Elektrophoretische Trennung von ladungstragenden Makromolekülen wie Proteinen, Peptiden oder Nukleinsäuren zur anschließenden Weiterverarbeitung.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Gelelektrophorese: Die getrennten Fraktionen werden aus einer Gelschicht herausgekratzt oder herausgeschnitten. DNA-Fragmente können direkt danach mit der Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden. Die Eluierung von intakten Proteinen aus Gelstückchen gelingt meist nur unvollständig (s. a. Elektroelution). In der Praxis werden die Proteine deshalb in der Gelmatrix mit Trypsin zu Peptiden verdaut, diese können heraus eluiert und mittels Massenspektrometrie weiter analysiert werden.
Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung in wässriger Lösung: In der trägerfreien („free flow“) Elektrophorese wird ein Proteingemisch in einem kontinuierlichen Pufferstrom in einer flachen Küvette aufgetrennt. Quer zur Fließrichtung liegt ein elektrisches Feld an, das die unterschiedlichen Probenkomponenten verschieden stark ablenkt. Die getrennten Fraktionen werden an konstanten Stellen am Ende der Küvette über ein Array von dünnen Schläuchen entnommen.
Die folgende Abbildung zeigt eine trägerfreie Elektrophorese: Die Probenkomponenten werden in einem kontinuierlich fließenden Pufferstrom durch ein elektrisches Feld unterschiedlich stark abgelenkt und treffen an konstanten Stellen am Ende der Trennküvette auf (nach: Lottspeich und Engels 2012):
×
Bei der „Off-Gel“-isoelektrischen Fokussierung (Abb. 1) verwendet man schmale Polyacrylamidgel-Streifen mit immobilisierten pH-Gradienten (IPG-Streifen), die sich in einer Horizontalkammer befinden und auf deren Oberfläche Fraktionierrahmen aufgesetzt werden. Jeweils 150 μL des verdünnten Proteingemisches werden in die Kammern des Fraktionierrahmens aufgegeben. Im elektrischen Feld wandern die geladenen Proteine oder Peptide durch die Gelstreifen, bis sie den pH-Wert erreichen, der ihrem isoelektrischen Punkt entspricht. Die Fraktionen befinden sich in wässriger Lösung und werden aus den Kammern entnommen.
Abb. 1
„Off-Gel“-isoelektrische Fokussierung: Die Probenkomponenten wandern im elektrischen Feld durch einen IPG-Streifen in die jeweils nächste Kammer, bis sie den pH-Wert erreichen, der ihrem isoelektrischen Punkt entspricht (nach: Lottspeich und Engels 2012)
×
Einsatzgebiet
Protein- und DNA-Analytik.
Untersuchungsmaterial
Biologische Flüssigkeiten, wie Plasma, Serum, Urin; Gewebeextrakte, Zelllysate.
Instrumentalisierung
Für Gelelektrophoresen werden prinzipiell drei Geräte benötigt:
einen Gleichstromversorger, bei welchem man Strom-, Spannungs-, und – am besten auch die – Leistungswerte einstellen kann.
Eine vertikale oder horizontale Trennkammer mit zugehörigem Gelgießsystem.
Kühl- oder Heiz-Thermostat, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Die Spezifität wird beeinflusst durch das Puffersystem, die Bedingungen nativ oder denaturierend, und die Porengröße der Gelmatrix.
Sensitivität
Die Empfindlichkeit moderner Massenspektrometer ist so hoch, dass man kann die Proteinfraktionen aus analytischen Gelen ohne weiteres analysieren kann.
Fehlermöglichkeit
Bei der Herstellung von Gelen und Puffern im Labor können sich viele Fehler ergeben durch falsches Einwiegen, Verwechslung von Puffermaterialien, Ungeschicktheiten beim Gelgießen. Die Fehlermöglichkeiten lassen sich durch die Verwendung von Fertiggelen deutlich herabsetzen. Häufig passieren die Fehler aber auch bei der Probenvorbereitung. Trägerfreie Elektrophoresen sind nicht einfach zu bedienen.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Einfache Apparaturen für horizontale Agarosegele zur DNA-Trennung und vertikale Systeme zur Proteintrennung in Polyacrylamidgelen sind in der Anschaffung relativ günstig, zumal man in den meisten Fällen hierzu kein Kühlsystem und relativ einfach konstruierte Stromversorger braucht. Die Methoden der Gelelektrophorese werden durch die Verwendung von Fertiggelen und -puffern erheblich vereinfacht, dabei steigen allerdings die Kosten für die Verbrauchsmittel. Die Apparaturen für die trägerfreie Elektrophorese und die „Off-Gel“-isoelektrische Fokussierung sind deutlich teurer in der Anschaffung und bedürfen einer sehr anspruchsvollen Expertise in ihrer Handhabung.
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Verschiedene Methoden der präparativen Elektrophorese und isoelektrischen Fokussierung sind in klinisch-chemischen, biochemisch und molekularbiologisch arbeitenden Labors etabliert.
