Antikörper, monoklonale Erzeugung

production of monoclonal antibodies

Von einem B-Zell-Klon produzierte monoklonale Antikörper (Abb. 1).

Monoklonale Antikörper werden von einem B-Zell-Klon produziert. Daher sind Immunglobulin-(Sub-)Klasse und Antigenspezifität identisch.

Für die von den Nobelpreisträgern Köhler und Milstein ausgearbeitete Herstellung solcher Antikörper wird zunächst ein Tier mit einem spezifischen Antigen immunisiert (Köhler, Georges Jean Franz; Milstein, Cesar). Anschließend werden Plasmazellen dieses Tieres isoliert und mit Zellen einer nicht antikörperproduzierenden Myelomzelllinie derselben Tierart, die einen bestimmten Enzymdefekt (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Mangel) hat, inkubiert. Dem Inkubationsansatz werden eine oberflächenaktive Substanz (z. B. Polyethylenglykol) und ein Virus (z. B. Sendai-Virus) zugesetzt. Unter Wirkung dieser Reagenzien fusionieren zunächst Zell-, später auch Kernmembranen der beiden unterschiedlichen Zellarten. Obwohl viele dieser Hybridzellen Erbinformationen verlieren, bestehen doch einige Zellen mit den genetischen Informationen sowohl der Antikörperproduktion als auch der Malignität (Immortalisierung) fort. In einem weiteren Schritt müssen die proliferierenden immortalisierten (antikörperproduzierenden) Zellen von den übrigen getrennt werden. Dazu kultiviert man sie in einem speziellen Zellkulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthält. Nur die Zellen, die den Enzymdefekt haben (also auch Antikörper produzieren) und gleichzeitig proliferieren, sind in diesem Medium überlebensfähig. Vorhandene Plasmazellen sterben durch Hemmung der Purinsynthese ab. Die nun entstandenen Hybridomklone werden voneinander getrennt und mit immunologischen Tests (z. B. Enzyme-linked Immunosorbent Assay) auf vorhandene Antikörperproduktion und deren Spezifität getestet. Nach Isolation eines gewünschten Zellklons können nun große Mengen Antikörper hergestellt werden, solange die Zelllinie die genetische Information enthält.

Da monoklonale Antikörper mittlerweile neben dem breiten Einsatz in immunologischen Testsystemen auch zur Diagnostik und Therapie humaner Tumoren eingesetzt werden, besteht der Bedarf von humanen oder humanisierten monoklonalen Antikörpern.

Eine Methode zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper bedient sich bestimmter Stämme von Knock-out-Mäusen, denen die Gene zur endogenen Produktion von Immunglobulinen fehlen. Integriert man die Gene zur Herstellung humaner Schwer- und Leichtketten in bestimmte Hefen, kann diese Information über die Hefechromosomen in Mäuse eingebracht werden. Es entstehen transgene Tiere. Die B-Zellen dieser Mäuse exprimieren dann humane Immunglobulingene, sind jedoch nicht tolerant gegenüber den meisten humanen Proteinen. Somit sind sie zur Produktion monoklonaler Antikörper gegen Epitope oder Proteine humaner Zellen fähig.

Seit kurzer Zeit besteht eine weitere Möglichkeit, humane monoklonale Antikörper mit gentechnologischen Methoden herzustellen. Dazu werden die für die antigenbindende v-Region von Immunglobulinmolekülen kodierenden Gene mit Genen für Hüllproteine von Bakteriophagen fusioniert. Zur Vermehrung der Phagen werden Bakterien infiziert, die Phagenpartikel, deren Hüllen auch die antikörperähnlichen Strukturen aufweisen, produzieren („phage display library“). Mittels immunologischer Methoden werden die Phagen analog der Hybridomzellen auf die Spezifität der antikörperähnlichen Moleküle untersucht. Nach Isolation der betreffenden Phagen werden diese weiter in Bakterien vermehrt und die DNA isoliert. Aus den entsprechenden Bruchstücken der Phagen-DNA und in ähnlicher Weise produzierten DNA-Fragmenten, die für konstante Regionen der (humanen) Immunglobulinmoleküle kodieren, werden Antikörpergene konstruiert und analog zu den in Tieren produzierten Antikörpern in entsprechende Zelllinien überführt.

Humanisierte monoklonale Antikörper werden unter Verwendung von murinen v-Regionen, die mit konstanten Bruchstücken humaner Antikörper gekoppelt werden, hergestellt.