Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik
Autoren
R. Westermeier

Fluoreszenz Western Blotting

Fluoreszenz Western Blotting
Englischer Begriff
Fluorescent Western Blotting
Definition
Immundetektion von Antigenen auf Blotmembranen mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Bei dieser Variante von Western Blotting benötigt man Blotmembranen mit niedriger Eigenfluoreszenz. Mit dieser Methode werden meist Multiplexbestimmungen durchgeführt: Nach dem Blockieren der unbesetzten Bindungsstellen wird die Blotmembran mit einem Gemisch der Primärantikörper gegen die zu bestimmenden Zielantigene inkubiert. Diese Primärantikörper stammen von unterschiedlichen Wirtstieren, z. B. Maus und Kaninchen. Dann wird die Blotmembran mit PBS-Tween-Lösung gewaschen und mit einer geeigneten Mischung von Fluoreszenzfarbstoffen markierten Sekundärantikörpern inkubiert, z. B. Ziege-Anti-Maus markiert mit Cy3 (Anregung durch grünes Licht mit 532 nm Wellenlänge) und Ziege-Anti-Kaninchen markiert mit Cy5 (Anregung durch rotes Licht mit 633 nm Wellenlänge). Die Detektion kann entweder mit einem Multifluoreszenzscanner oder einem fluoreszenzfähigem CCD-Kamerasystem durchgeführt werden.
Einsatzgebiet
Multiplexproteinbestimmungen.
Untersuchungsmaterial
Biologische Flüssigkeiten, Gewebeextrakte, Zelllysate.
Instrumentalisierung
Ausrüstung für Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestehend aus Horizontal- oder Minivertikalkammer, Stromversorger, Umlaufthermostat; Fluoreszenzscanner oder Fluoreszenz-CCD-Kamerasystem.
Spezifizität
Hoch, da die Methode auf Immunreaktion beruht.
Sensitivität
Picomol- bis Nanomolbereich.
Fehlermöglichkeit
Fehler bei der Elektrophorese können bei Verwendung von Fertiggelen minimiert werden. Für den Elektrotransfer bei Western Blotting können fertige Pufferkits eingesetzt werden.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Aufwand wie bei normalem Western Blotting, aber ein Fluoreszenzdetektionsgerät (CCD-Kamera oder Fluoreszenzscanner) wird benötigt. Bei der Verwendung von Fertigprodukten ist mit höheren Kosten zu rechnen.
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Fluoreszenz Western Blotting ist eine Methode für biochemisch arbeitende Labors.
Literatur
Fradelizi J, Friederich E, Beckerle MC, Golsteyn RM (1998) Quantitative measurement of proteins by western blotting with Cy5-coupled secondary antibodies. Biotechniques 26:484–494