Biuretmethode

biuret method

Methode zur quantitativen Proteinbestimmung. Kupfer(II)-Ionen bilden im alkalischen Reaktionsansatz mit Peptidbindungen von Tri-, Oligo-, Polypeptiden (Polypeptide) und Proteinen rötlich violette Chelatbindungen. Die Extinktion des Reaktionsansatzes ist der Zahl der Peptidbindungen proportional (Gesamtproteinbestimmung).

Ein Kupferion komplexiert mit 4 (6) Peptidbindungen. Im Reagens sind Kupfersulfat, Natrium-Kalium-Tartrat, Kaliumiodid und Natronlauge enthalten. Im alkalischen Milieu bildet Cu²⁺ einen Tartratkomplex, Kaliumiodid verhindert die Autoreduktion von Cu²⁺. Die Reaktionsmischung besteht bei Serumanalysen in der Regel aus einem Volumenteil Serum und 50 Teilen Reagens. Nach 30 Minuten wird die Absorption bei 546 nm gemessen. Für die Gesamtproteinbestimmung im Serum benutzt man Reagens mit niedrigen NaOH-Konzentrationen von 0,1–0,4 mol/L und hohen Kupfersulfatkonzentrationen (10–30 mmol/L). Man erreicht damit einen Interassay-VK von <2 %.

Proben mit sehr niedriger Proteinkonzentration werden mit einem Reagens mit hoher NaOH-Konzentration von 0,5–0,8 mol/L und niedriger CuSO₄-Konzentration (4–6 mmol/L), das einen niedrigen Reagensblindwert erzeugt, analysiert. Um eine niedrige Nachweisgrenze zu erreichen, wird ein höheres Volumen von Prüfflüssigkeit von z. B. 1 Teil Prüfflüssigkeit und 4 Teile Reagens gewählt. So können proteinhaltige Lösungen (aus chromatografischen Trennverfahren) in einem Bereich von 1–150 mg/L Gesamtprotein bestimmt werden.

Urin enthält Chromogene, welche die Farbreaktion stören können. Im Liquor sind dies Peptide. Deshalb werden die Proteine von Urin und Liquor vor der Bestimmung von den störenden Substanzen durch Säurefällung mit Perchlorsäure getrennt und dann erst mit Biuretreagens versetzt. Der Konzentrierungseffekt erhöht zusätzlich die Empfindlichkeit (Nachweisgrenze). Störfaktoren und Maßnahmen zu deren Beseitigung sind:

Referenzmethode für die Bestimmungen von Protein, gesamt im Serum (Plasma), da die Einzelproteine sehr gleichmäßig erfasst werden. Albumin weist nahezu den gleichen Extinktionskoeffizienten wie γ-Globulin auf. Für Urin ist die Nachweisgrenze zu hoch, um Proteinkonzentrationen im Normalbereich sicher zu erfassen. Für Urin und Liquor ist der Aufwand für den Fällungsschritt hoch. Farbstoffbindungsmethoden wie die Pyrogallolrotmethode weisen die genannten Nachteile nicht auf, dabei kommt die Pyrogallolrotmethode der Biuretmethode in Bezug auf die gleichmäßige Erfassung der Einzelproteine nahe.