigus foliaceus
Interzellulär IgG/C3, besonders im oberen Teil der Epidermis
IgA Pemphigus
Interzellulär IgA
Paraneoplastischer Pemphigus
In 50 % negativ;
Interzellulär IgG/C3, besonders im unteren Teil der Epidermis; zusätzlich lineare IgG/C3 an DEJ möglich
Direkte Immunfluoreszenz
Alle Patienten mit Pemphigus vulgaris zeigen in der direkten IF einer periläsionalen Biopsie interzelluläre Ablagerungen von IgG in der Epidermis bzw. dem Epithel (Abb. 1). In etwa 50 % der Fälle finden sich zusätzlich Ablagerungen von C3 mit dem gleichen Muster. Patienten mit ausschließlicher Schleimhautbeteiligung weisen in aller Regel Autoantikörper nur gegen Desmoglein 3 auf. Da Desmoglein 3 überwiegend von basalen Keratinozyten exprimiert wird, sind bei diesen Patienten die IgG/C3-Ablagerungen überwiegend in den basalen Anteilen der Epidermis lokalisiert (Abb. 1). In der Mundschleimhaut sind die interzellulären Präzipitate auf Grund der differenten Expression von Desmoglein 3 im gesamten Epithel zu finden. Bei der mukokutanen Form des Pemphigus vulgaris lassen sich Autoantikörper sowohl gegen Desmoglein 3 als auch Desmoglein 1 nachweisen; in der direkten IF finden sich die IgG/C3-Ablagerungen in allen Schichten von Epidermis/Epithel.
Abb. 1
Pemphigus vulgaris – interzelluläre Ablagerung von IgG im unteren Teil der Epidermis in der direkten Immunfluoreszenz einer periläsionalen Biopsie
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Beim Pemphigus foliaceus richten sich die Autoantikörper ausschließlich gegen Desmoglein 1, die Läsionen sind auf die verhornende Haut beschränkt. In der direkten IF finden sich die interzellulären IgG-Ablagerungen überwiegend in den oberen Schichten der Epidermis (Abb. 2). Eine sichere Unterscheidung zwischen Pemphigus vulgaris und Pemphigus foliaceus mittels direkter IF ist jedoch nicht möglich.
Abb. 2
Pemphigus foliaceus – interzelluläre Ablagerung von IgG im oberen Teil der Epidermis in der direkten Immunfluoreszenz einer periläsionalen Biopsie; in der unteren Epidermis hier zusätzlich granuläre IgG Präzipitate
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Der Pemphigus erythematodes gilt als Variante des Pemphigus foliaceus mit Prädilektion des Gesichts und Oberkörpers. Immunfluoreszenzoptisch finden sich neben interzellulären Ablagerungen auch granuläre und bandförmige Präzipitate von IgG und C3 an der DEJ. Diese dem Lupus-Band ähnelnden Ablagerungen werden heute als UV-induzierte Immunkomplexe aus Desmoglein 1 und Anti-Desmoglein 1 IgG interpretiert. Eine Assoziation mit einem systemischen Lupus erythematodes findet sich nur bei einer Minderheit von Patienten mit Pemphigus erythematosus.
Übersicht 1. Erkrankungen mit granulären und/oder bandförmigen Ablagerungen von Immunglobulinen an der dermo-epidermalen Junktionszone1
Beim IgA-Pemphigus werden klinisch und immunpathologisch 2 Formen unterschieden. Bei der intraepidermalen neutrophilen IgA-Dermatose (IEN-Typ) sind die interzellulären IgA-Ablagerungen in der gesamten Epidermis lokalisiert. Beim IgA Pemphigus unter dem Bild einer subcornealen pustulösen Dermatose (SPD-Typ) ist interzelluäres IgA auf die oberen Schichten der Epidermis beschränkt.
Der paraneoplastische Pemphigus ist obligat mit einer Neoplasie assoziiert, häufig mit einem hämatologischen Malignom. In der direkten IF findet sich das typische Pemphigusmuster mit interzellulären Ablagerungen von IgG/C3 am Epithel. Zusätzlich können lineare Ablagerungen von IgG und/oder C3 an der DEJ imponieren, welche eine Reaktivität mit BP230 widerspiegeln (Abb. 3). In etwa der Hälfte der Fälle, besonders bei den lichenoiden Varianten, ist die direkte IF jedoch negativ.
Abb. 3
Paraneoplastischer Pemphigus – Ablagerungen von IgG interzellulär im unteren Teil der Epidermis sowie linear an der dermo-epidermalen Junktionszone in der direkten Immunfluoreszenz periläsionaler Haut
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Serologie
Das sensitivste Substrat zum Screening von Serumantikörpern beim Pemphigus vulgaris in der indirekten IF ist Affenösophagus und beim Pemphigus foliaceus Meerschweinchenösophagus. Hiermit lassen sich bei 95 % der Pemphiguspatienten IgG-Autoantikörper nachweisen (Abb. 4).
Abb. 4
Indirekte Immunfluoreszenz auf Affenösophagus; Nachweis von IgG interzellulär am Epithel: dieses Muster sieht man sowohl beim Pemphigus vulgaris als auch beim Pemphigus foliaceus
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Beim IgA-Pemphigus enthalten 50 % der Seren IgA-Autoantikörper, die am Epithel des Affenösophagus in der indirekten IF binden. Das sensitivste Substrat zum Screening von zirkulierenden Autoantikörpern beim paraneoplastischen Pemphigus ist neben Affenösophagus Harnblasenepithel von Maus, Affe (Abb. 5) oder Ratte (Abb. 6).
Abb. 5
Indirekte Immunfluoreszenz auf Affenblase; Nachweis von IgG-Serumautoantikörpern eines Patienten mit paraneoplastischem Pemphigus, die am Übergangsepithel binden
Abb. 6
Indirekte Immunfluoreszenz auf Rattenblase. Nachweis von IgG-Serumautoantikörpern gegen Urothel bei paraneoplastischem Pemphigus. a
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Im Urothel werden Plakine (Envoplakin, Periplakin, Desmoplakin I/II, Plektin) stark exprimiert, die neben Desmoglein 3 Zielantigene des paraneoplastischen Pemphigus sind (Tab. 3). Mittlerweile gibt es verschiedene sensitive und spezifische monospezifische Testsysteme unter Verwendung rekombinanter Formen der Zielantigene, die bei der ganz überwiegenden Mehrheit der Patienten mit passendem klinischen Krankheitsbild eine serologische Diagnose erlauben. Die Zielantigene der Pemphiguserkrankungen und die verfügbaren monospezifischen Testsysteme sind in Tab. 3 dargestellt.
Tab. 3
Autoantikörper und serologische Diagnostik des Pemphigus
Seit Kurzem ist ein IF-Test verfügbar, mit dem auf einem Standardobjektträger 10 verschiedene Seren in einem Ansatz auf die zentralen Serumautoantikörper bei Pemphigus vulgaris/foliaceus und Pemphigoiderkrankungen untersucht werden können (Abb. 7).
Abb. 7
BIOCHIP Mosaik; simultane Detektion von Serumautoantikörpern gegen verschiedene Zielantigene von Pemphigus- und Pemphigoiderkrankungen in einem Inkubationsfeld von 5 × 5 mm. Die affinitätsgereinigte immunodominante Region von BP180 wurde als Protein auf die Glasoberfläche aufgetragen, die immundominanten Regionen der anderen Zielantigene wurde auf der Oberfläche von humanen HEK293-Zellen exprimiert. Mit freundlicher Genehmigung der Firma Euroimmun AG, Lübeck
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Pemphigoiderkrankungen
Pemphigoiderkrankung sind immunpathologisch durch Autoantikörper gegen Strukturproteine der DEJ gekennzeichnet (Abb. 8 ).
Abb. 8
Schematische Darstellung der dermo-epidermalen Junktionszone: Nur Zielantigene von Pemphigoiderkrankungen sind gezeigt. Mod. nach Schmidt und Zillikens 2013
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Histologisch zeigt sich typischer Weise eine subepidermale Spaltbildung. Bei den meisten Pemphigoiderkrankungen sind die Zielantigene mittlerweile auf molekularer Ebene identifiziert worden (Abb. 8 und 4). Unter Verwendung einer rekombinanten Form dieser Zielantigene oder deren immundominanter Regionen wurden in der Folge verschiedene serologische Testsysteme entwickelt, die zum Teil auch kommerziell erhältlich sind (Tab. 4).
Tab. 4
Autoantikörper und serologische Diagnostik der subepidermal blasenbildenden Autoimmundermatosen
Erkrankung
Zielantigen1 und kommerzielle Assays2
Für die Diagnosestellung wichtige klinische Zeichen
Bullöses Pemphigoid
BP180 NC16A, BP230
Keine überwiegende Schleimhautbeteiligung
Pemphigoid gestationis
BP180 NC16A, BP230
Gravität oder post partal Periode
Lineare IgA Dermatose
LAD-1, BP230 (IgA reactivity)
Keine überwiegende Schleimhautbeteiligung
Schleimhaut-pemphigoid
BP180, Laminin 332, BP230, α6β4 Integrin
Überwiegend Schleimhautbeteiligung
Vernarbendes Pemphigoid
Kollagen VII, BP180, Laminin 332, BP230
Keine überwiegende Schleimhautbeteiligung, narbige Abheilung der Hautläsionen
LAD-1 lineare IgA Dermatose-Antigen 1 (entspricht der löslichen Ektodomäne von BP180)
Direkte Immunfluoreszenz
Allen Patienten mit Pemphigoiderkrankungen ist die lineare Ablagerung von Immunglobulinen und meist auch von C3 an der DEJ gemeinsam (Abb. 9a). Gehören die linearen Immunoglobulinablagerungen überwiegend zum IgA Isotyp, liegt eine lineare IgA Dermatose vor. Bei allen anderen Pemphigoiderkrankungen überwiegen IgG Ablagerungen. Hierbei gibt es klassifikatorische Überschneidungen der linearen IgA Dermatose mit dem Schleimhautpemphigoid (bei Patienten mit überwiegend Schleimhautbeteiligung und überwiegend IgA Ablagerungen) sowie mit der Epidermolysis bullosa acquisita (bei Nachweis von überwiegend IgA Antikörper gegen Kollagen VII).
Abb. 9
n- und u-Muster der direkten Immunfluoreszenz (IF) bei Pemphigoiderkrankungen: die direkt IF zeigt bei allen Pemphigoiderkrankungen lineare Immunglobulin- und/oder C3-Ablagerungen an der dermo-epidermalen Junktionszone. a Bullöses Pemphigoid, b bei höherer Vergrößerung zeigt sich ein n-Muster mit oben geschlossenen Bögen, c oder ein u-Muster mit oben offenen Bögen, ein u-Muster findet sich ausschließlich bei Reaktivität mit Kollagen VII
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Bei höherer Vergrößerung (600fach) erscheinen die Immunoglobulinpräzipitate häufig nicht mehr linear, sondern gewellt. Es lassen sich zwei Bindungsmuster unterscheiden: Beim „n-Muster“
zeigen sich nach oben geschlossene Bögen sowie auch häufig unten geschlossene Bögen (Abb. 9b). Beim „u-Muster“ sind die Bögen immer unten geschlossen und oben offen; das Muster ähnelt nebeneinander stehenden Grashalmen (Abb. 9c). Ein u-Muster findet sich ausschließlich bei Reaktivität mit Kollagen VII, also Epidermolysis bullosa acquisita, bullösem systemischen Lupus erythematodes und einigen Patienten mit vernarbendem Pemphigoid (s. unten). Dieses ist von besonderer Bedeutung, da bei der Epidermolysis bullosa acquisita nur in ca. 50 % der Fälle Serumautoantikörper nachweisbar sind.
Eine weitere Unterscheidungsmöglichkeit zwischen den verschiedenen Pemphigoiderkrankungen mittels direkter IF besteht durch die Inkubation der Biopsie in 1 M NaCl-Lösung, wodurch ein künstlicher Spalt innerhalb der Lamina lucida der DEJ induziert wird. Die Autoantikörper lassen sich dann entweder im Dach oder am Boden des artifiziellen Spalts lokalisieren. Das Bindungsmuster entspricht dem der indirekten IF auf humaner Spalthaut (Abb. 10).
Abb. 10
Indirekte Immunfluoreszenz auf 1 M NaCl-separierter humaner Haut; humane Spalthaut ist das sensitivste Substrat zum Screening von Serumautoantikörpern bei Pemphigoiderkrankungen; abhängig vom Zielantigen binden die Autoantikörper im Dach (links) oder am Boden des artifiziellen Spaltes (rechts)
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Bei allen Pemphigoiderkrankungen kann man gelegentlich lineare IgM Ablagerungen an der DEJ beobachten. Die genauen Befunde der direkten IF der Pemphigoiderkrankungen sind in Tab. 5 aufgeführt.
Tab. 5
Typische Befunde der direkten Immunfluoreszenz bei subepidermal blasenbildenden Autoimmundermatosen
Erkrankung
Direkte Immunfluoreszenz
Bullöses Pemphigoid
linear an DEJ: C3 (100 %), IgG (80–90 %), zusätzlich IgA, IgE, oder IgM (10–20 %); n-Muster
Pemphigoid gestationis
linear an DEJ: C3 (100 %), IgG (25 %), zusätzlich IgA oder IgM (gelegentlich); n-Muster
Lineare IgA Dermatose
linear an DEJ: IgA (100 %), zusätzlich IgG (15–20 %), C3 (10 %) oder IgM (10 %); n-Muster. Bei Antikörpern gegen Kollagen VII (IgA EBA), u-Muster
Schleimhautpemphigoid
linear an DEJ: C3 und/oder IgG (90–100 %), zusätzlich IgA oder IgM (gelegentlich); n-Muster
Vernarbendes Pemphigoid
linear an DEJ: C3 und/oder IgG (90–100 %); n-Muster. Bei Antikörpern gegen Kollagen VII, u-Muster
Lichen planus pemphigoides
linear an DEJ: C3 und/oder IgG (90–100 %); n-Muster
Anti-p200/Laminin γ1 Pemphigoid
linear an DEJ: C3 und/oder IgG (90–100 %); zusätzlich IgA (gelegentlich); n-Muster
linear an DEJ: IgG (40 %); granulär-bandförmig an DEJ: IgG (60 %); zusätzlich linear oder granulär IgA, IgM, C3 (70–80 %); Typ I BSLE: u-Muster; Typ II BSLE: n-Muster
Das sensitivste Substrat zum Screening von Serumautoantikörpern bei Pemphigoiderkrankungen ist die indirekte IF auf humaner Spalthaut. Alternativ kann auch Affenösophagus verwendet werden (Abb. 11). Hier liegt die Sensitivität für das bullöse Pemphigoid lediglich bei etwa 70 % im Vergleich zu ca. 90 % bei der Spalthaut.
Abb. 11
Indirekte Immunfluoreszenz auf Affenösophagus; lineare Binding von IgG an der dermo-epidermalen Junktionszone bei einem Patienten mit bullösem Pemphigoid; bei den Pemphigoiderkrankungen ist dieses Substrat weniger sensitiv und aussagekräftig als humane Spalthaut
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Beim Pemphigoid gestationis gehören die Autoantikörper vor allen der IgG1 und der IgG3 Subklasse an, was die starke Komplementaktivierung an der DEJ erklärt (Tab. 5). Diese komplementaktivierende Eigenschaft der Autoantikörper macht man sich beim sogenannten Herpes-gestationis-Test zu Nutze (Abb. 12). Dieser Test ist ein indirekter Komplementfixations-IF-Assay, bei dem normale humane Haut oder humane Spalthaut verwendet werden. Nach Inkubation der fixierten Organschnitte mit dem Patientenserum und Waschen mit Phosphatpuffer wird mit einer Komplementquelle (normales humanes Serum) für 30 min inkubiert, gewaschen und schließlich 30 min mit fluoreszenzmarkiertem Anti-C3-Antikörper im Dunkeln beschichtet. Während die Sensitivität der indirekten IF auf Spalthaut nur 25 % ist, liegt sie im Herpes-gestationis-Test bei 90 %.
Abb. 12
Herpes-gestationis-Test auf 1 M NaCl-separierter humaner Haut; Ablagerungen von C3 am Dach des artifiziellen Spaltes
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Wie beim Pemphigus kann bei Verwendung rekombinanter Formen der Zielantigene oder deren immundominanter Regionen in monospezifischen Testsystemen (ELISA oder IF-Tests) und passendem Krankheitsbild auch bei den Pemphigoiderkrankungen in der großen Mehrheit der Fälle die Diagnose auf Grund der serologischen Befunde gestellt werden. Ein seit Kurzem verfügbarer Screeningtest für die häufigsten Pemphigus- und Pemphigoiderkrankungen erlaubt die simultane Analyse von Serumautoantikörpern gegen verschiedene Substrate (Affenösophagus, Spalthaut, Desmoglein 1 und 3, BP180 NC16A, BP230) in einem einzigen Inkubationsfeld (Biochip-Mosaik Assay; Abb. 7). Die kommerziell verfügbaren Assays sind in (Tab. 4) aufgeführt.
Beim bullösen Pemphigoid lassen sich bei 80–90 % der Patienten zirkulierende IgG-Autoantikörper gegen den extrazellulären Anteil der 16. nicht-kollagenen Domäne von BP180 (Kollagen XVII) nachweisen. 50–60 % der Patientenseren enthalten zudem Anti-BP230-IgG-Antikörper. Durch den kombinierten Einsatz von BP180 NC16A und BP230 ELISA-Systemen liegt die diagnostische Sensitivität bei 90–95 %. 50–70 % der Patienten mit bullösem Pemphigoid weisen zusätzlich IgE oder IgA Antikörper gegen BP180 auf.
Beim Pemphigoid gestationis reagieren 90 % der Seren mit BP180 NC16A im ELISA. In 5–10 % der Seren finden sich zusätzlich IgG Antikörper gegen BP230.
Die lineare IgA Dermatose ist immunpathologisch durch IgA-Autoantikörper gegen die DEJ charakterisiert. Die IgA Reaktivität ist dabei vor allem gegen Epitope auf der löslichen Ektodomäne von BP180 außerhalb der NC16A Domäne gerichtet. Der Autoantikörpernachweis gelingt im Immunoblot unter Verwendung von Überstand kultivierter humaner Keratinozyten oder im ELISA unter Verwendung der rekombinanten Ektodomäne von BP180.
Für die Diagnose eines Schleimhautpemphigoids ist die überwiegende Schleimhautbeteiligung essentielles klinisches Merkmal. Sechs verschiedene Zielantigene wurden beschrieben: BP180 (bei 75 % der Patienten), BP230 (bei 25 %; gewöhnlich in Kombination mit Anti-BP180 Antikörpern), Laminin 332 (früher auch Laminin 5 oder Epiligrin genannt; bei 25 %), die beiden Ketten von α6β4 Integrin, sowie Kollagen VII. Im Gegensatz zum bullösen Pemphigoid wird die NC16A Domäne nur in ca. 50 % der BP180-reaktiven Seren erkannt. Laminin 332-Reaktivität ist bei etwa einem Drittel der Patienten mit einem soliden Malignom assoziiert. Daher wird beim Schleimhautpemphigoid die Untersuchung auf Anti-Laminin 332 Antikörper und bei Reaktivität eine Tumorsuche dringend empfohlen.
Das vernarbende Pemphigoid wurde in einer internationalen Konsensuskonferenz als Pemphigoiderkrankung definiert, die nicht überwiegend mit Schleimhautbeteiligung einhergeht und bei der die Hautveränderungen narbig abheilen. Eine klinische Unterform des vernarbenden Pemphigoids ist das Brunsting-Perry-Pemphigoid, das durch subepidermale Blasen, Erosionen und atrophe Narben in der Kopf-Nacken-Region ohne Schleimhautbeteiligung charakterisiert ist. Als Zielantigene wurden vor allem Kollagen VII, aber auch BP180, BP230, Laminin 332 und Desmoplakin beschrieben.
Der Lichen planus pemphigoides ist klinisch durch pralle Blasen auch außerhalb der Licher ruber Läsionen gekennzeichnet. Die Autoantikörper erkennen überwiegend die NC16A Domäne von BP180.
Das Anti-p200 Pemphigoid ist eine zunehmend häufiger diagnostizierte Entität. Die Autoantikörper erkennen ein 200 kDa schweres Protein im Extrakt humaner Dermis. Bei 90 % der Patienten sind die Autoantikörper gegen die Laminin γ1 Kette gerichtet.
Das Autoantigen der Epidermolysis bullosa acquisita ist Kollagen VII; die NC1 Domäne stellt die immundominante Region dar. Seit Kurzem gibt es zwei kommerzielle Testsysteme für Autoantikörper gegen Kollagen VII, einen ELISA und einen Immunfluoreszenztest (Biochip-Assay). Letzterer verwendet humane Zellen die die NC1 Domäne von Kollagen VII auf ihrer Oberfläche exprimieren. Bei etwa 10 % der Patienten zeigt sich ausschließlich IgA Reaktivität gegen Kollagen VII (Tab. 4).
Das Hauptzielantigen des bulllösen systemischen Lupus erythematodes (BSLE) ist ebenfalls Kollagen VII (Typ 1 BSLE). Beim Typ 2 BSLE reagieren die Autoantikörper gegen andere Zielantigene einschließlich BP180, BP230 und Laminin 332.
Einige wenige Patienten wurden zudem mit einer Pemphigoiderkrankung in Assoziation mit Niereninsuffizienz und Autoantikörpern gegen die α5 Kette von Kollagen IV beschrieben.
Dermatitis herpetiformis Duhring
Die Dermatitis herpetiformis Duhring ist stets mit einer glutensensitiven Enteropathie (Zöilakie) assoziiert und wird als kutane Manifestation dieser Erkrankung betrachtet. Beim Morbus Duhring finden sich in der direkten IF periläsionaler Haut granuläre IgA Ablagerungen entweder fokal in den Papillenspitzen oder kontinuierlich entlang der DEJ (Abb. 13 und 5).
Abb. 13
Dermatitis herpetiformis Duhring. Schollige Ablagerungen von IgA in den Papillenspitzen und granulär an der dermo-epidermalen Junktionszone einer direkten Immunfluoreszenz periläsionaler Haut; beim Morbus Duhring ist die Glutealregion ist die geeignetste Körperstelle für die direkten Immunfluoreszenz
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Häufig sind zum Nachweis dieser granulären IgA-Ablagerungen mehrere Biopsien erforderlich. Die Glutealregion ist die am besten geeignete Körperstelle für die Biopsienetnahme. Mittels indirekter IF auf Affenösophagus lassen sich im akuten Stadium der Erkrankung bei fast allen Patienten Endomysiumantikörper des IgA-Isotyps nachweisen (Abb. 14).
Abb. 14
Indirekte Immunfluoreszenz auf Affenösophagus; IgA Anti-Endomysium Antikörpern bei einem Patient mit Dermatitis herpetiformis Duhring
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Die Titerhöhe der Antikörper korreliert mit der Aktivität der Darmerkrankung. Das Autoantigen des Morbus Duhring ist die Transglutaminase 3 (epidermale Transglutaminase). Für die serologische Diagnostik hat sich der Nachweis von IgA und, etwas weniger spezifisch, von IgG Antikörpern gegen Transglutaminase 3, Transglutaminase 2 (Gewebstransglutaminase, das Autoantigen der Zöliakie) und gegen deaminierte Gliadin-analoge Fusionsproteine bewährt. Hierfür wurden verschiedene kommerzielle Testsysteme etabliert (Tab. 4). Die Diagnose einer Dermatitis herpetiformis Duhring ist jedoch nur bewiesen bei positiver direkter IF.
Lupus erythematodes
Bei Verdacht auf einen Lupus erythematodes (LE) ist die direkte IF hilfreich bei der Diagnosestellung; es sollte eine läsionale Hautbiopsie gewonnen werden. Vier verschiedene Muster werden beobachtet. Am häufigsten zeigen sich bandförmige, auch als Lupusband bezeichnete, oder feingranuläre bis grobschollige Ablagerungen von Immunglobulinen entlang der DEJ (Abb. 15; oben Übersicht 1).
Abb. 15
Lupus erythematodes. Bandförmige Ablagerungen von C3 an der dermo-epidermalen Junktionszone in der direkten Immunfluoreszenz läsionaler Haut
Zudem werden Cytoidbodies (degenerierte Keratinozyten, die in die papilläre Dermis abgetropft sind) gefunden (Abb. 16; Übersicht 2). Ablagerungen an der DEJ sind meist IgG und IgM, weniger häufig IgA und C3. Cytoidbodies enthalten meist IgM oder IgA. Die beiden weiteren möglichen Muster sind Präzipitate von Immunglobulinen, C3 und Fibrinogen in den oberflächlichen Blutgefäßen und von IgG in den Keratinozytenkernen (besonders bei Anti-U1RNP Antikörpern).
Abb. 16
Cytoidbodies (IgM-positiv) an der dermo-epidermalen Junktionszone in der direkten Immunfluoreszenz läsionaler Haut, Cytoidbodies werden regelmäßig bei Patienten mit Lupus erythematodes (großes Bild) und Lichen ruber (kleines Bild) gefunden
Abb. 17
Lichen ruber. Bandfrmige Ablagerungen von Fibrinogen an der dermo-epidermalen Junktionszone, die netzfrmig in die papillðre Dermis auslaufen in der direkten Immunfluoreszenz lðsionaler Haut
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Übersicht 2. Erkrankungen mit Cytoidbodies in der papillären Dermis1
1einzelne Cytoidbodies (vor allem IgM-reaktiv) finden sich in 30–50 % der Biopsien
Die Ablagerungen an der DEJ finden sich häufiger beim systemischen LE als bei anderen LE Formen und auch häufiger in läsionaler als in nicht-läsionaler und häufiger in sonnenexponierter als in nicht-sonnenexponierter Haut. Bandförmige Niederschläge von IgM in sonnenexponierter Haut allein sind jedoch nicht diagnostisch und werden auch bei 10 % der Gesunden gefunden. Die Entnahme zusätzlicher Biopsien in nicht-läsionaler UV-exponierter und nicht-UV-exponierter Haut wurde weitgehend zu Gunsten der serologischen Autoantikörperdiagnostik verlassen.
Mittels indirekter IF auf HEp-2-Zellen und Leber lassen sich bei Patienten mit systemischem LE antinukleäre Antikörper nachweisen. Anhand des Fluoreszenzmusters und mit Hilfe rekombinanter Formen extrahierbarer nukleärer Antigene kann die Spezifität dieser Antikörper näher charakterisiert werden.
Dermatomyositis
In einer läsionalen Biopsie kann man Cytoidbodies in der papillären Dermis sowie Immunglobulinablagerungen an der DEJ wie beim systemischen LE beobachten, jedoch weniger häufig und weniger stark ausgeprägt.
Lichen ruber
Für die Diagnostik des Lichen ruber planus ist die direkte IF nicht notwendig, sie ist jedoch häufig hilfreich beim Lichen ruber mucosae und Lichen ruber pilaris. Hierbei sollte die Biopsie läsional erfolgen, bei erosiven Formen direkt neben der Erosion. Typisch sind Cytoidbodies in der papillären Dermis positiv für IgM und Fibrinogen, weniger häufig auch für IgG, IgA und C3 (Abb. 16; Übersicht 2). Charakteristisch sind auch bandförmige Niederschläge von Fibrinogen an der DEJ, die häufig netzförmig in die papilläre Dermis auslaufen (Abb. 18; Übersicht 1).
Abb. 18
Direkte Immunfluoreszenz läsionaler Haut eines Patienten mit leukozytoklastischer Vaskulitis; hier Präzipitate von IgA in den Gefäßwänden der papillären Dermis
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Leukozytoklastische Vaskulitis
Bei der Diagnostik von Vaskulitiden ist die direkte IF nur bei der leukozytoklastischen Vaskultits (Hypersensitivitätsvaskulitis) hilfreich. Die Diagnose einer leukozytoklastischen Vaskulitits erfolgt histologisch; ein positiver Befund allein in der direkten IF erlaubt diese Diagnose nicht, ein negativer schließt sie nicht aus. Für die Biospieentnahme sind zwei Punkte zu beachten: Auswahl einer frühen Läsion (Läsionen älter als 24 h sind häufig negativ) und wenn möglich keine Entnahme vom Unterschenkel, weil bei dieser Lokalisation häufig falsch positive Befunde generiert werden. Es zeigen sich typischerweise Ablagerungen von C3, in absteigender Häufigkeit, gefolgt von IgG, IgM und Fibrinogen im Lumen und den Wänden der Gefäße (Abb. 17). Die Fibrinablagerungen finden sich oftmals auch diffus perivaskulär. Über einen schwereren klinischen Verlauf und häufigere Nierenbeteiligung bei dominierenden IgA Ablagerungen wurde berichtet. Bei der Purpura Schönlein-Henoch ist IgA der vorherrschende Isotyp.
Chronisch ulzerative Stomatitis
Bei der chronisch ulzerativen Stomatitis finden sich in der direkten IF eine feingefleckte Kernfluoreszenz der basalen Epithelzellen bei Beschichtung mit Anti-IgG und Fibrinogenablagerungen an der DEJ. In der indirekten IF auf Affenösophagus lassen sich antinukleäre IgG Antikörper in den basalen Epithelzellen nachweisen. Auf HEp-2-Zellen oder Leberzellen finden sich diese Antikörper nicht. Die Eigenständigkeit der Erkrankung ist nicht allgemein akzeptiert.
Porphyrie
In läsionaler Haut sieht man bei der Porphyrie (cutanea tarda, variegata, erythropoetischen) und Pseudoporphyrie homogene bandförmige Ablagerungen von IgG und, weniger häufig, von C3, IgA und selten von IgM an der DEJ sowie in den erweiterten Blutgefäßen der papillären Dermis (Abb. 19).
Abb. 19
Porphyria cutanea tarda: bandförmige Bindung von IgG an der dermo-epidermalen Junktionszone und manschettenförmig um die Gefäße der oberen Dermis in der direkten Immunfluoreszenz läsionaler Haut; ein ähnliches Muster kann man bei anderen Porphyrien, Pseudoporphyrie und systemischem Lupus erythematodes beobachten
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Ein ähnliches Muster kann auch beim systemischen LE beobachtet werden!
Andere chronisch entzündliche Erkrankungen
Bei einer Reihe anderer entzündlicher Erkrankungen können sich granuläre oder dezent bandförmige (vor allem IgM) Ablagerungen an der DEJ (Übersicht 1) sowie Cytoidbodies in der papillären Dermis finden (Übersicht 2).
Infektiöse Erkrankungen
In der direkten IF läsionaler Biopsien oder von Zellmaterial aus Abstrichen von Hautläsionen oder genitourethral können mit Hilfe monokonaler fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen die jeweiligen Organismen Infektionen mit Herpes simplex VirusTyp I, Typ II, Varizella zoster Virus und Chlamydia trachomatis visualisiert werden (Abb. 20 und 21).
Abb. 20
Herpes simplex Virus Typ II-reaktive Zellen in der direkten Immunfluoreszenz läsionaler Haut
Abb. 21
Herpes-zoster-Virus-reaktive Zellen im Blasengrundabstrichs eines Patienten mit Herpes zoster
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Danksagung
Wir danken Inge Atefi, Dr. Franziska Hübner und Dr. Artem Vorobyev für Hilfe bei der Erstellung der Immunfluoreszenzabbildungen.
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