Pyrosequenzierung
Pyrosequenzierung
Synonym(e)
Pyrosequenzier-Technik
Englischer Begriff
pyrosequencing
Definition
Pyrosequenzierung ist eine Variante der DNA-Sequenzierung, die auf der Detektion von freigesetzten Pyrophosphaten beim Einbau von Nukleotiden basiert.
Beschreibung
Ähnlich der Sanger-Sequenzierung erfolgt bei der Pyrosequenzierung ebenfalls die Neusynthese eines komplementären DNA-Strangs, jedoch ohne Kettenabbruch durch Didesoxynukleotide (Details s. bei entsprechendem Eintrag).
Weit verbreitet ist die „solid phase template preparation“, bei der das Template am 5′-Ende mit einem Biotinmolekül markiert ist und in der eigentlichen Sequenzierreaktion über Bindung mit Streptavidin-markierten „magnetic beads“ festgehalten wird. Ein Primer wird an die einzelsträngige DNA hybridisiert und der zum Template komplementäre Strang durch Einbau der entsprechenden Nukleotide (s. a. Didesoxynukleotide) verlängert. Bei der Pyrosequenzierung werden die einzelnen Nukleotide nacheinander zum Einbau angeboten und auch wieder entfernt. Die Nukleotide geben bei Einbau Pyrophosphate frei, was mit der Freisetzung eines Fluoreszenzsignals gekoppelt ist. Die Pyrophosphate (PPi) werden durch das Enzym Aryl-Sulfurylase in Gegenwart von Adenosin-5′-Phosphosulfat zu ATP umgewandelt und anschließend von dem Enzym Luciferase unter Emission von Fluoreszenz verbraucht. Das detektierte Fluoreszenzsignal wird als Pyrogramm dargestellt. Entsprechend des zum Zeitpunkt der Freisetzung des Pyrophosphats bzw. des Fluoreszenzsignals angebotenen Nukleotids wird so die eingebaute Base bestimmt.
Bei Heterozygotie in dem Template-Gemisch ist die Fluoreszenzintensität reduziert und ermöglicht die Identifizierung der beiden entsprechenden Basen.
Problematisch ist die Pyrosequenzierung von repetitiven Abschnitten oder einer Aufeinanderfolge identischer Nukleotide. In den Anfängen des Next-Generation-Sequencing (NGS) beruhte der 454-Sequencer (Roche) auf der Pyrosequenziertechnik, wurde aber zwischenzeitlich eingestellt. Weitergehenden Einsatz findet die Pyrosequenzierung z. B. bei der Identifizierung von SNPs (s. SNP) oder kurzer Sequenzabschnitte mit dem Pyromark-Gerät (Qiagen).