Restriktionsendonuklease

Restriktionsenzym; Restriktionsnuklease

restriction endonuclease

Restriktionsendonukleasen, auch verkürzt Restriktionsenzyme oder Restriktionsnukleasen genannt, sind Enzyme, die doppelsträngige DNA an definierten Erkennungssequenzen schneiden können.

Restriktionsendonukleasen kommen nur in Mikroorganismen vor und werden aus diesen isoliert. Sie haben meist eine Abfolge von 4–8 Nukleotiden als spezifische Erkennungssequenz, an der sie binden und die DNA schneiden können. Als physiologische Funktion wird eine Erkennung und gezielte Zerstörung eingedrungener Fremd-DNA zum Schutz der Bakterienzelle diskutiert.

Bislang sind weit über 250 Restriktionsendonukleasen mit unterschiedlichsten Spezifitäten beschrieben. Diejenigen Restriktionsenzyme, die zwar aus unterschiedlichen Mikroorganismen isoliert worden sind, aber die gleiche Erkennungssequenz haben, werden Isoschizomere genannt.

Allgemein fasst man 4 Haupttypen zusammen:

Die eigentliche Bedeutung der Restriktionsenzyme – und hier fast ausschließlich vom Typ II – liegt heutzutage im Einsatz bei biotechnologischen Verfahren und der molekulargenetischen Diagnostik.

Mittels der kommerziell verfügbaren Restriktionsenzyme vom Typ II kann eukaryotische, insbesondere humane DNA gezielt gespalten werden, um beispielsweise diese DNA-Fragmente im Genom zu kartieren (Restriktionskartierung), um sie einer gezielten Diagnostik zuzuführen (Restriktionsfragmentlängenanalyse) oder diese Fragmente gezielt in Vektoren zu klonieren.

Die Erkennungssequenzen dieser Restriktionsenzyme stellen meistens eine Palindromstruktur dar, d. h. eine Sequenz, die vorwärts (sense) und rückwärts (antisense) die gleiche Sequenz ergibt. Die Anzahl der Nukleotide variieren meist zwischen 4, 6 und 8, aber auch ungerade Varianten mit 5 Nukleotiden gibt es, wobei das mittlere Nukleotid meist als sog. Füllung dient. Bei der Spaltung der DNA kann es zu „sticky ends“ kommen, wenn die Spaltung unsymmetrisch in der Erkennungssequenz erfolgt und die beiden resultierenden, doppelsträngigen DNA-Fragmente einen kurzen einzelsträngigen Überhang zeigen. Dies trifft beispielsweise zu auf das Restriktionsenzym BamHI mit der Erkennungssequenz G/GATCC, bei der der Schnitt nach dem ersten G erfolgt.

Findet die Spaltung jedoch in der Mitte der Erkennungssequenz statt, wie z. B. bei dem Restriktionsenzym PvuII mit der Erkennungssequenz CAG/CTG, erfolgt der Schnitt zwischen dem G und dem C. Daraus resultieren 2 doppelsträngige „Blunt-end“-DNA-Fragmente mit glatten Enden. Bei Klonierungs- und Ligationsarbeiten lassen sich DNA-Fragmente mit „sticky ends“ leichter bearbeiten, da durch die einzelsträngigen Überhänge diese Fragmente eine Orientierung zeigen und leichter kloniert werden können.

Eine gewisse Besonderheit stellen die methylierungssensitiven Restriktionsenzyme dar, die diagnostisch oftmals hilfreich bei der Untersuchung des Methylierungsstatus sind. Beispielhaft seien hier die beiden Isoschizomere MspI und HpaII genannt, die beide die Erkennungssequenz C/CGG haben und die DNA nach dem zweiten C spalten. Während MspI immer spaltet, kann HpaII nur unmethylierte DNA spalten. Hierdurch werden unterschiedliche Fragmente erzeugt.