ECLIA, auch als ECL-Verfahren bezeichnet, verbindet die Vorteile der Biotin-Streptavidin-Fixierung (Biotin-Streptavidin-Technik) eines Reaktionspartners der Antigen-Antikörper-Reaktion an magnetische Mikropartikel mit einem als Elektrochemilumineszenz bezeichneten hochsensitiven Detektionsverfahren. Dabei ist an den zu bestimmenden Immunkomplex als Tracer Ruthenium-(II)-tris(bipyridyl)2+ (Abkürzung: [Ru(bpy)3]2+) gekoppelt. Der Ruthenium-(II)-tris(bipyridyl)-Komplex gibt in einer Redoxreaktion an einer Anode mithilfe von sich verbrauchendem Tripropylamin (TPA) Licht der Wellenlänge 620 nm ab, wobei der Rutheniumkomplex selbst nicht verbraucht wird.
Es handelt sich um einen Sandwich-Immunoassay (Abb. 1). Zunächst werden die biotinylierten und die Rutheniumkomplex-konjugierten Antikörper bei 37 °C mit der Probe inkubiert. Dann erfolgt die Zugabe der Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Partikel, und die Inkubation wird fortgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in die Durchflussmesszelle gesaugt.
Abb. 1
Prinzip des Elektrochemilumineszenz-Immunoassays
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Detektion:
In der Messzelle zieht ein Magnet, der sich unterhalb der Anode befindet, die paramagnetischen Partikel mit den biotinylierten Reaktanden an:
Partikel, die keinen Analyten gebunden haben oder
mit gebundenem Analyten und Zweitantikörper mit konjugiertem Rutheniumkomplex.
Die Konzentration des zu messenden Analyten bestimmt den Anteil der gebundenen Rutheniumkomplexe an der Anode. Jetzt strömt Procell (eine Tripropylamin-[TPA-]haltige Pufferlösung durch die Messzelle, wodurch alle ungebundenen Partikel wie unfixierter Ruthenium-Tracer aus der Messzelle entfernt werden.
Anschließend wird die Reaktion durch Anlegen einer Spannung ausgelöst: Innerhalb von 0,4 Sekunden findet an der Anode die Aktivierung der Rutheniumkomplexe mit Hilfe von TPA statt, was sich im steigenden Aussenden von Lichtquanten der Wellenlänge 620 nm zeigt. Diese werden in einem Fotomultiplier in 100 Messungen registriert und zur Datenreduktion summiert.
Die Erzeugung des Lichtes an der Platinanode wird durch das Anlegen einer Spannung ausgelöst. Die Spannung führt zur Abgabe eines Elektrons eines Protons durch TPA , wodurch ein TPA-Radikal entsteht. Der Rutheniumkomplex mit dem Analyten wird ebenfalls an der Anode zum [Ru(bpy)3]3+ oxidiert. Dieser oxidierte Komplex übernimmt vom TPA-Radikal das freie (energiereiche) Elektron, wird dabei sowohl zum [Ru(bpy)3]2+ reduziert, aber gleichzeitig durch Energietransfer in einen angeregten (energiereichen) Zustand überführt. Dieser Zustand ist labil und fällt unter Abgabe eines Photons der Wellenlänge 620 nm in den Grundzustand [Ru(bpy)3]2+ zurück. TPA wird dabei verbraucht, nicht aber der Rutheniumkomplex.
TPA wird im großen Überschuss verwendet, sodass die Lichtausbeute durch die Diffusion des TPA bestimmt wird und in der Praxis nach Durchschreiten eines Maximums <0,4 Sekunden nach Messbeginn langsam abnimmt. Nach der Messung wird die Messzelle mit Reinigungslösung ausgewaschen und die Elektrodenoberfläche durch mehrfache Spannungsänderung regeneriert. Analog wie Proteine lässt sich auch DNA bestimmen.
Die von der Firma IGEN (USA) entwickelte Methode wurde im Jahr 1996 nach Lizenznahme von Boehringer Mannheim, heute Roche Diagnostics, mit dem ECL-Analyzer ELECSYS auf den Markt gebracht (gegenwärtige Gerätereihe „Cobas e“).
Vorteile des Verfahrens sind:
Sehr stabiler nicht radioaktiver Marker, der an Antikörper, Antigene und DNA konjugierbar ist. Dabei lassen sich in Sandwich-Immunoassays Analyte mit hoher Molmasse (z. B. PSA) und in kompetitiven Immunoassays Analyte mit niedriger Molmasse bestimmen. Über Brückenteste lassen sich IgG- und IgM-Antikörper bestimmen. Da eine Kopplung des Rutheniumkomplexes an DNA-und RNA-Stränge möglich ist, können auch komplementäre DNA- bzw. RNA-Stränge bestimmt werden.
Hohe Sensitivität (attomol = 10−18) durch hohe Lichtausbeute.
