Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik
Autoren
R. Westermeier

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Synonym(e)
PAGE
Englischer Begriff
polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE
Definition
Variante der Elektrophorese unter Einsatz von flachen Polyacrylamid-Gelen.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Bei der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese erzielt man bei der Trennung von Proteinen und DNA-Fragmenten sehr hohe Auflösung, weil das Trennmedium Polyacrylamid enge Poren besitzt, und gleichzeitig chemisch und physikalisch völlig inert ist. Bei dieser Form der Elektrophorese von Proteinen ist die Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von der Ladung und der Molekülgröße.
Die Gele stellt man durch eine Polymerisation von Acrylamid und einem Vernetzer her, meist N,N’-Methylenbisacrylamid (Bis). Als Initiator wird Ammoniumpersulfat verwendet, das in Gegenwart der tertiären Aminogruppen von N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Radikale abspaltet. Die Siebwirkung von Polyacrylamidgelen lässt sich durch die Zusammensetzung der Polymerlösung exakt kontrollieren: durch die eingesetzte Konzentration an Acrylamid-Monomeren (T-Wert) und dem Vernetzungsgrad (Crosslinking, C-Wert). Je höher der T-Wert, umso kleiner sind die Poren. Normalerweise wird mit 12 % T- und 3 % C-Gelen gearbeitet. Die Schichtdicken sind 0,5 mm bei horizontalen und 1–1,5 mm bei vertikalen Gelen. Die Polymerisation muss in Abwesenheit von Luftsauerstoff erfolgen, da dieser zum Kettenabbruch führen würde.
Polyacrylamid-Gel-Elektrophoresen werden in Glaskassetten in vertikaler Richtung oder auf Trägerfolien auf horizontalen Kühlplatten durchgeführt (Abb. 1). Für die Probenaufgabe auf vertikale Gele müssen die Proben mit 20 % Glyzerol versetzt werden, damit sie sich nicht mit dem oberen Puffer vermischen; das ist bei horizontalen Gelen nicht notwendig.
Als Nachweismethoden werden verwendet für Proteine Coomassie-Färbung, Silberfärbung, Zymogramm-Technik, für DNA Fragmente Silberfärbung oder Ethidiumbromid-Färbung, Autoradiografie, Fluoreszenzmarkierung.
Weil sich aus dem Ergebnis einer nativen Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese die Molekülgröße und die Ladung eines Proteins nicht direkt ableiten lassen, wendet man meist die SDS-Elektrophorese (Trennung rein nach Molmassen) oder die Isoelektrische Fokussierung (Trennung rein nach Ladungen) in Polyacrylamidgelen an.
Für DNA-Fragmentanalysen werden teils native, teils denaturierende (8 mmol/L Harnstofflösung, 65 °C) Bedingungen gewählt. Unter denaturierenden Bedingungen ist die Laufstrecke umgekehrt proportional zur Molekülgröße, unter nativen Bedingungen ist sie abhängig von Molekülgröße und DNA-Sequenz.
Einsatzgebiet
Proteinuriediagnostik; Enzymnachweise; SDS-Elektrophorese; DNA-Fragmentanalysen, z. B. für Forensik, Genetik, DNA-Sequenzierung, Typisierung von Mikroorganismen.
Untersuchungsmaterial
Urin, Humanserum; PCR-Amplifikate.
Instrumentierung
  • Elektrophoresekammer: vertikal oder horizontal (mit Umlaufkryostat)
  • Ggf. Umlaufkryostat
  • Stromversorger
  • Färbeschalen oder Färbeautomat
Für DNA-Fragmentanalysen benötigt man:
  • Elektrophoresekammer: vertikal oder horizontal (mit Umlaufkryostat)
  • Ggf. Umlaufkryostat
  • Stromversorger
  • Färbeschalen oder Färbeautomat
Spezifität
Bei Enzymnachweisen erhält man hohe Spezifität (Spezifität, diagnostische).
Sensitivität
Die Nachweisempfindlichkeit liegt bei ca. 50 pg bei Silberfärbung und bei 5 ng bei Coomassie-Färbung.
Fehlermöglichkeit
Die meisten Fehler ergeben sich bei der Herstellung von Gelen im Labor. Diese können durch Verwendung kommerzieller Fertiggele weitestgehend ausgeschlossen werden.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten.
Mit Fertiggelen und Färbeautomaten ist die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese einfach durchzuführen. Es gibt automatisierte Elektrophoresesysteme. Während die Geräte relativ preiswert sind, erzeugen die Verbrauchsmaterialien wie Fertiggele, Puffer und Färbereagenzien die meisten Kosten.
Literatur
Lottspeich F, Engels JW (Hrsg) (2012) Bioanalytik, 3. Aufl. Heidelberg, Spektrum Akademischer Verlag
Westermeier R (2016) Elektrophorese leicht gemacht. Weinheim, VCH