5′/3′-RACE-PCR
5′/3′-RACE-PCR
Synonym(e)
Rapid Amplification of cDNA Ends
Englischer Begriff
5′/3′-RACE-PCR; rapid amplification of cDNA ends
Definition
RACE-PCR ist eine Sonderform der PCR zur „Rapid Amplification of cDNA Ends“, die eingesetzt wird, um bei unbekannten, oftmals unvollständigen mRNA-Transkripten bzw. cDNAs das fehlende 5′- aber auch 3′-Ende zu identifizieren.
Beschreibung
Bei der 5′-RACE-PCR geht man von der bekannten Teilsequenz der cDNA aus und synthetisiert einen Antisense-Primer, den man in eine unidirektionale PCR (Polymerase-Kettenreaktion) mit der cDNA einsetzt, um das 5′-Ende als DNA-Strang zu synthetisieren. Durch Einsatz des Enzyms TdT („terminale deoxynucleotidyl transferase“) und entsprechenden Nukleotiden wird dem 5′-Ende ein Homopolymer-Ende, z. B. Poly(G), angefügt. Im nächste Schritt wird eine PCR-Reaktion mit einem Antisense-Primer, der in der bekannten cDNA-Sequenz etwas weiter in 5′-Richtung liegt, und einem Sense-Primer (sog. Adaptor-Primer) durchgeführt, der dem Poly(G)-Tail des neu synthetisierten 5′-Endes reziprok ist, d. h. poly(C) enthält. Das nun in großer Zahl vermehrte 5′-Ende kann nun entweder kloniert oder direkt sequenziert werden.
Die 3′-RACE-PCR läuft ähnlich, lediglich, dass man Sense-Primer für die bekannte cDNA-Sequenz einsetzt und als Homopolymer am 3′-Ende direkt auf den Poly(A)-Schwanz des Transkripts zurückgreifen kann und einen Poly(T)-Antisense-Primer (Adaptor-Primer) für die PCR-Reaktion einsetzt.