Die raschen Fortschritte in der Molekularbiologie haben die Medizin grundlegend verändert. Mit Hilfe zahlreicher neuer Technologien werden die molekularen Ursachen von Erkrankungen zunehmend aufgeklärt. Die neu gewonnenen Erkenntnisse verbessern nicht nur Diagnostik und Vorhersage der Prognose, sondern helfen auch neue therapeutische Ansätze für Hauterkrankungen zu finden. Anstatt empirischer Behandlungen greifen zunehmend therapeutische Strategien gezielt die Krankheitsursachen an (‚targeted therapy‘) und innovative Therapien werden präzise an die Bedürfnisse des Patienten angepasst (‚precision medicine‘). Ein prominentes Beispiel für diese zielgerichtete Therapie ist die Behandlung von BRAF mutierten Melanomen mit den Kinase-Inhibitoren Vemurafenib oder Dabrafenib.
Die raschen Fortschritte in der Molekularbiologie haben die Medizin grundlegend verändert. Mit Hilfe zahlreicher neuer Technologien werden die molekularen Ursachen von Erkrankungen zunehmend aufgeklärt. Die neu gewonnenen Erkenntnisse verbessern nicht nur Diagnostik und Vorhersage der Prognose, sondern helfen auch neue therapeutische Ansätze für Hauterkrankungen zu finden. Anstatt empirischer Behandlungen greifen zunehmend therapeutische Strategien gezielt die Krankheitsursachen an (‚targeted therapy‘) und innovative Therapien werden präzise an die Bedürfnisse des Patienten angepasst (‚precision medicine‘). Ein prominentes Beispiel für diese zielgerichtete Therapie ist die Behandlung von BRAF mutierten Melanomen mit den Kinase-Inhibitoren Vemurafenib oder Dabrafenib.
Obwohl die dermatopathologische Diagnostik
auch weiterhin größtenteils auf morphologischen Merkmalen beruhen wird, ist die Integration neuer Methoden wesentlich für eine kontinuierliche Weiterentwicklung der Dermatopathologie. Beispielsweise wurden seit den 1980er-Jahren zahlreiche immunhistochemische Methoden in die Dermatopathologie integriert, um die Grenzen der morphologischen Diagnostik zu überwinden. Heutzutage ist die Immunhistochemie eine essenzielle Technik in jeder dermatopathologischen Praxis und hat zu zahlreichen diagnostischen Verbesserungen geführt.
Die Integration von molekularbiologischen Methoden in die Dermatopathologie ist die logische Fortsetzung dieses Weges und wird die Qualität von dermatopathologischen Diagnosen noch weiter verbessern. Die molekulare Diagnostik wird in den nächsten Jahren einen immer wichtigeren Stellenwert in der Dermatopathologie einnehmen. In diesem Kapitel möchten wir eine kurze Übersicht über die molekularbiologische Terminologie, die Anwendungsbereiche von molekularbiologischen Methoden, und deren Einsatz in der dermatopathologischen Diagnostik und Forschung geben.
Die Terminologie der Molekularbiologie
Genom
Die Gesamtheit der Erbinformationen wird als Genom bezeichnet. Das menschliche Genom besteht aus 46 Chromosomen (22 Autosomen und 2 Geschlechtschromosomen). Die Chromosomen sind aus DNA und verschiedenen assoziierten Proteinen aufgebaut und beinhalten zirka 25.000 Gene und 3 Milliarden Basenpaare.
Gen
ist ein DNA-Abschnitt, der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNA enthält.
DNA
ist die Abkürzung für Desoxyribonukleinsäure (engl: deoxyribonucleic acid); sie ist der Träger der Gene. Chemisch gesehen ist die DNA ein Polynukleotid in Form einer Doppelhelix, welches aus 4 verschiedenen Bausteinen (Nukleotiden) aufgebaut ist. Jedes Nukleotid besteht aus einem Phosphat-Rest, dem Zucker Desoxyribose und einer von vier organischen Basen: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C).
RNA
im Gegensatz zu DNA enthält die RNA (engl: ribonucleic acid) eine Ribose anstelle der Desoxyribose, und Uracil (U) anstelle von Thymin (T). Die RNA hat vielfältige Funktionen, die von verschiedenen Familien von RNA-Molekülen durchgeführt werden wie z. B. messenger-RNA (mRNA), ribosomale RNA (rRNA), transfer-RNA (tRNA) oder microRNA (miRNA) (Abb. 1).
Abb. 1
Grundbegriffe der Molekularbiologie. DNA wird in RNA transkribiert, welche wiederum in Proteine translatiert wird; Mutationen der DNA können zu einer verminderten oder gesteigerten Proteinfunktion führen
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Transkription
ist das Umschreiben von der in der DNA kodierten Information in RNA. Die Transkription ist ein fein regulierter und komplexer Prozess, bei dem zahlreiche Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren, Promotoren und anderen regulatorischen Elementen wie ‚Enhancer‘ oder ‚Histon-Modifikationen‘ nötig sind.
Translation
ist das Umschreiben der Nukleotidsequenz der mRNA in die Aminosäuresequenzen der Proteine. Transkription und Translation sind wesentliche Teilprozesse der Genexpression.
Proteine
sind aus Aminosäuren aufgebaute Makromoleküle, welche spezifische zelluläre und extrazelluläre Funktionen übernehmen. Die Aminosäuresequenz bestimmt die Form und Funktion der Proteine.
Onkogene
kodieren Proteine, die Wachstum, Teilung und Differenzierung von Zellen kontrollieren und steuern. Die Aktivierung von Onkogenen erfolgt durch Mutationen, Translokationen oder Amplifikationen. Aktivierte Onkogene fördern den Übergang von kontrolliertem Zellwachstum zu ungebremstem Tumorwachstum. Wichtige Onkogene sind beispielsweise ALK, BRAF, NRAS, HRAS, KIT, und MYC.
Tumorsuppressorgene
kontrollieren wichtige zellphysiologische Programme wie Apoptose, Zellwachstum, Zelldifferenzierung, oder Detektion von DNA-Schäden. Eine Mutation oder ein Verlust eines Tumorsuppressorgens erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Tumorbildung. Wichtige Tumorsuppressorgene sind beispielsweise TP53, CDKN2A, PTCH, PTEN, NF1, NF2, BAP1 oder VHL.
Mutation
ist eine dauerhafte Veränderung der Nukleotidsequenz, welche an alle Tochterzellen weitergegeben wird. Grundsätzlich unterscheidet man zwischen Keimbahn-Mutationen, die an die Nachkommen weitergegeben werden können und hereditäre Hauterkrankungen oder Tumorsyndrome verursachen können, und somatischen Mutationen, die nur in ‚Nicht-Keimbahn-Geweben‘ vorkommen und somit nicht an die Nachkommen weitergegeben werden. Strukturell unterscheidet man Punktmutationen (bei welchen ein einzelnes Nukleotid verändert ist), Insertionen und Deletionen (bei welchen ein oder mehrere Nukleotide hinzugefügt oder verloren wurden), Amplifikationen/Zugewinne (bei welchen multiple Kopien von chromosomalen Regionen vorliegen), Translokationen (bei welchen Nukleotidsequenzen an andere Lokalisationen innerhalb des Genoms umverteilt werden). Funktionell unterscheidet man loss-of-function und gain-of-function Mutationen.
Signalwege
sind Prozesse, welche äußere Reize durch die Zellmembran in das Zellinnere weiterleiten, und über Signalnetzwerke zu verschiedenen zellulären Effekten führen. An der Weiterleitung dieser zellulären Signale sind zahlreiche Proteine und Botenstoffe beteiligt. Genetische Veränderungen von diesen, in Signaltransduktion involvierten Proteinen können zu einer konstitutiven Aktivierung oder zu einer permanenten Hemmung von Signalwegen führen. Beispielsweise finden sich in der Mehrzahl der melanozytären Tumoren genetische Veränderungen im MAPK (mitogen-activated protein kinase
) Signalweg, welcher durch andauernde wachstumsstimulierende Signale zu ungebremsten Zellwachstum von Melanozyten führt (Abb. 2).
Abb. 2
Schematische Illustration des MAPK-Signalwegs. Extrazelluläre Wachstumssignale werden über membrangebundene Rezeptoren in das Zellinnere geleitet und führen zu einer Aktivierung des MAPK-Signalweges (RAS, RAF, MEK, ERK); die roten Blitze indizieren genetische Aberrationen in melanozytären Tumoren, welche zu einer konstitutiven Aktivierung des MAPK-Signalweges und zu ungebremstem Zellwachstum führen
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Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die meisten DNA-Analyseverfahren benötigen große Mengen des zu untersuchenden DNA-Abschnitts. 1983 beschrieb Kary Mullis (Saiki et al. 1985) die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), welche den Grundstein für die moderne Genetik legte. Bei der PCR kann mittels eines Enzyms, der DNA-Polymerase, und eines Primerpaars, welches spezifisch zur Amplifikation eines bestimmten Abschnitts des Genoms oder auch einer Erreger-DNA ausgewählt wird, große Mengen an DNA synthetisiert werden. Bei der klassischen PCR werden zunächst die Doppelstränge der genomischen DNA bei 96 °C denaturiert (getrennt) und danach folgt die spezifische Bindung eines Primerpaars bei etwa 55–65 °C (Annealing). Nach Bindung der Primer folgt der Elongationsschritt, bei dem die DNA-Polymerase mittels zugesetzter freier Nukleotide die DNA zwischen den beiden Primerpaaren synthetisiert und im Ergebnis verdoppelt wird. Diese 3 Schritte werden in der Regel 30–40mal wiederholt, so dass 2^40 Kopien resultieren (Abb. 3). Basierend auf dieser Grundtechnik wurden eine Reihe von Methoden entwickelt, welche für die Dermatopathologie relevant sind.
Abb. 3
Prinzip der PCR. Nach Denaturierung und binden der Primer an die DNA (Annealing) erfolgt der Elongationsschritt, bei welchem die DNA-Polymerase den DNA Abschnitt zwischen dem Primerpaar synthetisiert
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Polymerase-Kettenreaktion zum Erregernachweis
Mittels PCR lassen sich in Gewebe, Blut oder Abstrichen Erreger wie Viren, Bakterien, Pilze, oder Protozoen nachweisen. Dazu wird eine PCR mit erregerspezifischen Primern durchgeführt und anschließend mittels Gelelektrophorese überprüft, ob in der Probe Erreger-DNA vorhanden war. Die Primer können dabei sehr spezifisch für einen Erreger oder recht breit, zum Beispiel für Bakterien allgemein gewählt sein. Darüber hinaus gibt es Protokolle zum Erregernachweis mittels Nested-PCR und Real-time-PCR. Die Sensitivität hängt dabei nicht nur von der Wahl der Primer und der Methode ab, sondern auch von dem individuellen Erreger. So lassen sich beispielsweise Mykobakterien oft nur schwer in FFPE-Gewebe nachweisen (Kap. Infektionen und Infestationen der Haut).
Polymerase-Kettenreaktion zum Klonalitätsnachweis
Eine wichtige Anwendung der PCR in der Dermatopathologie ist die Untersuchung von T-Zell- und B-Zell-Infiltraten auf Klonalität, wenn die Differenzialdiagnose ein Lymphom umfasst. Dazu wird aus dem Infiltrat DNA isoliert, mit standardisierten Primersets für T-Zellrezeptoren bzw. bei B-Zell-Infiltraten Immunglobulinschwerketten amplifiziert und mittels Gel- oder Kapillarelektrophorese hinsichtlich ihrer Längen analysiert. Die Verteilung der Fragmentlängen erlaubt Rückschlüsse auf eine Klonalität des Infiltrats. Dabei ist eine enge Korrelation mit den klinischen Daten und der Histomorphologie erforderlich, da zum Beispiel auch im Rahmen von Infektionen und Autoimmunerkrankungen klonale Infiltrate auftreten können (Kap. Kutane Lymphome und Leukämien).
Polymerase-Kettenreaktion mit Sanger-Sequenzierung zum Mutationsnachweis
Die klassische und bis heute am weitesten verbreitete Methode zur Mutationsanalyse ist die Durchführung einer PCR für ein Amplikon eines Gens mit anschließender Sequenzierung des Genprodukts nach dem Sanger Verfahren. Bei der Sequenzanalyse nach dem Sanger Verfahren werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide im Rahmen einer linearen Sequenzierungs-PCR-Reaktion in die zu analysierenden PCR-Produkte zufällig eingebaut und führen dadurch zu einem Kettenbruch. Die Auftrennung erfolgt dann durch Kapillarelektrophorese und Messung der Fluoreszenz mit einem Laser. Aus den unterschiedlich langen Fragmenten und ihrer Fluoreszenz lässt sich die Sequenz errechnen und als Diagramm darstellen (Abb. 4).
Abb. 4
Sanger-Sequenzierung. Oberes Panel Wildtyp-Sequenz der BRAF-Codons 599–601, rot umrandet Codon 600 mit der Nukleotidsequenz GTG, die für die Aminosäure Valin kodiert; unteres Panel mit heterozygoter V600E-Mutation; anstelle eines T finden sich ein T und ein A; ein Allel trägt nun die Sequenz GAG, die für Glutaminsäure steht
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Durch Sanger-Sequenzierung wurden wichtige onkogene Mutationen in Genen wie BRAF, NRAS und KIT beim Melanom entdeckt (Davies et al. 2002; Chin 2003; Curtin et al. 2006). Bei KIT-mutierten Melanomen wurden erstmals gezielte molekulare Therapien mit Imatinib erfolgreich durchgeführt und in Form von Fallberichten publiziert (Lutzky et al. 2008; Hodi et al. 2008). Dies führte zu einem Paradigmenwechsel: Das Melanom war jetzt, wenn auch nur in wenigen Fällen, durch eine gezielte Therapie behandelbar. In der Folge wurde dann nachgewiesen, dass eine gezielte Therapie mit Vemurafenib bei BRAF-mutierten Melanomen einer Therapie mit Dacarbazin überlegen ist (Chapman et al. 2011) und Vemurafenib wurde für die Behandlung BRAF-mutierter Melanome zugelassen.
Voraussetzung für diese gezielten Therapien ist die korrekte Sequenzanalyse mit Nachweis der jeweiligen Mutation, gegen die die Therapie gerichtet ist. Hier hat die molekulare Dermatopathologie und Pathologie einen hohen Stellenwert. Voraussetzung für diese Rolle der Dermatopathologie ist auch eine entsprechende fachliche Qualifikation (Dietel et al. 2012), die in Ringversuchen der Qualitätssicherungs-Initiative in der Pathologie (QuIP) nachgewiesen werden kann.
Bei der quantitativen PCR oder auch realtime PCR wird im Rahmen der PCR ein Fluoreszenzfarbstoff durch Einbau oder Freisetzung aktiviert und nach jedem Zyklus in Echtzeit gemessen. Durch Vergleich mit Standardkurven können quantitative Aussagen zu den eingesetzten DNA-Mengen gemacht werden. Praktische Beispiele sind spezifische Mutationsanalyse-Assays zum Beispiel zur Detektion einer BRAF V600E-Mutation in Melanomen. Hier wird im Rahmen der PCR-Reaktion eine mutationsspezifische oder eine wildtypspezifische Sonde eingebaut und diese setzen jeweils unterschiedliche Farbstoffe frei. Durch den relativen Verlauf der Farbstofffreisetzung lässt sich der Anteil der mutierten DNA im Gewebe mit einer Sensitivität von bis unter 10 % mutierten Allelen nachweisen. Nachteil der Methode ist, dass sie nur jeweils eine spezifische Mutation sicher erkennen. Kommen in einem Gen mehrere relevante Mutationen vor, so muss eine Vielzahl von Tests parallel durchgeführt werden und die Methode wird aufwändig und vergleichsweise teuer.
Qualitätsstandards bei der Durchführung von Polymerase-Kettenreaktion-Diagnostik
Da es sich bei PCR-basierten Methoden um außerordentlich sensitive und zum Teil komplexe Tests handelt, ist eine entsprechende Qualitätssicherung erforderlich. Diese kann zum einen durch Teilnahme an Ringversuchen getestet und nachgewiesen werden. Ringversuche existieren zum Beispiel für die Erregerdiagnostik, durchgeführt durch INSTAND e.V. Im Bereich der Onkogen-Mutationsdiagnostik wird bisher für die BRAF-Diagnostik ein Ringversuch in Zusammenarbeit der Deutschen Dermatologischen Gesellschaft und der Deutschen Gesellschaft für Pathologie durch die Qualitätssicherungs-Initiative in der Pathologie (QuIP) durchgeführt. Eine Akkreditierung im Rahmen des Qualitätsmanagements (DIN ISO 1702) erfordert die Durchführung der PCR mit einer räumlichen Trennung von DNA-Isolierung, Probenvorbereitung, PCR-Durchführung und Arbeit mit PCR-Produkten. Durch die hohe Sensitivität der PCR und die sehr hohe Kopienzahl von PCR-Produkten können schon kleinste Verunreinigungen zu falschen Befunden führen.
Next-Generation-Sequencing
Next-Generation-Sequencing (NGS) hat die genetische Forschung und molekulare Diagnostik revolutioniert und hat einen wesentlichen Beitrag dazu geleistet, molekulare Marker mit diagnostischer und prognostischer Relevanz zu definieren. Bei verschiedenen Firmen kommen unterschiedliche Techniken zum Einsatz. Beim derzeitigen Marktführer Illumina wird die zu untersuchende DNA zunächst fragmentiert und mit Adaptersequenzen, welche die Annealing Sequenzen der Sequenzierprimer enthalten, versehen. Danach werden die Fragmente auf einer Mikroplatte in winzigen Poren fixiert und sequentiell Nukleotide, die mit einem Terminator versehen sind und somit nur den Einbau einer spezifischen Base pro Zyklus erlauben, zugefügt. Nachdem die ungebundenen Nukleotide weggewaschen wurden, wird der Terminator abgespalten wodurch ein Lichtsignal freigesetzt wird, welches von Kameras detektiert wird. Dem folgt der nächste Zyklus mit einem anderen Nukleotid. Mehrere Millionen DNA-Fragmente können gleichzeitig sequenziert und bioinformatisch ausgewertet werden (Abb. 5).
Abb. 5
Vergleich Sanger-Sequenzierung und Next-Generation-Sequencing. a Bei der Sanger-Sequenzierung wird nach kapillarelektrophoretischer Auftrennung die Signalintensität der fluoreszenzmarkierten Nukleotide analog gemessen; das Elektropherogramm zeigt eine Frameshift-Mutation mit Verlust eines G an Position 1305, b bei Next-Generation-Sequencing wird der Einbau einer spezifischen Base in zahlreiche DNA-Fragmente gleichzeitig und digital gemessen, die grauen Pfeile entsprechen jeweils der Sequenz von einem DNA Fragment
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Die größten Vorteile von NGS gegenüber traditionellen Methoden, basierend auf der Sanger Methode, liegen im hohen Durchsatz und den vergleichbar geringen Kosten. Während es mit der Sanger Methode routinemäßig nur möglich war spezifische Mutationen oder eine geringe Anzahl von Genen zu sequenzieren, erlaubt NGS die rasche und kosteneffiziente Analyse von hunderten Kandidatengenen für eine bestimmte Erkrankung (‚disease panels‘) oder auch von gesamten Genomen. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Mutationen, die nur in einem geringen Prozentsatz von Zellen vorkommen, trotzdem noch detektiert werden können.
Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH)
Die Fluoreszenzin-situ Hybridisierung (FISH) wurde in den 1980er Jahren entwickelt und erlaubt die Identifikation von strukturellen und numerischen chromosomalen Veränderungen. Die FISH Methode basiert auf der Verwendung künstlicher DNA Proben, die mit Fluoreszenzmarkern gekoppelt sind und an komplementäre Nukleotidsequenzen im Zielgewebe binden. Im Rahmen der Hybridisierungsreaktion binden die fluoreszenzmarkierten Proben an die komplementären DNA Sequenzen. Nachdem die ungebundenen Proben in einem Waschschritt weggewaschen wurden, werden die FISH Signale mittels Fluoreszenzmikroskopie detektiert.
Die in der molekularen Diagnostik am häufigsten verwendeten FISH Proben sind lokus-spezifische Proben. Lokus-spezifische Proben sind gegen bestimmte Sequenzen im Genom gerichtet und werden vor allem verwendet um genetische Verluste und Zugewinne zu detektieren (z. B. CDKN2A-Gen Verluste oder CCND1-Gen Amplifikationen bei melanozytären Tumore). Normalerweise sind in jeder Zelle 2 Kopien von jedem Gen vorhanden (ein Allel von der Mutter und ein Allel vom Vater). Bei Verlust eines Gens sind weniger Kopien des Gens (weniger als 2 FISH-Signale) oder bei einer Amplifikationen mehr Kopien des jeweiligen Gens (mehr als 2 FISH-Signale) vorhanden.
Eine andere Art von lokus-spezifischen Proben sind sogenannte Fusions-Proben, die bei der Diagnose von Translokationen eingesetzt werden (z. B. zur Detektion von ALK-TPM3 Translokationen bei Spitz Tumoren). Bei diesem Ansatz werden 2 Proben, die jeweils mit einem roten oder grünen Fluoreszenzfarbstoff markiert sind und gegen 2 bestimmte Abschnitte im Genom (z. B. 2 verschiedene Gene) gerichtet sind, gleichzeitig hybridisiert. Sind die beiden Signale getrennt sichtbar, ist keine Translokation vorhanden, sind die beiden Signale jedoch überlappend, handelt es sich um eine Translokation. Nach dem umgekehrten Prinzip gibt es auch break-apart-FISH-Proben, bei denen eine rote und eine grüne FISH-Probe über einen potentiellen Translokationsbruchpunkt binden. Falls keine Translokation vorhanden ist, ist ein rot/grünes Fusionssignal sichtbar; im Falle einer Translokation sind 2 getrennte Signale sichtbar (Abb. 6).
Abb. 6
Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH). a FISH eines atypischen Spitztumors mit einer ALK break-apart-Probe zur Identifikation von strukturellen chromosomalen Veränderungen, die getrennten orangen und grünen Signale sind beweisend für einen Bruchpunkt im ALK Gen (ALK Translokation), b Identifikation von numerischen chromosomalen Veränderungen bei einem Spitz Tumor, die multiplen Fusionssignale pro Zellkern sind ein Hinweis auf eine BRAF Amplifikation
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Die großen Vorteile von FISH gegenüber anderen Techniken sind, dass FISH auch mit formalin-fixiertem Gewebe gut funktioniert und eine der wenigen Methoden ist, die einzelne Zellen in situ analysiert und somit Aufschlüsse über Tumorheterogenität gibt. Es ist sowohl möglich numerische als auch strukturelle Veränderungen zu untersuchen. Die FISH Methode setzt jedoch Kenntnisse über die genetischen Aberrationen im jeweiligen Tumortyp voraus und pro Hybridisierung kann nur eine geringe Anzahl an Markern untersucht werden. FISH ist somit nicht sehr gut geeignet, um neue Aberrationen zu identifizieren.
Krebs ist in erster Linie eine Krankheit des Genoms. Vor allem bei soliden Tumoren ist die asymmetrische Verteilung des Chromosomenmaterials bei der überstürzten und fehlerhaften Zellteilung und durch fehlerhafte DNA-Kontrollpunkte ein wichtiger Entstehungsmechanismus genetischer Fehler. Wenn diese zufälligen genetischen Veränderungen zu Überlebensvorteilen für die Tumorzellen führen, kommt es zur klonalen Proliferation von Tumorzellen mit zunehmenden Veränderungen des Genoms. Unbalancierte Translokationen können dann zu Gendosiseffekten mit Aktivierung von Onkogenen und Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen.
Unter den zytogenetischen Methoden zur Diagnose quantitativer chromosomaler Aberrationen hat die komparative genomische Hybridisierung (CGH) eine bedeutende Stellung eingenommen, da sie an routinefixiertem Gewebe einsetzbar ist (Kallioniemi et al. 1992). Die Array-CGH erreicht eine deutlich höhere Auflösung, ist in der Routine leichter durchführbar und stellt eine Weiterentwicklung der klassischen CGH auf Metaphasenchromosomen dar (Pinkel et al. 1998).
Bei der Array-CGH werden 2 mit unterschiedlichen Fluorochromen markierte DNA-Proben gleichzeitig auf Oligonukleotidarrays hybridisiert. Dabei handelt es sich um Tumor-DNA und um Referenz-DNA von einem Gesunden (Abb. 7). Während der Hybridisierung konkurrieren die beiden unterschiedlich markierten DNA-Proben um die Bindung an ihre korrespondierenden Oligonukleotide und binden im selben Verhältnis in dem sie in der Hybridisierungslösung vorliegen. Die Fluoreszenzintensitäten der gebundenen Tumor- und Referenz-DNA werden dann mit einem Laserscanner gemessen und mittels einer Software ausgewertet.
Abb. 7
Prinzip der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH)
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Liegen die Tumor-DNA und die Referenz-DNA im gleichen Verhältnis vor, so entspricht dies einer normalen, diploiden Chromosomenzahl. Hat der Tumor eine erhöhte Kopienzahl in einer bestimmten Region, so wird das Verhältnis von Tumor- zu Referenz-Floreszenzintensität >1. Bei einem fokussierten und hohen Anstieg spricht man von einer Amplifikation. Hat der Tumor hingegen eine oder beide Kopien der entsprechenden chromosomalen Region verloren, so wird das Verhältnis von Tumor- zu Referenz-Floreszenz-Intensität <1 und man spricht von einer reduzierten Kopienzahl oder Deletion.
Die Array-CGH detektiert nur Aberrationen, die in einem klonalen Tumorzellanteil von mindestens 30 % vorliegen. Veränderungen, die nur in kleineren Subpopulationen des Tumors auftreten, werden nicht erfasst. Ebenso kann eine hohe Kontamination mit normalen Zellen, wie Stroma- und Entzündungszellen, Aberrationen verdecken. Balancierte Translokationen und Punktmutationen werden ebenfalls nicht erfasst.
Quantitative chromosomale Aberrationen bei melanozytären Tumoren
Bereits frühe Studien mittels Karyotypisierung von Metaphasenchromosomen aus Melanomzelllinien zeigten charakteristische chromosomale Aberrationen mit häufigen Duplikationen der Chromosomen 1q, 6p, 7, und 8q sowie Deletionen von 6q, 9 und 10 (Kakati et al. 1977; Thompson et al. 1995). Molekulargenetische Studien mittels CGH erlaubten die Arbeit mit routinefixiertem Gewebe primärer Melanome (Bastian et al. 1998; Wiltshire et al. 2001). Diese Studien zeigten, dass die überwiegende Zahl primärer Melanome der Haut chromosomale Aberrationen aufweisen.
Im Gegensatz zu den Melanomen liegen bei melanozytären Nävi in den meisten Fällen keine chromosomalen Aberrationen vor (Bastian et al. 1998, 1999, 2003). Eine Ausnahme bilden Spitz-Nävi, bei denen etwa 20 % isolierte Zugewinne des kurzen Arms von Chromosom 11 aufweisen (Harvell et al. 2002). Weiterhin finden sich charakteristische Aberrationen auch in atypischen, knotigen Proliferationen, die sich in großen kongenitalen melanozytären Nävi zumeist im ersten Lebensjahr entwickeln können. In einer Studie wiesen 7 von 9 atypischen knotigen Proliferationen mit Aberrationen ausschließlich Zugewinne oder Verluste von kompletten Chromosomen auf, während Melanome in großen kongenitalen Nävi in der überwiegenden Mehrzahl eine oder mehrere Aberrationen aufweisen, die vor allem Chromosomenbruchstücke umfassen (Bastian et al. 2002).
Molekulare Klassifikation melanozytärer Tumoren
Auf der Basis der charakteristischen chromosomalen Aberrationsmuster lassen sich melanozytäre Tumore klassifizieren. Dabei stellt sich das Melanom basierend auf molekularen Befunden nicht als eine Tumorentität dar, sondern als eine Gruppe molekular unterschiedlicher Tumorentitäten. Die Aberrationsmuster der Melanome unterscheiden sich nach der Körperregion in der der Tumor entstand und nach dem Lichtschaden der umgebenden Haut. Ebenso unterscheiden sich dabei die Mutationsfrequenzen von Onkogenen wie BRAF und NRAS. Dies führte zu einer Klassifikation molekularer Entitäten des Melanoms (Curtin et al. 2005). Diese Klassifikation spielt sowohl für unser Verständnis des Melanoms und seiner Entstehung als auch für die Entwicklung individualisierter Therapien eine zentrale Rolle.
Die unterschiedlichen Muster und Häufigkeiten chromsomaler Aberrationen lassen sich auch für die Unterscheidung gutartiger und bösartiger melanozytärer Tumore nutzen. Die Histopathologie ist eine gut etablierte Standardmethode in der Diagnostik melanozytärer Tumore. Jedoch bleibt ein geringer Anteil der Fälle, bei dem eine eindeutige Diagnose mithilfe histomorphologischer Kriterien und Immunhistologie alleine nicht möglich ist (Cook 1997; Corona et al. 1996; Kempf et al. 1998). Typische Beispiele für solche diagnostischen Problemfälle sind Tumore, die histologische Kriterien von Spitz-Nävi und Melanomen aufweisen (Barnhill et al. 1999). Eine Fallserie von 10 spitzoiden melanozytären Tumoren zeigte, dass die CGH mit dem Verlauf korreliert und dass bei spitzoiden Melanomen typischerweise mehrere chromosomale Aberrationen auftreten (Ali et al. 2010). Eine weitere Fallserie von 16 atypischen Spitztumoren zeigte bei diesen Tumoren chromosomale Aberrationsmuster, die nicht melanomtypisch waren (Raskin et al. 2011).
Auch Tumoren aus dem Spektrum blauer melanozytärer Tumoren können diagnostisch sehr schwer einzuordnen sein. Hier untersuchte eine retrospektive Fallserie an 19 Tumoren aus dem Spektrum der blauen melanozytären Tumoren den Erkrankungsverlauf durch Nachbeobachtung der Patienten, Tumormorphologie und chromosomale Aberrationen mittels CGH. Bei 3 Patienten zeigte sich ein mit komplizierter Verlauf ein Lokalrezidiv das die Narbe wesentlich überschritt, eine Lymphknotenmakrometastase und ein Patient verstarb an seinem Tumor.
Bei diesen drei Patienten lagen komplexe chromsomale Aberrationen vor, die eine Instabilität des Tumorgenoms wiederspiegelten (Held et al. 2013).
Ein Beispiel für die Anwendung der CGH bei spitzoiden melanozytären Tumoren zeigt Abb. 8. Es handelt sich um einen rasch gewachsenen und zuletzt auch ulzerierten Tumor von glutäal bei einer 23jährigen Frau. Histologisch zeigte sich ein melanozytärer Tumor mit spitzoider Zellmorphologie. Eindeutige Ausreifung bestand nicht und auch in tiefen Tumoranteilen fanden sich Mitosen. Die darüber liegende Epidermis war hyperplastisch. Die Diagnose eines spitzoiden, nodulären Melanoms, Tumordicke 3,0 mm wurde gestellt. Aufgrund des jungen Alters der Patientin und der spitzoiden Morphologie wurde zur weiteren Absicherung der Diagnose eine CGH durchgeführt. Diese zeigte teilweise komplexe, quantitative chromosomale Aberrationen in 5 Chromosomen, dabei auch melanom-typische Aberrationen wie ein Verlust von Chromosom 9. Die CGH bestätigt somit die Diagnose eines spitzoiden, nodulären Melanoms. Zusammenfassend kann die CGH eine genomische Instabilität unklarer melanozytärer Tumoren sichtbar machen, die auf einen komplizierten Verlauf hinweisen kann. In solchen Fällen sollte zur Sicherheit ein Vorgehen wie bei einem Melanom erwogen werden.
Abb. 8
Anwendung der CGH bei einem atypischen spitzoiden Tumor, bei dem die Diagnose eines spitzoiden Melanoms gestellt wurde
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