Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik
Autoren
T. Arndt

Dünnschichtchromatographie

Dünnschichtchromatographie
Synonym(e)
DC
Englischer Begriff
thin layer chromatography; HPTLC; high performance thin layer chromatography
Definition
Eine Form der Planarchromatografie (Chromatographie), bei der die stationäre Phase auf einem ebenen Träger, oft einer Aluminiumfolie oder Glasplatte, fixiert ist.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Der Transport der flüssigen mobilen Phase (Mobile Phase) beruht auf Kapillarkräften in der stationären Phase und die chromatografische Trennung auf der unterschiedlich stark ausgeprägten, wiederholten Adsorption und Desorption der Probenbestandteile an der stationären Phase (z. B. Kieselgel, Al2O3).
Starke Wechselwirkungen führen zu einem verzögerten Transport der Substanz mit der mobilen Phase, d. h. einer relativ kurzen Laufstrecke (Distanz zwischen Probenaufgabestelle und Position in der Dünnschichtplatte nach der Chromatografie). Eine geringe Affinität zur stationären Phase führt zu vergleichsweise längeren Laufstrecken. Diese betragen gewöhnlich mehrere Zentimeter und sind unter definierten Bedingungen gut reproduzierbar. Die Laufstrecke ist deshalb ein wichtiges Kriterium für die Zuordnung von Fraktionen des Chromatogramms zu Substanzen oder Substanzgruppen. Zusätzlich wird in mindestens einer Spur in der DC-Platte (Standardspur) ein Gemisch von Referenzsubstanzen bekannter Konzentration getrennt.
Der Vergleich der Laufstrecken der Referenzsubstanzen mit jenen der Fraktionen aus den Patientenproben erlaubt dann eine relativ sichere Identifikation der Fraktionsbestandteile. Zusätzliche Informationen zur Substanzidentifikation liefern sog. Rf-Werte. Der Rf-Wert ist definiert als das Verhältnis der Laufstrecke einer Komponente (Distanz zwischen Probenaufgabestelle und Position der Komponente in der DC-Platte; auch Wanderungsstrecke genannt) zur Laufstrecke des Fließmittels (Distanz zwischen Probenaufgabestelle und [oberster] Front der mobilen Phase).
Oft ist die Lage der einzelnen Substanzen und Substanzgruppen in der Dünnschichtplatte nicht unmittelbar zu erkennen. Sie werden durch UV-Strahlung oder Derivatisierung mit Färbereagenzien (Tauchen oder Besprühen der DC-Platte) sichtbar gemacht.
Einsatzgebiet
Die Dünnschichtchromatographie ist hervorragend zur Trennung von komplexen Proben mit stark variierender Zusammensetzung wie z. B. Mageninhalt und Drogenpräparate geeignet (Übersichtsanalyse). Mit Einführung der HPLC ist ihre Bedeutung im klinisch-chemischen Labor kontinuierlich zurückgegangen. Ihr Einsatz beschränkt sich heute auf Spezialanalysen wie z. B. die Trennung der im Urin ausgeschiedenen Oligosaccharide.
Untersuchungsmaterial
Blut und seine Präparate, Haarextrakte, Mageninhalt, Stuhlextrakte, Urin, Präparationen von Medikamenten und Drogen.
Instrumentierung
Die Dünnschichtchromatographie ist eine apparativ wenig aufwendige Analysenmethode. Eine Dünnschichtplatte (DC-Platte), eine Trennkammer (ggf. ein Becherglas) und eine UV-Lampe oder eine Sprühflasche zum Derivatisieren/Färben der Fraktionen sind oft ausreichend.
Die Dünnschichtplatte wird in mehrere Bahnen (Spuren) untergliedert (Abb. 1). Dabei entspricht die Zahl der Bahnen der auf einer Platte zu analysierenden Probenanzahl. Nach dem Auftragen der Proben in gewissem Abstand vom unteren Rand der DC-Platte findet in einer Trennkammer (Entwicklungskammer, Elutionskammer) die chromatografische Trennung (Elution) statt. Die mobile Phase ist ein auf die jeweilige Anforderung optimiertes Lösungsmittelgemisch. Die Elution erfolgt zumeist aufsteigend, d. h., die mobile Phase steigt getrieben durch Kapillarkräfte in der stationären Phase auf. Sie erreicht dabei die Linie der Auftragstellen, löst die Probenbestandteile aus diesen heraus und transportiert sie in Abhängigkeit von deren Affinität zur stationären Phase unterschiedlich weit von der Auftragsstelle weg.
Abschließend werden die oft noch unsichtbaren Substanzen oder Substanzgruppen durch UV-Bestrahlung oder Derivatisieren/Anfärben sichtbar gemacht und ggf. mit einem Densitometer qualitativ oder quantitativ ausgewertet.
Von Bedeutung für sehr komplexe Gemische ist die zweidimensionale Dünnschichtchromatographie. Hier werden die Probenbestandteile zunächst wie beschrieben getrennt. Anschließend wird die DC-Platte um 90° gedreht, einer zweiten chromatografischen Trennung (ggf. mit einem anderen Fließmittel) unterworfen und entwickelt.
Besonders leistungsfähige Varianten der Dünnschichtchromatographie werden auch als Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie („high performance thin layer chromatography“, HPTLC) bezeichnet.
Varianten mit horizontaler (ggf. durch Pumpen beschleunigter) Elution oder radialer Elution sind in der Spezialliteratur beschrieben.
Spezifität
Die Spezifität der Methode hängt stark von der analytischen Fragestellung ab. Sie kann durchaus jene der GC-MS oder HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie), in keinem Fall aber jene einer valide durchgeführten Massenspektrometrie (MS) erreichen.
Sensitivität
Auch die Sensitivität ist verfahrensabhängig. Konzentrationen im μg/L-Bereich sind gut nachweisbar.
Fehlermöglichkeit
Unter der Voraussetzung optimierter Trennbedingungen ergeben sich folgende für die Dünnschichtchromatographie charakteristische Fehlerquellen:
  • Ein zu nah an der Plattenkante positionierter Probenauftrag und dadurch vollständiges oder partielles Auswaschen der Probenbestandteile schon beim Eintauchen der DC-Platte in das Fließmittel (→ Probenverlust und/oder unscharf begrenzte Startposition)
  • Verdampfen (von Komponenten) des Fließmittels durch Alterung oder eine nicht abgedeckte Trennkammer (→ nicht standardisierte chromatografische Bedingungen)
  • Unvollständige Derivatisierung/Anfärbung der Fraktionen (→ Übersehen einzelner Fraktionen und/oder schwankende Wiederfindung)
  • Koelution von Analyten und (unbekannten) Begleitstoffen mit ähnlichen Eigenschaften unter UV-Bestrahlung und/oder beim Derivatisieren/Anfärben (→ z. B. falsch positive Drogennachweise)
  • Ausbleichen der gefärbten Fraktionen bei Lagerung (→ z. B. falsch negative Drogennachweise bei zu später Auswertung)
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Die Dünnschichtchromatographie ist eine einfache, schnelle, preiswerte und aussagekräftige Analysenmethode. Maßnahmen zur Mechanisierung können den Probendurchsatz erhöhen, bedeuten aber gleichzeitig einen deutlichen Kostenanstieg und den Verlust der für die DC geschätzten Geräteunabhängigkeit.
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Die DC gehört(e) zum Standardprogramm eines analytischen Labors. Geräteunabhängigkeit und damit unmittelbare Verfügbarkeit bei geringstem Platzbedarf, hoher Praktikabilität und Robustheit qualifizieren sie noch heute als wertvolle Methode zur Übersichtsanalyse von Proben stark variierender Zusammensetzung wie Mageninhalt.
Im klinisch-chemischen Labor wurde die DC fast vollständig durch die HPLC abgelöst.
Literatur
Jork H, Funk W, Fischer W et al (Hrsg) (1989) Dünnschichtchromatographie, Bd 1–3. VCH, Weinheim