Färbemethoden, mikrobiologische

microbiological staining methods

Klassische Methoden zum Nachweis von Mikroorganismen. Sie werden zur groben taxonomischen Klassifikation und Bewertung bestimmter Eigenschaften der Mikroorganismen genutzt. Neben Einfach- und Differenzierungsfärbungen gibt es auch Spezialfärbungen (z. B. nach Kinyoun, Neisser, Ziehl-Neelsen; Fluoreszenzfärbung nach Coons).

Die Methylenblau- oder die Fuchsinfärbung färben die Bakterienzellen meist gleichmäßig und einheitlich an und erhöhen dadurch den optischen Kontrast. Diese Färbungen dienen dazu, die Bakterien im Hellfeld darzustellen.

Ansatz für die alkalische Methylenblau-Färbung nach Löffler:

Färbedauer: dünne Ausstriche: 5–15 s, dicke Ausstriche: 45 s. Die Bakterien färben sich blau an.

Beispiel: Gram-Färbung. Man lässt mindestens 2 verschiedene Farbstoffe hintereinander auf den Ausstrich einwirken. Nach dem ersten Färbeschritt behandelt man die Zellen mit einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Säure. Dabei werden manche Bakterien wieder entfärbt, während andere den Farbstoff festhalten. Diese Unterschiede im Färbeverhalten kann man zur Vordifferenzierung der Bakterien nutzen: Es lassen sich 2 große Gruppen unterscheiden: grampositive und gramnegative Bakterien, die unter anderem unterschiedlich auf manche Antibiotika reagieren.

In der ersten Phase lässt man Karbol-Gentianaviolett einwirken, wodurch sich alle Bakterien anfärben. Bei einer nachfolgenden Behandlung mit Lugol-Lösung (Iod-Kaliumiodid 1:2 in Wasser) bilden sich größere Farbstoffkomplexe, die Bakterien erscheinen dunkelblau („Beizung“).

In der zweiten Phase wird mit 96 % Ethanol behandelt, wobei gramnegative Bakterien den Farbstoff wieder freigeben, während die grampositiven Bakterien mit ihrer dickeren Mureinhülle die blauen Farbstoffkomplexe festhalten. Abschließend wird mit verdünntem Karbolfuchsin gegengefärbt, damit auch die gramnegativen Bakterien (rot) zur Darstellung kommen.

Das Prinzip der Ziehl-Neelsen-Färbung beruht darauf, dass die Zellwand säurefester Bakterien besondere Lipide (Wachse, Mykolsäuren) enthält, sodass sie sich mit den üblichen Verfahren schlecht anfärben. Man lässt unter Hitzeeinwirkung Karbolfuchsin einwirken, sodass der Farbstoff einerseits trotz der Lipidhülle eindringt, andererseits aber bei normaler Temperatur nur schwer wieder aus den Bakterien extrahiert werden kann. Danach lässt man bei normaler Temperatur Salzsäure oder ein Gemisch aus Alkohol und Salzsäure einwirken, wobei fast alle Bakterien den Farbstoff wieder abgeben, bis auf die säurefesten Stäbchen, die rot gefärbt bleiben und im gefärbten Ausstrich leichter zu identifizieren sind. Diese Kontrastfärbung ist eine wichtige differenzialdiagnostische Hilfe zur Identifizierung vor allem von Erregern der Tuberkulose und der Lepra.

Bei der Grocott-Methenamin-Silberfärbung entstehen durch die Behandlung mit Chromsäure Aldehydgruppen. Diese werden durch die folgende Reaktion mit einem Methenamin-Silbernitrat-Komplex schwarz, sodass sich die Pilzbestandteile deutlich von einem blassgrünen Hintergrund abheben.

Methenamin-Silbernitrat-Lösung:

Auf Objektträgern dünn ausgebreitete Bakteriensuspensionen lässt man lufttrocknen und fixiert sie in der Regel durch dreimaliges langsames Durchziehen durch die Flamme. Da die Hitzefixation die Bakterienstruktur verändern kann, ist es bei morphologischen Untersuchungen besser, mit Ethanol zu fixieren.