Pressblotting
Pressblotting
Englischer Begriff
pressure blotting
Definition
Transfer von Proteinen aus Agarose- oder Polyacrylamidgelen durch Druck und Kapillarkraft.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Agarosegele: Erst wird eine feuchte Blotmembran auf das Gel gelegt, darauf ein Stapel von trockenen Filterpapieren, darauf wiederum eine Glasplatte und ein Gewicht mit 1 kg/100 cm2. Der Transfer erfolgt in ein paar Sekunden.
Pressblotting ist die ideale Methode für Proteintransfers aus IEF-Polyacrylamidgelen, weil die Proteine am isoelektrischen Punkt keine Nettoladung und deshalb keine elektrophoretische Mobilität für einen Elektrotransfer haben und weil großporige Gele verwendet werden. Zur Erhöhung der Löslichkeit von Proteinen in Harnstoffgelen inkubiert man Gel und Blotmembran vor dem Transfer für 3 Minuten in einem Puffer mit 4 mol/L Guanidin-HCl in 50 mmol/L Tris-Cl pH 7,5.
Einsatzgebiet
Protein Blotting aus großporigen und foliengestützten Agarose- und Polyacrylamidgelen.
Untersuchungsmaterial
Biologische Flüssigkeiten, Gewebeextrakte, Zelllysate.
Instrumentalisierung
Ausrüstung für Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestehend aus Horizontal- oder Minivertikalkammer, Stromversorger, Umlaufthermostat; Glasplatte, Gewicht mit mehreren Kilogramm; es gibt auch eigene Apparaturen für Pressblotting mit Hebelsystem anstelle des Gewichts.
Spezifizität
Hoch, da die Methode auf Immunreaktion beruht.
Sensitivität
Je nach verwendetem Detektionssubstrat von Nanogramm bis niedrigen Picogramm oder hohen Femtogramm.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Vereinfachtes Blotting von foliengestützten Gelen.
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Pressblotting ist eine Methode für biochemisch arbeitende Labors. Gibt meist gleichmäßigere Proteintransfers als Elektroblotting.
Literatur
Towbin H, Özbey Ö, Zingel O (2001) An immunoblotting method for high-resolution isoelectric focusing of protein isoforms on immobilized pH gradients. Electrophoresis 22:1887–1893CrossRef