Fluoreszenz Western Blotting

Fluorescent Western Blotting

Immundetektion von Antigenen auf Blotmembranen mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern.

Bei dieser Variante von Western Blotting benötigt man Blotmembranen mit niedriger Eigenfluoreszenz. Mit dieser Methode werden meist Multiplexbestimmungen durchgeführt: Nach dem Blockieren der unbesetzten Bindungsstellen wird die Blotmembran mit einem Gemisch der Primärantikörper gegen die zu bestimmenden Zielantigene inkubiert. Diese Primärantikörper stammen von unterschiedlichen Wirtstieren, z. B. Maus und Kaninchen. Dann wird die Blotmembran mit PBS-Tween-Lösung gewaschen und mit einer geeigneten Mischung von Fluoreszenzfarbstoffen markierten Sekundärantikörpern inkubiert, z. B. Ziege-Anti-Maus markiert mit Cy3 (Anregung durch grünes Licht mit 532 nm Wellenlänge) und Ziege-Anti-Kaninchen markiert mit Cy5 (Anregung durch rotes Licht mit 633 nm Wellenlänge). Die Detektion kann entweder mit einem Multifluoreszenzscanner oder einem fluoreszenzfähigem CCD-Kamerasystem durchgeführt werden.

Multiplexproteinbestimmungen.

Biologische Flüssigkeiten, Gewebeextrakte, Zelllysate.

Ausrüstung für Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestehend aus Horizontal- oder Minivertikalkammer, Stromversorger, Umlaufthermostat; Fluoreszenzscanner oder Fluoreszenz-CCD-Kamerasystem.

Hoch, da die Methode auf Immunreaktion beruht.

Picomol- bis Nanomolbereich.

Fehler bei der Elektrophorese können bei Verwendung von Fertiggelen minimiert werden. Für den Elektrotransfer bei Western Blotting können fertige Pufferkits eingesetzt werden.

Aufwand wie bei normalem Western Blotting, aber ein Fluoreszenzdetektionsgerät (CCD-Kamera oder Fluoreszenzscanner) wird benötigt. Bei der Verwendung von Fertigprodukten ist mit höheren Kosten zu rechnen.

Fluoreszenz Western Blotting ist eine Methode für biochemisch arbeitende Labors.