Fluoreszenzmarkierung

Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen

fluorescence labeling

Fluoreszenzfarbstoffe werden vor der Analyse oder Auftrennung kovalent an Nukleinsäuren oder Proteine gebunden, wodurch – unter anderem – Online-Detektionsmethoden ermöglicht werden.

Wie bei den Fluoreszenzfärbungen werden bei der Fluoreszenzmarkierung die Fluorophore mit Licht niedriger Wellenlänge angeregt und das emittierte Lichtsignal gemessen, das eine höhere Wellenlänge hat. Der lineare dynamische Messbereich erstreckt sich über 4 Größenordnungen. Quantitative Analysen sind deutlich exakter, wegen des weiten linearen Detektionsbereichs wie bei der Fluoreszenzfärbung. Meist werden hierzu Cyaninfarbstoffe (wie Cy2, Cy3 und Cy5) verwendet, wobei für die Bindung an das Lysin N-Hydroxysuccinimidyl-(NHS-)Ester verwendet werden, für die Bindung an die Cysteine reaktive Maleimidgruppen. Als Alternative eignen sich fluorogene Pyryliumfarbstoffe, die sowohl an das Lysin als auch an den N-Terminus von Proteinen binden. Während bei der NHS-Ester-Reaktion keine Reduktionsmittel und/oder Trägerampholyten in der Probe enthalten sein dürfen, werden diese Reagenzien bei der zweiten Methode ohne weiteres toleriert.

Fluoreszenzmarkierungen von Nukleinsäuren und Proteinen ermöglichen Multiplexanalysen. Für die Differenzgelelektrophorese (DIGE) bei der Zweidimensional-Elektrophorese (Elektrophorese, zweidimensionale) von Proteinen werden die Cyaninfarbstoffe chemisch in der Weise modifiziert, dass die gleichen Molekulargewichte angefügt und die isoelektrischen Punkte der Proteine nicht verändert werden. Auf diese Weise erreicht man, dass die gleichen Proteine aus den verschiedenen Proben zu den exakt gleichen Positionen im Gel wandern. Die Differenzgelelektrophorese ermöglicht die Verwendung eines inneren Standards für jedes einzelne Protein, wodurch Gel-zu-Gel-Variationen ausgeschaltet werden. Dies ist neben einigen neuen Markierungsmethoden für die Massenspektrometrie, die auf unterschiedlich schweren Isotopenmarkern beruht, eine sehr verlässliche quantitative Analysenmethode in der Proteomik.

Bei Nukleinsäuren wird die Fluoreszenzmarkierung für die DNA-Sequenzierung und DNA-Fragmentanalyse eingesetzt. Für denaturierende Proteinelektrophoresen wie die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und die isoelektrische Fokussierung in Gegenwart von mindestens 8 M Harnstoff kann die Fluoreszenzmarkierung die aufwändigen mehrschrittigen Färbemethoden ersetzen und bietet zudem eine deutlich verbesserte Quantifizierbarkeit. DIGE für die Proteomik.

Nukleinsäuren, Proteingemische.

Ausrüstung für Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestehend aus Horizontal- oder Minivertikalkammer, Stromversorger, Umlaufthermostat; Fluoreszenzscanner oder Fluoreszenz-CCD-Kamerasystem.

Die Detektionsempfindlichkeitsgrenze liegt im höheren Picogramm- bis Nanogrammbereich.

Die Proteinprobe muss mit SDS oder Harnstoff denaturiert sein. Der pH-Wert der Probe darf nicht unter 8 sein.

Die Kosten für Fluoreszenzfarbstoffe für die Markierung von Proteinen sind auf dem Niveau der gängigen Färbemethoden (wie Coomassie-Brilliant-Blau- und Silberfärbung) angelangt. Ein Fluoreszenzdetektionsgerät (CCD-Kamera oder Fluoreszenzscanner) wird benötigt; seit kurzem sind gute Kamerasysteme für ca. 5000 Euro erhältlich.

Fluoreszenzmarkierung ist eine Methode für biochemisch arbeitende Labors, aber auch sehr gut geeignet für die Urinprotein-Elektrophorese.