Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik
Autoren
G. F. Hoffmann, C.-D. Langhans und A. Schulze

Lysosomale Enzyme, Aktivitätsbestimmung

Lysosomale Enzyme, Aktivitätsbestimmung
Englischer Begriff
determination of activities of lysosomal enzymes (fluorimetric)
Definition
Bestimmung der Aktivität einzelner lysosomaler Enzyme mittels fluorogen-markierten Substrats.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Jedes zu untersuchende lysosomale Enzym spaltet spezifisch ein bestimmtes Substrat. Bei der Bestimmung lysosomaler Enzymaktivitäten werden meist künstliche Substrate verwendet, die eine fluorogene Gruppe enthalten, z. B. eine 4-Methylumbelliferyl-(4-MU-)Gruppe.
Das Substrat wird mit dem jeweiligen Probenmaterial (Plasma, Serum, Trockenblut, Leukozytenhomogenat, Fibroblastenhomogenat) inkubiert. Anschließend wird die vom Enzym freigesetzte 4-MU-Gruppe durch Zugabe eines basischen Puffers in das 4-MU-Anion überführt. Dieses kann mittels Fluorimetrie bei λex = 365 nm und λem = 445 nm detektiert werden. Die gemessene Aktivität wird anhand einer gleichzeitig gemessenen Eichgerade berechnet.
Einsatzgebiet
Bei Verdacht auf Vorliegen einer speziellen lysosomalen Speichererkrankung oder einer Gruppe der lysosomalen Speichererkrankungen, wie z. B. Mukopolysaccharidosen, Sphingolipidosen, Mukolipidosen und Oligosaccharidosen.
Untersuchungsmaterial
Serum, Heparin-Plasma, Trockenblut, Leukozyten (Heparin-Vollblut), Fibroblasten (Hautstanze).
Instrumentierung
Wasserbad, Trockenschrank, Fluorometer, Photometer, Ultraschallstab und pH-Meter.
Spezifität
Abhängig vom untersuchten Enzym und dem jeweils verwendeten Substrat.
Sensitivität
Abhängig vom untersuchten Enzym und dem jeweils verwendeten Substrat.
Fehlermöglichkeit
Falsch angesetzte Puffer- und/oder Substratlösungen sowie falsch eingestellte Proteinkonzentrationen der Probe können am ehesten zu falsch positiven Ergebnissen führen. Ebenfalls kann Probenmaterial, das über einen zu langen Zeitraum und/oder nicht ausreichend temperiert transportiert oder schlecht aufgearbeitet wurde, zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Des Weiteren gibt es Fälle, bei denen trotz Vorliegen eines Enzymdefektes ein falsch negatives Ergebnis bei der Bestimmung der Enzymaktivität erhalten wird (z. B. photometrischer Test auf Niemann-Pick Typ B mit der Mutation Q292K).
Eine weitere Fehlermöglichkeit ist, dass nicht das Enzym selbst, sondern das zugehörige Aktivatorprotein defekt ist. Dies kann z. B. bei der Arylsulfatase A (metachromatischen Leukodystrophie) in seltenen Fällen vorkommen.
Bei Vorliegen eines Defekts der Arylsulfatase A muss immer auch die Sulfatidausscheidung im Urin getestet werden. Ist die Sulfatidausscheidung normal, handelt es sich um eine Pseudodefizienz ohne klinische Relevanz.
Heterozygote weisen häufig erniedrigte Enzymaktivität auf, die jedoch ohne klinische Relevanz ist.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Serum/Plasma:
  • Leicht durchzuführen
  • Kosten sind abhängig vom jeweils verwendeten Substrat
Trockenblut:
  • Probe muss erst extrahiert werden, Testdurchführen dann leicht machbar
  • Kosten sind abhängig vom jeweils verwendeten Substrat
Leukozyten/Fibroblasten:
  • Relativ aufwendig, da zunächst eine Proteinbestimmung des jeweiligen Homogenats durchgeführt werden muss. Anhand dieser müssen die für die jeweiligen Enzymaktivitätsbestimmungen benötigten Proteinkonzentrationen eingestellt werden. Erst dann kann die eigentliche Enzymaktivitätsbestimmung erfolgen
  • Automatisierung nur bei sehr hohem Probendurchsatz sinnvoll
  • Kosten sind abhängig vom jeweils verwendeten Substrat
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Zur Diagnosestellung ist die Bestimmung des Enzymdefektes unbedingt erforderlich. Neben der Bestimmung des Enzymdefekts sollte auch der molekulargenetische Defekt bestimmt werden. Letzteres ist insbesondere bei weiblichen Patienten mit Morbus Fabry notwendig, da diese in der Regel nur eine mäßig erniedrigte Aktivität der α-Galaktosidase A aufweisen.
Literatur
Mehta AB, Winchester B (Hrsg) (2012) Lysosomal storage disorders a practical guide. Wiley-Blackwell Verlag, New York