Kompendium Internistische Onkologie

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Publiziert am: 02.07.2022

Molekularpathologische Diagnostik

Verfasst von: Gustavo B. Baretton und Daniela E. Aust

Aufgrund des besseren Verständnisses der molekularen Veränderungen in Neoplasien gewinnen molekularpathologische Verfahren zunehmend an Bedeutung nicht nur für die genauere Typisierung von Tumoren, sondern auch für prognostische und prädiktive Aussagen. Solche gewebsbasierten Biomarker sind mittlerweile als sog. Companion-Diagnostik bei vielen zielgerichteten Therapien obligat für die Identifizierung geeigneter Patienten. Im Gegensatz zur FDA in den USA wird hierfür von der europäischen Zulassungsbehörde (EMA) kein für jedes einzelne Medikament verbindlicher Test vorgeschrieben, sondern lediglich der Einsatz einer validierten Testmethode gefordert. Dies ermöglicht dem Pathologen eine größere Freiheit, verpflichtet ihn jedoch zur internen und externen Qualitätssicherung. Eine sog. Complementary-Diagnostik ist dagegen für eine Therapieentscheidung nicht zwingend vorgeschrieben, liefert jedoch dem Kliniker wertvolle Informationen über die Tumorbiologie. Vor diesem Hintergrund werden in diesem Kapitel die aktuellen Methoden der Molekularpathologie kurz erläutert und in den jeweiligen diagnostischen Kontext gestellt.

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Einführung
Untersuchungen am Tumorgenom
Proteinanalytik

Einführung

Molekulargenetik und -biologie haben unser Verständnis von Tumorentstehung/-progression erheblich verbessert. Einen entscheidenden Beitrag hierzu haben Techniken geleistet, die es erlauben, Tumorgenom und -proteom nicht nur an Frischmaterial, sondern auch an Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem (FFPE-)Gewebe genauer zu analysieren. Gleichzeitig wurden sog. zielgerichtete Therapeutika entwickelt, die zielgenau auf molekulare Aberrationen in den Tumorzellen einwirken.

Die Untersuchung von FFPE-Gewebe aus großen Studienkohorten ermöglichte die Identifikation gewebsbasierter prognostischer und prädiktiver Biomarker, die z. T. bereits Eingang in die pathologische Routinediagnostik gefunden haben (integrierter „morphomolekularer“ Ansatz). Diese prädiktiven Biomarker dienen zur Stratifizierung der Patienten in potenzielle Responder, die von einer zielgerichteten Therapie profitieren, und Non-Responder, für die eine zielgerichtete Therapie keinen Nutzen bringt.

Nicht zuletzt aufgrund der hohen Kosten, aber auch der Nebenwirkungen dieser Therapeutika ist eine solche molekularpathologische Diagnostik essenziell und wird von den Zulassungsbehörden gefordert. Während in den USA von der FDA zu jedem derartigen Medikament eine spezifizierte Companion-Diagnostik zugelassen wird, wird in Europa bislang von der EMA lediglich ein „geeigneter, validierter Test“ gefordert, was eine gewisse methodische Offenheit gewährleistet. Von der Companion-Diagnostik muss die Complementary-Diagnostik unterschieden werden, die nicht zwingend zur Therapieentscheidung beiträgt, aber dem behandelnden Arzt molekularbasierte Informationen zur Entscheidungsfindung liefert. In Deutschland muss nach Zulassung eines Medikamentes seit Kurzem auch die Erstattung einer Companion-Diagnostik von den Kostenträgern sichergestellt werden.

Die Entwicklung auf diesem Gebiet verläuft rasant, sodass auch die Zahl der Biomarker ständig wächst. Der Trend geht dabei hin zu immer aufwendigeren Analysen unter immer größerem Zeitdruck. Im diesem Kapitel werden wesentliche analytische Methoden zur Untersuchung des Tumorgenoms bzw. -proteoms dargestellt, die in der täglichen Diagnostik bzw. in der molekularpathologischen/onkologischen Forschung angewendet werden.

Alle Methoden, die in der molekularpathologischen Diagnostik zum Einsatz kommen und damit die Therapie des Patienten mitbestimmen, müssen zur Gewährleistung der Patientensicherheit einer kontinuierlichen Qualitätssicherung unterliegen. Im Rahmen der Qualitätssicherungsinitiative Pathologie (QuIP) der Deutschen Gesellschaft für Pathologie (DGP) und des Bundesverbandes Deutscher Pathologen (BDP) werden seit Jahren externe Ringversuche durchgeführt; die Teilnahme ist bislang nur für die Zertifizierung von Organtumorzentren vorgeschrieben und (noch) nicht erlösrelevant. Der Kliniker/Onkologe sollte jedoch unbedingt darauf achten, dass sich die kooperierende Pathologie regelmäßig und mit Erfolg an den externen Qualitätssicherungsmaßnahmen beteiligt.

Untersuchungen am Tumorgenom

Extraktion aus Gewebe und Blut

Die Basis jedweder Diagnostik, für die DNA oder RNA verwendet wird, ist die Extraktion der jeweiligen Nukleinsäuren aus dem Gewebe. In der diagnostischen Molekularpathologie wird hauptsächlich mit FFPE-Material gearbeitet – mit dem Nachteil einer Fragmentierung von DNA und RNA. Abhängig von Gewebetyp und Fixierbedingungen entstehen DNA-Fragmentlängen von durchschnittlich 300–400 bp (Lehmann und Kreipe 2001). Um Mutationen im Tumorgewebe analysieren zu können, muss DNA in höchstmöglicher Reinheit und Qualität gewonnen werden. In der Regel handelt es sich um heterogenes Material, bestehend aus Tumorzellen und nicht neoplastischem Gewebe.

Mithilfe einer Mikrodissektion (manuell oder lasergestützt) wird zu Beginn das zu untersuchende Tumorareal, das vorher vom Pathologen auf einem histologischen Schnitt markiert wurde, für eine DNA-Isolierung genutzt (Abb. 1). Bei der lasergestützten Mikrodissektion werden mithilfe eines Laserstrahls die gewünschten Tumorzellen vom histologischen Schnitt selektiv präpariert; die manuelle Mikrodissektion erfolgt mittels Skalpell aus 5–10 μm dicken ungefärbten (Nativ-)Schnitten. Die anschießende Nukleinsäureextraktion kann manuell mittels Ethanolpräzipitation, mithilfe kommerziell erhältlicher Kieselgelsäulen- oder Bead- basierter Kits oder automatisiert erfolgen. Die Qualität und Quantität der isolierten Nukleinsäuren wird spektralphoto- oder fluorometrisch bestimmt.

Neben Gewebeproben kommen zunehmend sog. Liquid Biopsies zur Testung, mit denen frei zirkulierende Tumor-DNA (cfDNA) bzw. DNA aus zirkulierenden Tumorzellen (ctDNA) im Blut (oder anderen Körperflüssigkeiten) nachgewiesen werden soll (Alix-Panabieres und Pantel 2013; Jung und Kirchner 2018). Die Bezeichnung Flüssigbiopsie ist jedoch irreführend, da sie eine vermeintliche Äquivalenz zur Gewebebiopsie suggeriert, die nicht der Realität entspricht. Inwieweit Tumor-cfDNA nachweisbar ist, hängt u. a. vom Tumorstadium und dem Tumortyp ab. Diese Methode hat prinzipiell den Vorteil, dass sie für den Patienten minimalinvasiv ist und (zumindest theoretisch) die Heterogenität einer Tumorpopulation bzw. deren Metastasen abbilden kann. Insbesondere das Ansprechen auf eine durchgeführte Therapie mit dem Fokus der Identifizierung unter Therapie entstandener Resistenzmutationen, kann mithilfe von Flüssigbiopsien überwacht werden (Pantel und Alix-Panabières 2013).

In der Praxis ist die Liquid Biopsy bislang lediglich für den Nachweis der T790M-Resistenzmutation beim EGFR-mutierten nicht kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) etabliert; eine wesentliche Voraussetzung für eine valide Beurteilung ist die Kenntnis der Primärmutation und deren Nachweis auch in der Flüssigprobe. Um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, kommt es bei der Extraktion von cfDNA aus einer Liquid Biopsy auf eine standardisierte, qualitätskontrollierte Vorgehensweise (z. B. QuIP-RV zum T790M-Mutationsnachweis) und hoch sensitive Isolations- und Analysetechniken an. Dies ist bislang noch nicht flächendeckend gegeben.

PCR- und Sequenzierungsanalysen (DNA und RNA)

Sanger-Sequenzierung

Um eventuell vorhandene Mutationen in therapeutisch relevanten Genen für prädiktive bzw. prognostische Aussagen anhand der entsprechenden Nukleotid-Abfolge der Tumor-DNA zu identifizieren, stehen verschiedene DNA-Sequenzierungsmethoden zur Verfügung.

Die älteste Methode wurde von Sanger et al. 1977 beschrieben und beruht auf der Didesoxymethode („Kettenabbruchsynthese“). Nach Denaturierung der im Vorfeld amplifizierten doppelsträngigen DNA mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) erfolgt eine Hybridisierung von Oligonukleotiden (sog. Primern) an die interessierenden DNA-Abschnitte. Die Anlagerung findet dabei komplementär zur Zielsequenz statt. Die DNA-Polymerase bindet an den Primer und synthetisiert einen reziproken Strang durch den Einbau entsprechender Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP). Hierfür liegt ein Gemisch herkömmlicher dNTP und fluoreszenzmarkierter Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTP) vor. Kommt es zum Einbau eines ddNTP, folgt aufgrund des Fehlens der 3′-Hydroxygruppe ein Stopp der Polymerase und somit ein Kettenabbruch. Die fluoreszenzmarktierten ddNTP, auch als Terminatoren bezeichnet, dienen bei der anschließenden Fragmentlängenanalyse der Detektion. Dabei werden die endmarkierten Fragmente entsprechend ihrer unterschiedlichen Länge mithilfe eines kapillarbasierten Polymergels durch elektrophoretische Trennung aufgetrennt, die Fluorochrome der Terminatoren mittels Laser angeregt und deren Emissionssignal detektiert. Diese Signale übersetzt eine Software als DNA-Sequenz (Abb. 2a).

Für diese Methode sind verschiedene Sequenziergeräte erhältlich. Mit der Sanger-Sequenzierung können durchaus DNA-Abschnitte von mehreren hundert Nukleotiden untersucht werden. Die Sensitivitätsrate liegt allerdings nur bei ca. 20 % und ist damit moderneren Sequenzierungstechniken unterlegen.

Pyrosequenzierung

Die Pyrosequenzierung arbeitet ebenfalls mit der Neusynthetisierung eines komplementären DNA-Strangs (Ronaghi et al. 1996). Die Polymerase bindet an einen Primer und verlängert den komplementären DNA-Strang durch den Einbau von Nukleotiden, die nacheinander als dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) zum Ansatz gegeben werden. Nach Zugabe und Einfügen eines komplementären Nukleotids kommt es innerhalb einer chemischen Reaktion zur Freisetzung von Pyrophosphat (PPi), das zusammen mit Adenosin-5′-Phosphosulfat (APS) durch die ATP-Sulfurylase in Adenosintriphosphat (ATP) umgewandelt wird. Das im Reaktionsansatz vorhandene Luziferin und das entstandene ATP werden wiederum durch das Enzym Luziferase zu Oxyluziferin oxidiert, wodurch ein Lichtsignal entsteht. Die überschüssigen, nicht eingebauten dNTP und ATP werden enzymatisch durch Apyrase degradiert. Dann erst erfolgt eine weitere Zugabe des nächsten dNTP, sodass der komplementäre DNA-Strang fortschreitend aufgebaut werden kann. Die Arbeit der Polymerase kann bei dieser Methode aktiv beobachtet werden, da das Lichtsignal mittels eines Detektors als Peak (Pyrogramm) aufgezeichnet wird (Abb. 2b). Dieser Peak ist proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide (Ronaghi 2001). Umgesetzt wird die Methode mittels Pyrosequenziergeräten, diversen Mutationsanalysekits und entsprechender Analysesoftware.

Im Vergleich zur Sanger-Methode werden die Basen nacheinander gelesen, wodurch eine Auftrennung nach Größe nicht nötig ist. Die Pyrosequenzierung ist eine schnellere, preiswerte und gut automatisierbare Methode, die hochparallele Analysen ermöglicht. So ist eine effiziente Analyse von Einzelnukleotid-Polymorphismen („single nucleotide polymorphisms“, SNP) realisierbar (Ahmadian et al. 2000). Im Gegensatz zur Sanger-Sequenzierung ist die Leselänge geringer (bis zu 500 bp). Des Weiteren kann es zu Problemen bei der Sequenzierung von polymorphen Regionen in heterozygoter DNA und bei der Bestimmung der Anzahl eingebauter Nukleotide in homopolymeren Regionen kommen (Ronaghi 2001).

Next Generation Sequencing (NGS)

Seit 2007 besteht die Möglichkeit, mithilfe von modernen Hochdurchsatzmethoden, zusammengefasst als Next Generation Sequenzierung (NGS), Millionen von DNA-Fragmenten in einem einzigen Sequenzierlauf parallel zu sequenzieren. So können z. B. das humane Gesamtgenom („whole genome“), alle codierenden Bereiche („whole exome“) oder eine Vielzahl verschiedener Gene durch Verwendung von sog. Genpanels kosteneffektiv und sehr schnell sequenziert werden. NGS ist eine Weiterentwicklung („next“) der ersten Sequenziergeneration, bei der eine klonale Sequenzierung einzelner Moleküle erfolgt, die dadurch eine sehr sensitive Variantendetektion ermöglicht.

Grundsätzlich ist das Konzept der massiven Parallelsequenzierung, wie bei den o. g. Technologien, Sequencing-by-Synthesis (SBS). Da nicht für jede Fragestellung eine Sequenzierung des Gesamtgenoms oder -exoms nötig ist, gibt es verschiedene Technologien für eine spezifische Anreicherung der Zielregionen (sog. Target Enrichment). Zum einen können die interessierten Bereiche per PCR (Amplikon-basiertes Verfahren) oder durch Hybridisierung mittels DNA- oder RNA-Sonden (Hybrid Capture) hergestellt werden. Bei diesen Verfahren werden die DNA-Fragmente (sog. Libraries) mit Indexen mit definierten Basenpaarabfolgen (sog. Barcodes) markiert, sodass nach dem Sequenzierprozess die sequenzierten Reads jedem Patienten eindeutig zugeordnet werden können.

Je nach Fragestellungen können verschiedene kommerziell oder individuell auf den Phänotyp des Tumors angepasste Genpanels oder Hybrid-Capture-Panels für eine Anreicherung der Zielregionen verwendet werden. Die nachfolgende Sequenzierung der entsprechenden angereicherten Zielregionen kann mithilfe von Fluoreszenz- oder Ionendetektion erfolgen (Abb. 2c). Neben Punktmutationen und Deletionen können mittels bestimmter Auswertealgorithmen bzw. durch die Sequenzierung von mRNA auch Translokationen und Änderungen der Kopienzahl (CNV; Zugewinne und Verluste) bestimmt werden.

In der Praxis kommen derzeit hauptsächlich Panelanalysen mit einer überschaubaren Anzahl von (ziel)therapeutisch relevanten („drugable“) Genen (ca. 15–50) zum Einsatz. Aufgrund der rasanten Zunahme von verfügbaren zielgerichteten Therapeutika geht jedoch der Trend aktuell zu größeren Panels (mit 170 bis z. T. >400 Genen). Solche Großpanels mit der Sequenzierung von mindesten 1 Mb erfordern hohe Investitionen in die Sequenziergeräte und die Bioinformatik, sollen aber auch die Bestimmung der sog. Mutationslast („tumor mutational burden“, TMB) ermöglichen. Eine „hohe“ Mutationslast als Surrogatparameter für das Auftreten von Neoantigenen in den Tumoren war – zumindest in Studien – ein Prädiktor für das Ansprechen auf eine Immuncheckpoint-Therapie. Bislang sind aber noch viele Fragen bzgl. TMB offen (welche Panels führen zu vergleichbaren Resultaten, Grenzwert für „hohe“ TMB, Bioinformatik etc.), sodass diese Untersuchung derzeit nur von akademischen (nicht kommerziellen) Zentren durchgeführt werden sollte. Nur so ist gewährleistet, dass das aufwendige und teure Verfahren objektiv evaluiert und validiert werden kann.

Methylierungsanalysen

Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um eine Modifikation des genetischen Codes durch die Übertragung von Methylgruppen mittels DNA-Methyltransferasen an Nukleotide unter Beibehaltung der Sequenz. Der Grad der Methylierung beeinflusst die Genexpression. Eine Methylierung der Promoterregion (sog. CPG-Inseln) kann folglich zur epigenetischen Inaktivierung der Genexpression führen (z. B. von Tumorsuppressorgenen).

Veränderte DNA-Methylierungsmuster in Tumoren ermöglichen eine frühzeitige Krebserkennung, da sie bereits in der Tumorinitiation stattfinden (Shames et al. 2007). Tumorspezifische DNA-Methylierungen lassen sich in verschiedenen Materialien, wie z. B. Blut, Sputum und Gewebeproben, nachweisen (Shames et al. 2007). Im Gegensatz zu Mutationen können solche epigenetischen Modifikationen reversibel sein und so einen Ansatzpunkt für neue Therapien darstellen (demethylierende Agenzien).

Zum Nachweis methylierter DNA stehen verschiedene Methoden wie die Bisulfit-Sequenzierung zur Verfügung. Innerhalb der DNA werden mit Bisulfit unmethylierte Cytosine zu Uracil konvertiert, im Anschluss erfolgt eine Sequenzierung mit einer der o.g. Sequenziertechniken (Frommer et al. 1992). Durch eine unvollständige Konversion von Cytosin zu Uracil können bei unvollständiger Template-Denaturierung Artefakte entstehen. Auch eine partielle Renaturierung während der Bisulfit-Behandlung stellt eine potenzielle Fehlerquelle dar (Dahl und Guldberg 2003). Weiterhin kann es bei zu langer Inkubationszeit zur spontanen Konvertierung von methyliertem Cytosin zu Thymidin kommen, was eine Degradierung der DNA zur Folge haben kann (Dahl und Guldberg 2003).

Neben der Bisulfit-Methode kommen auch die Anreicherung mittels Restriktionsenzymen oder Affinitätschromatografie zur Anwendung. In umfangreichen Genomanalysen lassen sich Methylierungen der DNA durch Mikroarrays, dazugehörigen Kits sowie Hochdurchsatzsequenzierungen untersuchen.

MMR-Analyse

Um Fehlern bei der DNA-Replikation entgegenzuwirken, verfügt der menschliche Körper über verschiedene Reparaturmechanismen. Ein bekannter postreplikativer Mechanismus ist das Mismatch-Repair-(MMR-)System. Basenfehlpaarungen, die durch Fehler in der Replikation entstanden sind, werden korrigiert, um dauerhafte Mutationen zu verhindern (Hsieh und Yamane 2008). Kommt es zur Beeinträchtigung des MMR-Systems, führt dies zu einem gesteigerten Risiko für spontane Mutationen (Hsieh und Yamane 2008). Keimbahnmutationen in den Genen des MMR-Systems sind häufig Ursache eines Lynch-Syndroms, bei dem gehäuft kolorektale und andere Karzinome auftreten (Hsieh und Yamane 2008).

Eine MMR-Defizienz kann in Tumoren, aber auch sporadisch, z. B. durch Methylierung eines MMR-Gens, auftreten. Sie wird i. d. R. zunächst durch immunhistochemische Untersuchungen der vier häufigsten MMR-Proteine (MLH1, PMS2, MSH2 und MSH6) im Tumor nachgewiesen. Der Expressionsverlust eines oder mehrerer MMR-Proteine weist auf eine sporadische oder hereditäre MMR-Defizienz hin (Tab. 1).

Tab. 1

MMR-Protein-Nachweis im Tumor

MLH1	PMS2	MSH2	MSH6	Diagnose	Interpretation
+	+	+	+	MMRS	Keine Mismatch-Repair-Defizienz
−	−	+	+	MMRD	Ca. 90 % sporadische MMRD Ca. 10 % MLH1-Keimbahnmutation
+	−	+	+	MMRD	Verdacht auf selektive PMS2-Keimbahnmutation (selten MLH1-Keimbahnmutation)
+	+	−	−	MMRD	Verdacht auf MSH2-Keimbahnmutation, selten sporadische MSH2-Mutation
+	+	+	−	MMRD	Verdacht auf MSH6-Keimbahnmutation

MMRD, Mismatch-Repair-Defizienz; MMRS, Mismatch-Repair-Suffizienz

Alternativ bzw. bei fehlendem Nachweis eines Expressionsverlustes macht man sich für den Nachweis eines MMR-Defekts sog. Mikrosatellitenloci zunutze. Mikrosatelliten sind repetitive variable Sequenzen von 1–6 Nukleotiden (Zane et al. 2002) und befinden sich in codierenden und nicht codierenden DNA-Bereichen. Aufgrund der Repetition von Basen oder Basenabfolgen sind diese Regionen besonders anfällig für Defekte im MMR-System. Eine Multiplex-PCR-Reaktion von verschiedenen Mikrosatellitenmarkern und der darauffolgenden Analyse der PCR-Produkte ermöglicht durch den Vergleich der Fragmentlängen von Tumor- und Normalgewebe des Patienten eine Aussage zum Mikrosatellitenstatus. Treten variierende bzw. zusätzliche Fragmentlängen auf, ist das entsprechende Probenmaterial als mikrosatelliteninstabil einzustufen. Hierbei gelten die NCI-Kriterien (Boland et al. 1998); bei Instabilität in 2 von 5 getesteten Markern oder in ≥30 % der getesteten Marker spricht man von hochgradiger Mikrosatelliteninstabilität (MSI-H).

PCR-Transkriptionsanalysen (RNA)

Neben der Untersuchung der DNA ist die Analyse der RNA (Transkriptom) ein weiterer Ansatz, um Gewebe hinsichtlich eines potenziell veränderten Expressionsprofils zu analysieren. Die transkriptomweite Analyse lässt Einblicke in Signalkaskaden bis hin zu spezifischen Expressionsmustern zu. Hierfür stehen verschiedene Methoden für die Untersuchung und Quantifizierung der RNA zur Verfügung, die von einfachen PCR-Analysen, komplexeren quantitativen PCR-Methoden über Hybridisierungs- bis hin zu hochauflösenden NGS-Verfahren reichen.

Mittels PCR lassen sich An- und Abwesenheit von Transkripten zwischen einem zu untersuchenden Gewebe und einem Referenzgewebe nachweisen. Dabei sind zwei Faktoren entscheidend: Zum einen muss das Transkript oder das interessierende Gen sequenzgenau bekannt sein, zum anderen muss die korrespondierende RNA aus dem Gewebe isoliert und extrahiert werden. Dabei wird die statische Eigenschaft von RNA ausgenutzt sowie die Möglichkeit, sie über Säulenchromatografie oder Phenol-Chloroform-Extraktion von DNA und Proteinen bzw. Lipiden zu isolieren. Im Anschluss wird die mRNA in stabilere DNA, sog. copy DNA (cDNA), umgeschrieben. Diese dient in der PCR als Template, um Amplifikate von nachzuweisenden Genen zu synthetisieren; daher wird das Verfahren als reverse Transkriptions-(RT-)PCR bezeichnet. Über einfache Gelelektrophorese können die Amplifikate sichtbar gemacht werden. Dabei handelt es sich ausschließlich um eine qualitative Analyse. Eine Aussage über die Quantität des zu untersuchenden RNA-Transkripts ist nicht möglich (Costa et al. 2013a). Eine parallele Untersuchung von mehreren Gentranskripten in einem Multiplex-PCR-Ansatz wird auch als Multigen-RT-PCR bezeichnet (Zehentner et al. 2002).

Eine modernere Methode, die auch eine Quantifizierung des Transkriptes ermöglicht, ist die quantitative RT-PCR (qPCR oder Realtime-PCR). Die qPCR ist mittlerweile Standard für die quantitative Analyse der differenziellen Genexpression in verschiedenen Geweben (Taylor et al. 2010). Eine wichtige Vorrausetzung dabei ist, wie auch bei der klassischen RT-PCR, RNA von guter Qualität zu präparieren und vor der cDNA-Synthese durch DNAse-Behandlung die Abwesenheit von genomischer DNA sicherzustellen. Hohe Primerspezifität und ideale Annealingtemperatur für jedes Transkript werden durch höchste Amplifikation in der Amplifikationskurve und nur einen Peak in der Schmelzkurve ermittelt. Die qPCR ist eine relativ anspruchsvolle Methode, bei der viele Faktoren beachtet werden müssen, um valide Ergebnisse zu generieren (Udvardi et al. 2008; Bustin et al. 2009). Aktuell kommen vor allem Multiplex-qPCR-Verfahren zum Einsatz, bei denen durch Multifluoreszenz die Analyse von mehreren Gentranskripten in einem parallelen Ansatz möglich ist (Moltzahn et al. 2011).

Eine maximale PCR-Parallelisierung im Hochdurchsatz stellt ein weiteres aktuelles PCR-Verfahren dar. Bei der sog. digitalen PCR (ddPCR) kann eine absolute Quantifizierung von DNA in einem hochdichten parallelen Ansatz von bis zu mehreren Millionen PCR-Ansätzen durchgeführt werden. Das ermöglicht z. B. die Detektion von CNV in Genen oder die Detektion von sehr seltenen und in geringer Frequenz vorkommenden Allelen. Zudem ist auch eine Quantifizierung von Nukleinsäuren möglich (Lun et al. 2008; Hindson et al. 2011, 2013).

RNA-Sequenzierung

Mittels NGS kann neben dem gesamten Genom, dem vollständigen Exom oder verschiedenen Genpanels auch das gesamte Transkriptom (RNA) sequenziert werden. Dies eröffnet zusätzlich zu der Analyse von Genvarianten auf Ebene der DNA wie beispielsweise SNV, InDel, CNV, SV die Detektion von Veränderungen in der Genexpression und damit Rückschlüsse auf eine veränderte Genaktivität. Damit stellt die RNA-Sequenzierung eine Brücke zwischen der Analyse von DNA-Varianten und dem Phänotyp einer Zelle oder eines Gewebes dar (Wang et al. 2009; Ozsolak and Milos 2011; Costa et al. 2013b; Hrdlickova et al. 2017).

Mittlerweile stehen verschiedene Protokolle und Kits für die RNA-Isolation aus Frisch- und FFPE-Material zur Verfügung (Schleifman et al. 2014). Dies ist eine wichtige Voraussetzung, um eine ausreichende Tiefe bei der RNA-Sequenzierung zu gewährleisten, mit der auch seltene RNA-Transkripte detektiert werden. Um einen Bias in der Transkriptomanalyse zu vermeiden, müssen RNA-Sequenzierduplikate in der bioinformatischen Auswertung berücksichtigt werden (Conesa et al. 2016).

Es existieren unterschiedliche Möglichkeiten der Transkriptomsequenzierung, wie z. B. die Sequenzierung der gesamten RNA-Fraktion, der Sequenzierung aller RNA-Moleküle abzüglich der ribosomalen RNA-Transkripte oder die ausschließliche Sequenzierung von RNA-Transkripten aller proteincodierenden Bereiche (Chomczynski und Sacchi 2006; Cui et al. 2010). Neben der Sequenzierung des gesamten Transkriptoms stehen auch Kits zur selektiven Sequenzierung von definierten Gentranskripten zur Verügung. So können Sequenzieraufwand und -kosten verringert werden (Mercer et al. 2011; Zheng et al. 2014).

Die Transkriptomsequenzierung dient vor allem der Detektion differenzieller Genexpression zwischen zwei Geweben (z. B. Normalgewebe vs. Tumorgewebe) (Oshlack et al. 2010; Tarazona et al. 2011; Trapnell et al. 2013). Das ermöglicht, differenziell exprimierte Gene als therapeutisches Target oder als Ursache von Resistenzen gegen Therapien zu erkennen (Xu et al. 2000; Holzbeierlein et al. 2004; Wachi et al. 2005). Darüber hinaus ist es möglich, differenziell exprimierte Gene mit Signalwegen zu korrelieren, in denen diese Gene involviert sind. Durch diese sog. Pathway-Analysen lassen sich ganze Signalketten detektieren, die eine veränderte Aktivität im untersuchten Gewebe aufweisen. Daraus können Therapiestrategien abgeleitet werden, auch wenn das differenziell exprimierte Gen per se aktuell nicht „drugable“ ist, jedoch der durch dieses differenzielle exprimierte Gen modifizierte Signalweg therapierbar ist, z. B. über weitere in diesen Signalweg involvierte Gene (Bild et al. 2006).

Veränderte Gentranskripte können auch aufgrund von modifizierten Splicing-Prozessen in Tumorgewebe vs. Normalgewebe erfasst werden (Trapnell et al. 2009). Diese modifizierten Gentranskripte können eine abweichende Funktion des translatierten Proteins zur Folge haben und damit eine Veränderung des biologischen Verhaltens und des Phänotyps nach sich ziehen (Tazi et al. 2009). Zusätzlich sind Modifikationen der RNA, das sog. RNA-Editing, das einen Effekt auf die Proteinfunktion haben kann, nachweisbar (Jinek et al. 2013).

Darüber hinaus können Translokationen nachgewiesen werden, wenn diese in transkribierten genomischen Regionen (wie z. B. in Genen) lokalisiert sind (Levin et al. 2009). Da Genfusionen als spezieller Typus einer Translokation in einem Gen eine veränderte Genexpression dieses Gens zur Folge haben können, ermöglicht die Transkriptomsequenzierung nicht nur die entsprechende Identifikation dieser Translokation, sondern auch die Analyse hinsichtlich der differenziellen Expression des betroffenen Gens (Nacu et al. 2011).

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Sequenzierung und Analyse von regulatorisch wirksamen kleinen RNA-Molekülen („small RNA“) und nicht codierenden langen RNA-Molekülen („long non coding RNA“). Vor allem in den letzten Jahren wurde die Vielfalt dieser RNA-Spezies und ihr vielschichtiger und grundlegender Einfluss auf die Regulation der Genexpression und des Phänotyps von Zellen und Geweben deutlich (Esteller 2011; Spizzo et al. 2012).

Analysen auf zellulärer Ebene

DNA-In-situ-Hybridisierung

Um strukturelle sowie numerische chromosomale Veränderungen in Zellen oder Geweben quantitativ nachweisen zu können, verwendet man die In-situ-Hybridisierung (ISH) entweder mit Fluoreszenz- (FISH) oder Chromogen-markierten Sonden (CISH). Mit der ISH-Methode ist es möglich, Gene oder andere DNA-Sequenzen in Chromosomen direkt zu lokalisieren und auch kleinste Chromosomenaberrationen (<100 Basen) von Tumorzellen sowohl an frischen als auch an FFPE-Proben und Ausstrichpräparaten in Interphasekernen und Metaphasen zu detektieren. Diese Methode wurde durch eine ständige Verbesserung der Protokolle und Sonden zu einem der wichtigsten Werkzeuge in der Molekularpathologie.

Hier wird fast ausschließlich mit DNA-Sonden gearbeitet. Die gesuchte Zielsequenz wird „in situ“ mit zur Ziel-DNA-Region komplementären und markierten Sonden nach DNA-Denaturierung (Hitze/Säure) nachgewiesen, die sich während des Vorgangs der Hybridisierung direkt an die gesuchte Zielsequenz binden. Diese Sonden können direkt oder indirekt mit einem Fluorochrom markiert sein, das durch Lichtanregung sichtbar gemacht wird. Mittels verschiedener Fluorochrome kann zusätzlich die Zentromerregion des untersuchten Chromosoms identifiziert und quantifiziert werden. Mittels (F)ISH-Analysen lassen sich Genamplifikationen (z. B. Her-2neu; vgl. Abb. 3a) oder auch Gentranslokationen (z. B. ALK, ROS) untersuchen.

Durchgeführt wird die (F)ISH an ca. 4 μm dicken Paraffinschnitten, die auf oberflächenbehandelte Objektträger aufgezogen werden. Um unspezifische Bindungen der Sonde im FFPE-Gewebe zu unterdrücken, ist eine Vorbehandlung und ein anschließender Protease/Proteinase-Verdau erforderlich. Dies erleichtert das Eindringen der Sonde ins Gewebe mit gleichzeitiger Stabilisierung der Zielsequenz. Nach Auftragen der Sonde erfolgt zunächst einer Denaturierung der Ziel- und der Sonden-DNA mit anschließender Hybridisierung. Eine Kerngegenfärbung schließt die Reaktion ab. Die Auswertung erfolgt mittels Fluoreszenzmikroskops mit geeigneten Filtern (FISH) bzw. am Durchlichtmikroskop (CISH). Nachteilig kann sich die Schnittdicke auswirken, die bei zu dünnen Schnitten einen Verlust von chromosomalem Material zur Folge hat; unter Umständen ist daher auch in Normalzellen eine Dysbalance der Signale zu verzeichnen. Deshalb sind ein qualitätsgesichertes Protokoll und ein für jede Sonde festgelegter prozentualer Cut-off-Wert für als pathologisch zu wertende chromosomale Veränderungen essenziell für die Anwendung der FISH/CISH.

Translokationen sind chromosomale Veränderungen, die durch den Transfer von Teilstücken innerhalb eines Chromosoms bzw. zwischen verschiedenen Chromosomen entstehen. Dies kann zu Störungen oder Fehlregulationen der normalen Genfunktion führen. So können z. B. Protoonkogene zu Onkogenen aktiviert werden. Häufige Translokationen finden sich bei Leukämien (z. B. bcr-abl-Translokation bei der CML), Lymphomen (z. B. t(14;18) bei follikulären Lymphomen) und Sarkomen (z. B. EWS t(11;22) bei Ewing-Sarkom/PNET) (vgl. Abb. 3b), aber auch bei verschiedenen Karzinomen (z. B. EML4-ALK-Fusionsonkogen beim nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, NSCLC).

Um Translokationen nachweisen zu können, werden z. B. „Break apart“-Sonden eingesetzt, die durch mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen versehene Sonden die Möglichkeit eröffnen, die Lage der Bruchpunktsignale zu detektieren und einen der beiden Translokationspartner nachzuweisen. Bei einer Normalzelle kann man so entweder gelbe Mischsignale oder eng zusammengelagerte rot-grüne Signale erkennen. Sollte eine Translokation vorliegen, wird pro Zellkern ein Mischsignal des intakten Chromosoms sowie je ein räumlich deutlich getrenntes rotes und grünes Signal erwartet. Vice versa detektieren „Fusionssonden“ durch eine selektive Farbänderung der eng zusammengelagerten Bruchpunkte das entsprechende Fusionsgen.

Es bleibt abzuwarten, in welchem Umfang die ISH-Diagnostik durch spezielle NGS-Verfahren, die die Detektion von Amplifikationen und strukturellen Aberrationen zulassen, abgelöst wird.

RNA-In-situ-Hybridisierung

Während die PCR-basierten Methoden zur RNA-Analyse keine direkte morphologische Korrelation zulassen, ist dies mittels der RNA-In-situ-Hybridisierung (ISH) möglich. Sie basiert auf einem ähnlichen Prinizip wie die DNA-In-situ-Hybridisierung, wobei die Kontamination mit RNAsen und die geringere Stabilität der RNA größere Herausforderungen darstellen (Cox et al. 1984).

Es liegen standardisierte Verfahren vor, die jedoch jeweils an die spezifische Gewebeart angepasst werden müssen (Pollard et al. 2006; Wang et al. 2012). Das Besondere an dieser Technik ist die Verwendung von komplexen Farbgerüsten, sog Amplifier Trees, die spezifisch an die RNA-Sequenzen hybridisieren. Diese Methodik erfordert höchste Präzision und sollte stets durch Mitführen von Positivkontrollen auf ihre Spezifität geprüft werden.

Proteinanalytik

Immunhistologie

Den höchsten Stellenwert für den Nachweis von Proteinen in der pathomorphologischen Tumordiagnostik besitzt die Immunhistochemie (IHC). Die IHC ist ein bereits seit Jahrzehnten etabliertes Verfahren. Sensitivität und Spezifität der IHC wurden im Laufe der Zeit immer weiter verbessert. Die Indikationen für die IHC in der Tumorpathologie sind die genauere Tumorklassifikation durch Phänotypisierung und – in gewissen Grenzen – bei klinisch unklarem Primarius (sog. CUP-Syndrom) die Möglichkeit, auf eine Primärtumorlokalisation zurückzuschließen.

Zur Prädiktion eines Therapieansprechens kommen semiquantitative IHC zum Einsatz, z. B. für die Her2/neu-Überexpression in Tumorzellen oder die PD-L1-Expression in Tumor- und/oder Immunzellen. Seit Kurzem stehen mutationsspezifische Antikörper zur Verfügung, mit denen spezifisch aberrante Proteine markiert werden können, z. B. für BRAF V600E. Aufgrund der breiten Verfügbarkeit der IHC mit ganz unterschiedlichen Plattformen (manuell, halb-/vollautomatisiert) ist jedoch die kontinuierliche (externe) Qualitätssicherung der Ergebnisse, z. B. durch die Teilnahme an Ringversuchen (s. oben), für die Patientensicherheit essenziell.

Methodisch kann je nach Tumorart auf ein Panel von Antikörpern, die spezifisch nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip an ein tumoreigenes Protein, i. S. eines Antigens, binden, zugegriffen werden. Der Antikörper selbst trägt beim direkten Verfahren bereits das Chromogen, wodurch die Antigen-Antikörper-Reaktion visualisiert werden kann (Nakane et al. 1968).

Um eine Amplifikation des Signals zu erreichen, kommt eine indirekte Methode zum Einsatz, die auf Bindung eines primären und sekundären Antikörpers basiert. Die indirekten Techniken, z. B. die „Labelled (Strept-)Avidin-Biotin“ -(LSAB-)Methode ist dabei die am besten standardisierte und am weitesten verbreitete Methode (Chilosi et al. 1994). Andere Methoden ähneln dieser Technik, sind aber in Bezug auf den Sekundärantikörper-Chromogen-Komplex unterschiedlich (z. B. das Avidin-Biotin-Complex“-[ABC-]Verfahren oder die Tyramid-Bindung). Weitere Techniken nutzen affine Bindungen des Sekundärantikörpers mit dem Substratkonstrukt durch Bindung von Polymeren (Sabattini et al. 1998). Durch die verstärkte Automatisierung von Labortechniken wurde in den immunhistologischen Abteilungen in den letzten Jahren eine Prozessoptimierung vor allem im Hinblick auf Standardisierung und Zeitbedarf.

Massenspektrometrie und MALDI-Imaging

Neben der spezifischen Detektion von einzelnen Proteinen ist das Ziel der Proteomanalyse (Proteomics), das Gesamtbild der exprimierten Proteine zu detektieren. Neben verschiedenen Methoden der Grundlagenforschung für die Massenspektrometrie ist die matrixassistierte laserbasierte Desorption und ionisierungsbasierte Bildgebung (MALDI-Imaging) eine Kombination aus Massenspektrenanalyse und Histologie (Seeley et al. 2011). Diese vielversprechende neue, gewebsbasierte Technik könnte möglicherweise in der Zukunft die Immunhistochemie ergänzen oder gar verdrängen.

Bei diesem Verfahren kann basierend auf einem Gewebsschnitt eine Matrix auf dem getrockneten Gewebe aufgetragen werden, die eine anschließende gleichmäßige Ionisierung der Proteine ermöglicht. Die Präparate werden in ein Hochvakuum eingebracht und mittels einer optischen Vorrichtung manuell vermessen. Darüber wird die interessierende Region (ROI) für die anschließende Analyse bestimmt. Die daraufhin mit einem Laser beschossenen Gewebsfragmente werden in das Vakuum desorbiert. Die Flugzeit aller Peptidmoleküle in dem Spannungsfeld des Flugrohrs wird vermessen und aufgezeichnet. Die resultierenden Massenspektren können regionsspezifisch verglichen werden. Eine Abgrenzung von Tumor- gegenüber Normalgewebe ist möglich. Zudem können Subtypen einzelner Tumorentitäten voneinander abgegrenzt und klassifiziert werden (Groseclose et al. 2008).

Ein weiteres, vielversprechendes Analyseverfahren ist die Segmentierung des gemessenen Gewebes. Auf Basis der Intensitäten der verschiedenen Massenpeaks wird eine Gruppierung in Form einer hierarchischen Verästelung von jeweils zwei differenzierbaren Gruppen („cluster“) berechnet (Alexandrov et al. 2010). Die so segmentierten Gruppen eines vermessenen Gewebes geben Aufschluss über die jeweilige intra- und intertumorale Heterogenität.

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