MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

MLPA; multiplex ligation-dependent probe amplification

Unter MLPA („multiplex ligation-dependent probe amplification“) versteht man eine Variante der Multiplex-PCR zum semiquantitativen Dosisnachweis von bis zu 40 Kopien.

Mittels der MLPA-Methode können Deletionen (s. Deletion), Duplikationen, aber auch Methylierungsstörungen (DNA-Methylierung) nachgewiesen werden.

Die MLPA-Methode wurde erstmals von der Firma MRC Holland entwickelt und publiziert. Die MLPA-Methode beruht darauf, dass für den zu amplifizierenden Sequenzabschnitt die beiden Primer, meist als MLPA-Proben bezeichnet, jeweils aus Teilsequenzen für die eigentliche genomische Zielsequenz und jeweils einer M13-spezifischen Sequenz („forward“ oder „reverse“) bestehen. Die Sondenabschnitte für die genomischen Zielsequenzen sind unmittelbar flankierend und bestehen meist nur aus wenigen Nukleotiden, die, für sich genommen, die Annealingtemperatur des PCR-Assays unterschreiten.

Für eine genaue kapillarelektrophoretische Darstellung der sequenzspezifischen Amplifikate in einem Multiplexansatz wird bei der jeweils zweiten Sonde zwischen Zielsequenz und M13-Sequenz noch ein synthetisches Oligonucleotid individueller Länge als sog. Stuffer-Fragment eingebaut, während die erste Sonde an dem 5‘-Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.

Die Durchführung des MLPA-Assays beruht auf folgenden Schritten:

Voraussetzung für eine PCR ist die Ligation der beiden Sonden, ohne die eine Amplifikation mittels der M13-Primer nicht möglich wäre. Durch den Einsatz äquimolarer Mengen an Sonden und die Amplifikation mittels der M13-Primer ergibt sich eine homogene Darstellung der elektrophoretischen Profile. Die Zahl der ligierten Sonden ist somit proportional zur Kopienanzahl der Zielsequenz.

Ist die genomische Zielsequenz durch eine Deletion oder Duplikation mengenmäßig verändert, so zeigt der elektrophoretische Peak eine halbierte bzw. eine entsprechend vermehrte Peakhöhe. Für die Analyse intragenischer Veränderungen eines zu untersuchenden Gens werden in einem typischen Multiplex-MLPA-Assay jeweils Einzelassays für die Exone eingesetzt, die sich aufgrund der definierten Länge der eingesetzten Stufferfragmente unterscheiden. Zusätzlich werden als interne Kontrollen noch wenige MLPA-Assays zu DNA-Abschnitten anderer Gene und von anderen Chromosomen eingesetzt. Im Elektropherogramm werden die erhaltenen Fragmente entsprechend der Länge und gemäß der Stuffergröße leiterförmig aufgetrennt und lassen sich so auswerten.

Es sei hinzugefügt, dass für eine korrekte Analyse nicht nur DNA-Proben der zu untersuchenden Patienten, sondern auch geschlechtsspezifische DNA-Proben von definierten, unauffälligen Kontrollpersonen analysiert werden.

Eine Modifikation stellt die Methylierungs-MLPA dar. Zum Nachweis von Methylierungsunterschieden und Imprintdefekten (s. Imprinting-Defekt) wird in diesem Fall zur Ligation noch eine Spaltung der genomischen DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen durchgeführt. Wird die genomische DNA aufgrund der Methylierung sequenzspezifisch gespalten und damit räumlich auseinandergerissen, kann die Ligation nicht ablaufen. Als Konsequenz findet hier keine Amplifikation statt, und es wird kein spezifischer Peak in der Kapillarelektrophorese dargestellt.