Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik
Autoren
T. Arndt

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
Synonym(e)
HPLC; Hochauflösende-Flüssigchromatographie; Hochleistungs-Säulen-Flüssig-Chromatographie; Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
Englischer Begriff
high performance liquid chromatography; high pressure liquid chromatography; HPLC
Definition
Eine besonders leistungsfähige Form der Flüssigkeitschromatographie, die wiederum eine Form der Chromatographie ist.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Moderne Formen der Flüssigkeitschromatografie nutzen sehr kleine Teilchen (Durchmesser meist 3–10 μm) als stationäre Phase, die dicht gepackt auf einer Säule (2–20 cm Länge) einen hohen Eingangsdruck erzeugen. Der daraus resultierende hohe Druck im System (nicht selten über 100 at) führte zum Begriff Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie („high pressure liquid chromatography“, HPLC). Allerdings ist diese Bezeichnung veraltet. Stattdessen wird heute mit dem Begriff Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie („high performance liquid chromatography“, HPLC) das hohe Trennvermögen dieser Systeme angesprochen. Die chromatographische Trennung der Probenbestandteile beruht auf der in Abhängigkeit von ihrer physikochemischen Natur unterschiedlich stark ausgeprägten, wiederholten Adsorption und Desorption der Substanzen an der stationären Phase. Dabei führen starke Wechselwirkungen zu einer langsamen, schwach ausgeprägte zu einer schnellen Elution der entsprechenden Substanzen. Moderne Ausführungen der HPLC mit extrem dicht gepackten, oft kurzen Säulen und entsprechend hohem Auflösungsvermögen werden als UPLC (Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie) bezeichnet.
Untersuchungsmaterial
Blut und alle aus ihm gewonnenen Materialien wie Serum, Plasma, Zelllysate etc., Urin, Mageninhalt, Extrakte aus Fäzes und Gewebs- und Haarproben, Nahrungsmittel, Pharmaka u. a.
Instrumentierung
Eine HPLC-Anlage besteht in ihrer allgemeinsten Form aus einem Reservoir für die mobile Phase (Eluent), einer oder mehreren HPLC-Pumpen, einem Probenaufgabemodul, einer HPLC-Säule ggf. mit Vorsäule zum Schutz der analytischen Säule (stationären Phase) und einem Detektor mit Registriereinheit (Flussschema Chromatographie).
Spezifität
In Abhängigkeit von der Qualität der chromatographischen Trennung und der Selektivität des Detektors ist die Spezifität der Methode ausreichend bis außerordentlich hoch. Deshalb wird die HPLC in Kombination mit massenspektrometrischen Detektoren auch als Referenzverfahren gewertet. Die Kombination aus HPLC und Massenspektrometrie (MS) als LC-MS oder LC-MS/MS ist als rechtssicheres Mittel zum Nachweis oder Ausschluss eines Drogenkonsums allgemein akzeptiert.
Sensitivität
Die Sensitivität der Methode ist abhängig von der jeweiligen Applikation, d. h. der Probenverdünnung infolge einer Probenaufbereitung, dem injizierten Probenvolumen und insbesondere vom Detektortyp. Heute sind Nachweisgrenzen im ng/L-Bereich erreichbar.
Fehlermöglichkeit
Fehler in der Probenvorbereitung, z. B. durch Analytverluste, können durch Einsatz eines internen Standards (Standard, interner) oder durch das Prinzip der Standardaddition kompensiert werden (Standardaddition = Zugabe einer definierten Analytmenge zu einem Aliquot der Probe, Analyse der nativen und aufgestockten [gespikten] Probe, Auswertung der Signalhöhenquotienten anhand geeigneter Kalibrationsfunktionen).
Eine unzureichende Selektivität des Detektors bei ungenügender chromatographischer Trennung von mehreren Probenkomponenten kann zu Fehlbestimmungen des Analyten führen. Dies kann durch eine Veränderung der Eigenschaften der mobilen und/oder stationären Phase, durch eine modifizierte Flussrate der mobilen Phase, durch längere oder dichter gepackte Trennsäulen etc. verhindert werden. Die Spezifität einer HPLC-Analyse hängt in entscheidendem Maße von der Qualität der chromatographischen Trennung der Probenbestandteile ab.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Es stehen eine Vielzahl von Einzelkomponenten für die HPLC, aber auch Komplettanlagen zur Verfügung. Die Anschaffungspreise betragen für letztere mehrere 10.000 Euro. Komplettkits zur Durchführung von HPLC-Analysen sind teurer (oft zwischen 2–5 Euro/Analyse) als Eigenentwicklungen mit oft geringen Materialkosten. Gewöhnlich erzeugt die HPLC-Säule mit 250–600 Euro die größten Verbrauchskosten. Allerdings sind gewöhnlich mehrere 100–1000 (bei sog. Mikrobore-HPLC-Systemen auch mehrere 10.000) Analysen mit einer Trennsäule durchführbar.
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Die Vorteile der HPLC gegenüber der klassischen Fest-Flüssig-Chromatographie sind
  • wesentlich höhere Auflösung, sodass bis zu 100 und mehr Komponenten, die sich nur geringfügig in ihren physikochemischen Eigenschaften unterscheiden, getrennt werden können,
  • stark verkürzte Analysenzeit (Minuten statt Stunden),
  • verbesserte Empfindlichkeit.
Gewöhnlich können alle drei Kriterien nicht gleichzeitig erfüllt werden, sodass bei der Optimierung des Verfahrens oft ein Kompromiss zwischen den drei Bedingungen gefunden werden muss.
Die HPLC ist eine ausgereifte Methode mit hoher Robustheit im Routinebetrieb und langer Standzeit. Die Kombination von HPLC und Massenspektrometrie als LC-MS oder LC-MS/MS hat in den letzten Jahren die klinisch-chemische und toxikologische Analytik im Bereich der sog. kleinen Moleküle (Masse durch Ladung bis ca. 1500 g/mol) revolutioniert. Mit dem Einsatz von „LC-Time of Flight Massenspektrometer (TOF)“-Kopplungen sind größere Moleküle (Medikamente auf der Basis monoklonaler Antikörper, Peptide, Proteine oder Proteinfragmente) zugängig, sodass die HPLC auch in den kommenden Jahren eine weiter wachsende Rolle in der physiko-chemischen labormedizinischen Analytik haben wird.
Literatur
Carr PW, Stoll DR, Wang X (2011) Perspectives on recent advances in the speed of high performance liquid chromatography. Anal Chem 83:1890–1900CrossRefPubMedPubMedCentral
Unger KK (Hrsg) (1989) Handbuch der HPLC. Teil 1 Leitfaden für Anfänger und Praktiker. GIT Verlag, Darmstadt