Nukleinsäure-Extraktion

DNA-/RNA-Extraktion

nucleic acids purification

Unter Nukleinsäure-Extraktion versteht man die Methodik, die gewünschten Nukleinsäuren einer Zelle oder eines Pathogens – im diagnostischen Einsatz meist DNA und RNA, aber auch mtDNA – so aufzureinigen, dass nachfolgende analytische Prozesse ein möglichst sensitives, exaktes und reproduzierbares Ergebnis ergeben.

Heutzutage mangelt es nicht an Protokollen zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus diversen biologischen Materialien. Über die vergangenen Jahrzehnte wurde die gezielte Extraktion von DNA und RNA immer effizienter, zugunsten eines Sensitivitätsgewinns insbesondere in der Erregerdiagnostik und der molekularen Hämatoonkologie und Pathologie zum Nachweis somatischer Mutationen. Die manuelle Extraktion wurde dabei vielfach durch Automatisierung mit zahlreichen Geräten der unterschiedlichsten Hersteller ergänzt oder gar ersetzt.

Die Nukleinsäure-Extraktion erfolgt in mehreren Schritten, wobei die Beschaffenheit der zu extrahierenden Probe eine wesentliche Voraussetzung für den Erfolg darstellt. So sollte Material, aus dem RNA extrahiert werden soll, möglichst zügig verarbeitet werden, um die Wirkung schädlicher RNasen zu minimieren. Als Alternative bietet sich eine Zugabe von RNase-Inhibitoren und/oder eine Aufbewahrung bei −80 °C an.

Jede DNA-Extraktion hat als ersten Schritt zur Freisetzung der Nukleinsäuren einen Lysisschritt zum Aufschluss von Zellen und Zellkernen sowie zum Lösen und Abbauen von Proteinen. Dieser erste Schritt ist abhängig vom biologischen Material und kann mechanisch, z. B. über Homogenisieren, oder auch enzymatisch, z. B. mit Proteinase K, erfolgen.

Beispielhaft wird nachfolgend eine weitverbreitete Methode zur Aufreinigung der DNA aus menschlichem Blut oder Gewebe in Grundzügen beschrieben, bei der die Serinprotease Proteinase K in Verbindung mit dem Detergenz SDS (Natriumdodecylsulfat) im primären Schritt der Zelllyse eingesetzt wird. Durch eine Hitzeinkubation bei meist 56 °C werden hierbei die strukturellen zellulären Proteine, aber auch die chromosomalen Proteine des Chromatins (s. Chromatin) abgebaut. Zur Reinigung und Anreicherung der DNA pipettiert man zu dem Lysat Ethanol oder auch Isopropanol und lädt das Gemisch anschließend auf eine Spin-Säule/-Column, meist mit Silica als Trennmaterial. Die Zugabe von Alkohol fördert dabei die Stabilisierung und Bindung der DNA an die Silica-Membran. In einem kurzen Zentrifugationsschritt werden die Verunreinigungen mit Peptiden und Polysacchariden abgetrennt und als Säulendurchfluss verworfen. Nach Waschschritten wird abschließend die DNA mit einem Elutionspuffer von der Säule gelöst, die DNA-Konzentration wird fotometrisch bestimmt und die DNA entweder der weiteren Analyse zugeführt oder im Kühl- oder Gefrierschrank gelagert.

Für schnelle Screeningtests mittels PCR, z. B. in der Forensik, existieren aber auch einfache, sehr preiswerte Verfahren, bei denen z. B. Mundschleimhautabstriche oder auch Kapillarblut aus der Fingerbeere in einem Puffer mit dem Komplexbildner Chelex aufgekocht und abzentrifugiert und anschließend direkt für eine PCR-Analyse eingesetzt werden.

Besondere Vorsicht ist dagegen für RNA-Präparationen erforderlich, bei denen schon bei der Lysis von Gewebe, Zellen oder auch Pathogenen (wie z. B. Viren) Reagenzien mit RNase-Inhibitorfunktion eingesetzt werden, wie z. B. Guanidinsalze, SDS oder auch Phenol-basierte Komponenten in Verbindung mit β-Mercaptoethanol oder auch Harnstoff, um in dem für die Integrität der RNA kritischen Prozess der Lysis möglichst schnell die Proteine und damit auch die RNasen zu degradieren. Eine Aufreinigung der RNA erfolgt anschließend ebenfalls über die schon genannten Spin-Säulen. In mehrmaligen Wasch- und Zentrifugationsschritten wird die RNA gereinigt und anschließend mit speziellem, RNase-freiem Wasser eluiert. Der RNA-Gehalt wird gemessen und die RNA unmittelbar anschließend weiterverarbeitet oder bei −70 °C gelagert.

Besondere Ansprüche an den Zellaufschluss stellen Pilze, Hefen oder Pflanzen. Hier muss in einem ersten Schritt, vor der eigentlichen Lysis, das Material oftmals mechanisch zerkleinert werden, beispielsweise durch Mörsern oder Schreddern mittels einer Schwingmühle. Anschließend werden spezifische, die Zellwand zerstörende Enzyme, wie z. B. Lyticase oder Zymolase, zugegeben

Bei archiviertem Material aus der Pathologie, namentlich Formalin-fixiertem, in Paraffin-eingebettetem (FFPE-) Material, muss zunächst ein Deparaffinierung der Schnitte mittels Xylol oder Xylolersatz erfolgen. Die entparaffinierten Gewebeschnitte werden meist länger, d. h. über Nacht, mit einem Proteinase-K-haltigen Puffer hitzeinkubiert und die DNA anschließend, wie schon zuvor beschrieben, mittels Spin-Säulen aufgereinigt.

Eine weitere Variante stellt die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakteriensuspensionen dar. Hier werden durch Lysozymbehandlung und nachfolgender alkalischer Lyse (mit NaOH-SDS-Puffer) die Bakterien aufgeschlossen und die denaturierten Proteine und die genomische Bakterien-DNA durch Zugabe saurer Kaliumacetatlösung mit anschließender Zentrifugation selektiv ausgefällt, während die Plasmid-DNA im Überstand verbleibt und mit Alkohol präzipitiert und gegebenenfalls über Spin-Säulen aufgereinigt wird.

Für eine effizientere Extraktion von Nukleinsäuren wurden in den vergangenen Jahren zahlreiche automatische Lösungen entwickelt, die den individuellen Anforderungen der Labore hinsichtlich DNA-/RNA-Extraktion und auch Probenmenge adaptiert sind. Die manuellen Nukleinsäure-Extraktionen werden nur noch in ausgewählten Fällen eingesetzt.

Die Extraktionsautomaten arbeiten weitestgehend autonom, d. h. ohne weitere Eingriffe durch das Personal, und haben in überschaubarer Zeit einen hohen Durchsatz an Extraktionen. Extraktionsautomaten gehören mittlerweile zu der Grundausstattung eines molekulardiagnostischen Labors. Die kleineren Extraktionsautomaten bearbeiten eine Probenmenge von bis zu 20 Proben, während die großen Extraktionsautomaten nahezu voll automatisiert sind, meist im 96er-Format arbeiten, oftmals noch direkt die PCR-Reaktionen ansetzen und z. T. im integriertem PCR-Cycler amplifizieren.

Extraktionsautomaten folgen methodisch jedoch anderen Prinzipien, da der Zentrifugationsschritt, wie bei den Spin-Säulen, im Arbeitsablauf eines Automaten nicht umsetzbar ist. Stattdessen ist die Methode der magnetischen Separation Grundlage der meisten Extraktionsautomaten, wobei diese Methode auch manuell durchgeführt werden kann.

Die „magnetic beads“ (magnetische Partikel) sind kleine magnetische Kügelchen auf einem Trägermaterial, wie z. B. Polyvinylalkohol, die an ihrer Oberfläche, je nach Anwendung, mit spezifischen funktionellen Gruppen zur Materialbindung beladen sind, wie beispielsweis mit Oligo-dT-Partikeln zur Isolierung von mRNA oder mit Silica zur universelleren Bindung von DNA und RNA. Für die Beladung der magnetischen Partikel mit funktionellen Gruppen haben die verschiedenen Firmen individuelle Spezifikationen. Die „magnetic beads“ können im automatisierten Prozess im Anschluss an die Zelllyse die DNA- bzw. RNA-Fragmente binden. Durch Anlegen eines Magnetfeldes, entweder außerhalb des Reaktionsgefäßes oder innerhalb des Reaktionsgefäßes mit einem Stab(rod) oder Plunger, heften sich die an den „magnetic beads“ gebundenen DNA-/RNA-Fragmente an den Plunger oder die dem Magneten unmittelbar anliegende Wand des Reaktionsgefäßes, sodass das Lysat entweder abpipettiert werden kann oder alternativ der Plunger mit den gebundenen DNA-Partikeln in ein anderes Reaktionsgefäß geführt werden kann. Hierdurch werden die Zentrifugationsschritte anderer Protokolle umgangen. Durch Zugabe von Puffern und Entfernen oder Anlegen des magnetischen Feldes wird die DNA bzw. RNA anschließend gewaschen, bevor sie in Wasser oder einem Puffer gelöst wird.