Sanger-Sequenzierung

DNA-Sequenzierung nach Sanger

Sanger sequencing

Die DNA-Sequenzierung nach Sanger ermöglicht die Bestimmung der Nukleotidfolge in einem DNA-Molekül mittels der Didesoxy- oder Kettenabbruchmethode.

Dem Biochemiker Sanger (Sanger, Frederick) gelang der entscheidende Durchbruch zur Sequenzierung, d. h. Bestimmung der Nukleotidfolge, eines definierten DNA-Moleküls. Sanger entwickelte hierfür die sog. Kettenabbruchmethode, die anfangs alle 4 Basen getrennt analysierte.

Im ersten Schritt der Reaktion wurde die zu sequenzierende doppelsträngige DNA-Matrize durch Hitze zu einzelsträngigen Molekülen denaturiert und anschließend eine synthetisierte DNA-Sequenz, ein sog. Primer, hinzugefügt, der mit Abkühlen der Reaktion an die DNA-Matrize hybridisierte.

Parallel wurden 4 Reaktionsansätze pipettiert, die als G-, A-, T- oder C-Reaktion markiert wurden. In jeden Ansatz wurde ein Mix aus Reaktionspuffer, den 4 dNTPS (Deoxynukleotidtriphoshate; dGTP, dATP, dTTP, dCTP), zu einem geringen Anteil radioaktiv markierte dNTP-Moleküle (meist ³⁵S-dCTP) und ein weiterer Anteil der für jede Reaktion spezifischen ddNTP-Moleküle (Dideoxynukleotidtriphoshate; ddGTP, ddATP, ddTTP oder ddCTP) hinzugefügt. Nach anschließender Zugabe des DNA-Gemischs und DNA-Polymerase (Klenow-Enzym) wurde die eigentliche Sequenzierreaktion durch Inkubation bei 37 °C gestartet.

Bei der Synthese des neuen DNA-Strangs werden radioaktive Moleküle und, in jedem Reaktionsansatz spezifisch nach dem Zufallsprinzip die jeweiligen ddNTPs eingebaut. Da den ddNTPs eine OH-Gruppe am 3’C-Atom fehlt, kann nach Einbau eines ddNTP-Moleküls in den neuen DNA-Strang keine weitere Verknüpfung erfolgen und es kommt zum Kettenabbruch. Da dieser Einbau nach dem Zufallsprinzip abläuft, werden in jedem Reaktionsansatz DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge synthetisiert, die alle mit dem gleichen ddNTP enden, d. h. im G-Ansatz mit ddGTP, im A-Ansatz mit ddATP etc.

Zur Auswertung und Lesen der Nukleotidabfolge wurden die 4 Reaktionsansätze denaturiert und parallel in ein besonders langes Polyacrylamid-Gel (Sequenziergel) pipettiert und elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Elektrophoreselauf wurde das Gel fixiert und anschließend mit einem Röntgenfilm in einer Autoradiographiekassette „exponiert“. Nach dem Entwickeln des Röntgenfilms waren in den jeweils 4 parallelen Spuren dunkelgraue Banden mit unterschiedlichem Leitermuster zu sehen. Die radioaktive Markierung hat die Banden auf dem Film sichtbar gemacht. Jede Bande zeigt die Größe eines DNA-Fragments an, das in der entsprechenden Spur beispielsweise mit einem G geendet hatte. Nach den Prinzipien der Elektrophorese sind die kürzesten DNA-Fragmente und damit der Beginn der Sequenz im unteren Bereich des Films zu finden. Zum Lesen der Sequenz fängt man daher unten an und „hangelt“ sich quer über die 4 Spuren wie auf einer Leiter nach oben und notiert dabei die Abfolge der Nukleotide. Diese Nukleotidfolge entspricht dabei der komplementären Sequenz der DNA-Matrize.

Diese Methode wurde über die vergangenen Jahrzehnte immer mehr modifiziert, vereinfacht und tauglich für eine automatische Abarbeitung gemacht:

Durch Einsatz des Cycle-Sequencings, einer PCR-Methode, bei der aber nur mit einem Primer in eine Richtung amplifiziert wird, wie auch durch den Einsatz von ddNTPS, die mit je 4 verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, lässt sich auch aus relativ geringen DNA-Mengen eine Sequenzanalyse durchführen. Der mit besonderen Sicherheitsmaßnahmen gekoppelte Einsatz radioaktiver Moleküle entfällt. Die nun fluoreszenzmarkierten Sequenzierreaktionen werden durch Kapillarelektrophorese in einem DNA-Sequencer aufgetrennt und die Fluoreszenzmoleküle bzw. die entsprechenden Nukleotide beim Vorbeiwandern an einem Laserdetektor automatisch dokumentiert und nachfolgend mittels spezifischer Computerprogramme benutzergerecht aufbereitet.