Bei der isoelektrischen Fokussierung werden Proteingemische in einem pH-Gradienten elektrophoretisch aufgetrennt. Mit dieser Methode lassen sich die isoelektrischen Punkte von Proteinen bestimmen. Man erreicht dabei eine außerordentlich hohe Auflösung, weil die Proteine im elektrischen Feld an ihren isoelektrischen Punkten scharf gebündelt (fokussiert) werden.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Bei der isoelektrischen Fokussierung ist es theoretisch (aber nicht immer unter praktischem Aspekt) unwichtig, an welcher Position innerhalb des pH-Gradienten die Probe aufgegeben wird. Proteine mit einem höheren isoelektrischen Punkt (s. Isoelektrischer Punkt) als der gewählte pH-Wert erhalten positive Nettoladung(en), Proteine mit niedrigerem isoelektrischen Punkt negative Nettoladung(en) (s. Abb. 1).
Abb. 1
Isoelektrische Fokussierung
×
Die Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung: Die Proteine wandern aufgrund ihrer Ladung elektrophoretisch von der Aufgabestelle in die Richtung ihres isoelektrischen Punkts, an dem sie entladen und aufgrund des Fokussierungseffekts scharf gebündelt werden:
Im elektrischen Feld wandern die positiv geladenen Analyte solange in Richtung Kathode und die negativ geladenen Moleküle solange an die Anode, bis sie an ihren isoelektrischen Punkten angelangt sind und eine Nettoladung von Null bekommen, die sie elektrophoretisch unbeweglich macht. Ein Standardgemisch von Proteinen mit bekannten isoelektrischen Punkten kann im gleichen Gel wie die Analysenproben getrennt werden (unterschiedliche Spuren für Standard und jede Probe) und dient der Ermittlung der isoelektrischen Punkte der Probenproteine durch Vergleich der Position der Standardproteine und der Probenproteine in Bezug zur Probenaufgabestelle.
Die Methode erzeugt scharf gebündelte Proteinzonen, weil sie der Diffusion entgegenwirkt: Diffundiert ein Protein von seinem isoelektrischen Punkt weg, bekommt es wieder eine Nettoladung und wandert sofort wieder elektrophoretisch zum isoelektrischen Punkt zurück, an dem es wieder entladen wird. Dadurch wird auch eine sehr hohe Auflösung erreicht. Dieser „Fokussierungseffekt“ funktioniert nur bei hohen elektrischen Feldstärken effizient. Hierzu werden Hochspannungsstromversorger benötigt, die Kammern müssen entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen genügen.
Als stabilisierende Medien kommen nur elektroendoosmosefreie oder -arme Gele aus Polyacrylamid oder spezieller gereinigter Agarose infrage. Es werden großporige Gele ohne Siebwirkung verwendet, weil die Molekülgröße ohne Einfluss auf die Elektrophorese sein soll. Zur besseren Handhabung und für die Dokumentation werden die Gele fast ausschließlich auf eine Plastikträgerfolie polymerisiert oder gegossen. In Einzelfällen werden auch ausreichend gute Ergebnisse mit der Kapillartechnik erzielt.
Weil die isoelektrischen Punkte stark von der Temperatur abhängig sind, lässt man Fokussierungsgele auf einer Kühlplatte mit exakter, aktiver Temperaturkontrolle laufen.
Es gibt 2 Arten von pH-Gradienten:
Trägerampholyten-pH-Gradienten: Hierbei enthält das Gel ein Gemisch von ca. 700 verschiedenartigen amphoteren Puffern mit einem Spektrum von isoelektrischen Punkten von sauer bis basisch (Trägerampholyten). Diese besitzen hohe Pufferkapazitäten an ihren isoelektrischen Punkten, sind kleiner als 1000 Da und befinden sich in freier Lösung. Beim Durchschnitts-pH-Wert des Gemisches ist die eine Hälfte positiv, die andere Hälfte negativ geladen. Wenn man ein elektrisches Feld anlegt, wandern die positiv geladenen (die basischen) Moleküle in Richtung Kathode, die negativ geladenen (die sauren) Moleküle in Richtung Anode. Dabei bildet sich ein pH-Gradient aus, der sich automatisch zwischen Anode und Kathode stabilisiert, weil die Trägerampholyten an ihrem isoelektrischen Punkten hohe Pufferkapazitäten haben.
Immobilisierte pH-Gradienten: Diese immobilisierten pH-Gradienten gibt es nur in Polyacrylamidgelen; sie werden bei der Gelherstellung erzeugt. Hierzu verwendet man Acrylamidderivative mit Carboxylgruppen (schwache Säuren) und mit tertiären Aminogruppen (schwache Basen), die man mit den gelbildenden Acrylamidmonomeren kopolymerisiert. Einen Gradienten erzeugt man mithilfe eines Gradientenmischers, mit dem 2 verschiedene Monomerlösungen beim Gießen in eine Kassette graduell gemischt werden. Die eine Lösung enthält mehr saure Derivate und 20 % Glyzerol zur Stabilisierung des Gradienten, die andere mehr basische Derivate. Die Rezepturen sind mehrfach publiziert. Meist wird diese Technik für die erste Dimension der Zweidimensional-Elektrophorese (Elektrophorese, zweidimensionale) angewendet: Es gibt fertige foliengestützte Gelstreifen mit immobilisierten pH-Gradienten für diese Anwendung.
In der Praxis ist es wichtig, an welcher Position im pH-Gradienten die Probe aufgegeben wird. Dieser Punkt wird für die bestimmten Proben entweder durch einen Stufentest ermittelt oder aus der Literatur oder Labordokumentation entnommen. Das gleiche gilt für die Trennzeiten, -temperaturen und -bedingungen.
In manchen Anwendungen müssen der Matrix Additive beigegeben werden, z. B. 8 mol/L Harnstofflösung zu Polyacrylamidgelen zur Erzeugung denaturierender Bedingungen oder 10 % Sorbit zur Stabilisierung von Agarosegelen.
Bei der Anfärbung von Fokussierungsgelen ist darauf zu achten, dass die Proteine in den großporigen Gelen effektiv fixiert werden, während die Trägerampholyte komplett aus dem Gel ausgewaschen werden; sie würden einen starken Hintergrund verursachen. Meist wird zur Fixierung 20 % Trichloressigsäure verwendet, die man bei sonstigen Elektrophoresemethoden nicht benötigt. Die am häufigsten angewandten Nachweismethoden sind Coomassie-Färbung, Silberfärbung und Zymogramm-Färbungen (Zymogramm-Technik).
Einsatzgebiet
Analyse von Enzymen und Enzyminhibitoren in Humanserum
Hängt von der Nachweismethode ab. Zymogramm-Techniken (s. Zymogramm-Technik) zeichnen sich durch hohe Spezifität für die nachzuweisenden Enzyme aus. Bei Silberfärbung zum Nachweis von oligoklonalem IgG sind eine hohe Auflösung des Gels und einige Erfahrung notwendig, um z. B. eine Hämoglobin- nicht als IgG-Bande zu identifizieren.
Es gibt relativ viele Fehlermöglichkeiten. Fehler der Verdünnung von Serumproben auf gleiche IgG-Konzentration wie im Liquor.
Silberfärbung: Wichtig ist gute Qualität des deionisierten oder destillierten Wassers und der verwendeten Reagenzien. Die Verwendung eines Silberfärbekits ist zu empfehlen. Auch die Inkubations- und Waschzeiten müssen exakt eingehalten werden. Bei der Interpretation der Ergebnisse ist eine gewisse Erfahrung wichtig.
