Hoppe-Seyler gilt als Begründer der Physiologische Chemie und hat deren Bedeutung in Lehre und Klinik immer wieder betont und durchgesetzt. An allen Wirkungsstätten hat er eine große Zahl von Studenten und Ärzten aus vielen Ländern angeleitet, promoviert und habilitiert (wenige Beispiele): Alexander Schmidt (Blutgerinnung,
Fibrinogen), Ernst von Leyden, Wilhelm Kühne (
Enzyme), Friedrich Miescher (1844–1895, Entdeckung des „Nuclein“), Eugen Baumann (Schwefelstoffwechsel,
Homogentisinsäure), Ernst Leopold Salkowski (Phenolausscheidung, Autolyse, Pentosurie), Albrecht, Kossel, Rudolf von Jaksch (
Acetoacetat, Melanintest), Josef von Mering (entdeckte mit O. Minkowski durch Pankreatektomie die Ursache des Typ-1-Diabetes).
Hoppe-Seyler forschte über Blutfarbstoffe und Chlorophyll. Er bewies, dass
Hämoglobin eine definierte chemische Substanz ist und
Eisen enthält. Mit einem verbesserten
Spektroskop fand er verschiedene Absorptionsbanden und deren Veränderung durch Sauerstoffaufnahme und Bildung von CO-Hb und Met-Hb. Er bewies, dass die Oxidation zur Energiegewinnung nicht im Blut, sondern in der Zelle erfolgt. Mit seinen Schülern untersuchte er die Zusammensetzung der Zellen (Nukleoproteine, Lezithin,
Albumin,
Cholesterin und Glykosamine) und analysierte Knorpel, Knochen und Zahnschmelz. 1877 gründete er die Zeitschrift für Physiologische Chemie.