Enzyme-linked Immunosorbent Assay

ELISA

enzyme linked immuno sorbent assay

Von Engvall (Engvall, Eva) und Perlman (Engvall und Perlman 1971) wird unter ELISA ein Sandwich-Enzymimmunoassay (Sandwich-Assay) verstanden. In neuerer Zeit wird der kompetitive Enzymimmunoassay mit enzymmarkierten und unmarkierten Immunkomplexen an der festen Phase ebenfalls zum ELISA gezählt.

In der Erstbeschreibung von Engvall und Perlman (1971) versteht man unter dem „enzyme-linked immunosorbent assay“ heterogene Enzymimmuntests, bei denen an Festphasen immobilisierte Antigene oder Antikörper mit der Untersuchungsflüssigkeit inkubiert werden, wobei bei Anwesenheit des spezifischen Bindungspartners ein Immunkomplex gebildet wird, der nach Entfernung unspezifisch gebundener Bindungspartner (meistens durch Waschen) einen zweiten immunologischen Reaktionspartner, an den ein Enzym gebunden ist (Konjugat), bindet. Beide Reaktionsschritte können auch simultan durchgeführt werden (Einschritt-ELISA). Nach Entfernen von überschüssigem, nicht im Immunkomplex gebundenem Konjugat (Abtrennung normalerweise durch Waschen, in speziellen Fällen auch durch Absorption, Fällung, Immunpräzipitation oder Affinitätsbindung) erfolgt nach Zugabe eines Substrats die Enzym-Substrat-Reaktion, wobei die Farbentwicklung der Konzentration des Analyten direkt proportional ist.

Mit zunehmender Verbreitung der Immunoassays und Einführung zahlreicher Varianten wurde der Begriff ELISA auch auf die Gruppe der kompetitiven Enzymimmunoassays (Immunoassay, kompetitiver) ausgedehnt. Dabei werden einfache Immunkomplexe aus an die Festphase gebundenem Antigen oder Antikörpern und um diesen Bindungspartner konkurrierende Reaktionspartner in der Untersuchungsflüssigkeit gebildet. Ein Reaktionspartner in der Untersuchungsflüssigkeit ist der zu bestimmende Analyt und der andere ein zugesetzter enzymmarkierter gleicher Reaktionspartner. Es wird umso mehr enzymmarkierter Immunkomplex gebildet, je weniger (konkurrierender) Analyt im Untersuchungsmaterial vorliegt. Die immobilisierten Immunkomplexe liegen überwiegend enzymmarkiert (bei niedriger Analytkonzentration) oder überwiegend unmarkiert (bei hoher Analytkonzentration) vor. Die Definition ELISA, die den kompetitiven Enzymimmunoassay einbezieht, wird u. a. von Davies (2005) benutzt.

Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Haptenen (Antigene geringerer Molmasse).

Serum (Plasma), Liquor, Urin und andere Körperflüssigkeiten.

Geräte mit hohem Automatisierungsgrad bei großen Analyseserien, manuelle Verfahren bei kleinen Analyseserien. Als feste Phase werden u. a. verwendet: Mikrotiterplatte, Röhrchen(wand), Kugel, Magnetpartikel oder Membran.

Im Ein-Schritt-Verfahren des Sandwich-Enzymimmunoassays kann bei Antigenüberschuss das Prozonen-Phänomen (High-Dose-Hook-Effekt) stören. Rheumafaktoren der IgM-Klasse erhöhen das Ergebnis bei der Bestimmung von spezifischen IgM, wenn die Probe gleichzeitig spezifisches IgG enthält. Sind spezifisches IgM und spezifisches IgG gleichzeitig vorhanden, so kann durch Konkurrenz der Antikörper das IgM-Ergebnis vermindert werden. Besonders in der Infektionsserologie werden Kreuzreaktionen beobachtet, die das Ergebnis einschränken können. Im Plasma als Untersuchungsmaterial kann das Fibrinogen zu Störungen der Antigen-/Antikörperbindung führen. Beim Nachweis von Autoantikörpern können falsch positive Reaktionen durch Antikörper gegen Blockierungsproteine (Rinderserumalbumin, Kasein, Gelatine u. a.) auftreten. Humane Anti-Maus-Antikörper in der Probe können in Testsystemen mit Maus-Antikörpern stören.

Der Sandwich-Enzymimmunoassay mit Farbdetektion zeigt eine Empfindlichkeit von 10^–16 mol/L. Kompetitive Enzymimmunoassays stehen den Sandwich-Enzymimmunoassays nur gering nach. Die Fluoreszenzdetektion erreicht 10⁻¹⁸, die Chemilumineszenz 10⁻²⁰ mol/L (s. Tabelle im Stichwort Immunoassay).

Plattenteste (Mikrotiterplatte mit der Möglichkeit zur Bearbeitung einzelner Kavitäten) für den ELISA mit Farbdetektion sind sowohl manuell als auch automatisiert bearbeitbar. Einzelteste für Chemolumineszenz-Detektion sind möglich. Labore mit höheren Probendurchsätzen verwenden Analysenautomaten für den ELISA.

Bedeutung inzwischen größer als für radioimmunologische Teste, nahezu so groß wie für klinisch chemische Teste. Die Aussage wird durch Kreuzreaktionen und andere Fehlermöglichkeiten (sog. Matrixeffekte), besonders in der Infektionsserologie, teilweise eingeschränkt.