Southern-Blot-Analyse
Southern-Blot-Analyse
Synonym(e)
Southernblot
Englischer Begriff
Southern blot analysis
Definition
Zweck der Southern-Blot-Analyse ist die Darstellung von spezifischen DNA-Fragmenten durch Hybridisierung mit definierten DNA-Sonden nach erfolgtem Transfer der restriktionsenzymatisch gespaltenen und im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Moleküle auf eine Trägerfolie.
Beschreibung
Die in einer Agarosematrix gelelektrophoretisch aufgetrennten DNA-Fragmente werden in Spiegelung des fotografisch dokumentierten Auftrennungsergebnisses in einem 1:1-Verhältnis auf eine Trägermembran übertragen und für weitergehende Anwendungen fixiert.
Die Übertragung erfolgt dabei im klassischen Southern-Blotting, einer Methode nach dem Biochemiker Southern (Southern, Edwin Mellor). Hierbei werden die gefärbten und fotografierten Agarosegele mit den längenmäßig aufgetrennten und als „Wolke“ nicht identifizierbaren DNA-Fragmenten durch Inkubationen in
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depurinierender Lösung (0,25 M HCl-Lösung) zur Fragmentierung,
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alkalischer Denaturierungslösung (0,5 N NaOH-1,5 M NaCl-Lösung) zur Überführung vom DNA-Doppel- zum DNA-Einzelstrang und
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Neutralisierungspuffer (z. B. 1 M Tris-HCl pH 5 – 3 M NaCl) zur Neutralisierung.
Das Gel wird anschließend auf den Southern-Blot-Apparat, einer Glasscheibe zwischen 2 Pufferbehältern (20× SSC-Lösung) gelegt mit Verbindung über dickes Filterpapier. Das Agarosegel wird mittels Frischhaltefolie an den Seiten perfekt abgedeckt. Anschließend wird die eigentliche Trägermembran (Nylon- oder Nitrozellulosemembran) passgenau auf das Gel platziert und mit einem Stapel Filterpapiere und einem kleinen Gewicht (250–500 g) bedeckt. Die Kapillarkräfte lassen den Puffer durch das Agarosegel und die Trägermembran nach oben in den Filterpapierstapel steigen, wobei die einzelsträngigen DNA-Fragmente mitgeführt werden und in korrespondierender Position an die Trägermembran binden und nach abgeschlossenen Transfer fixiert werden (z. B. durch UV-Licht).
Die Trägermembranen werden anschließend in Hybridisierungsexperimenten eingesetzt, wo definierte einzelsträngige DNA-Sonden (z. B. Plasmide), radioaktiv mittels P32 markierte Nukleotide oder nicht radioaktiv mittels DIG oder Biotin markierte Nukleotide, mit der Trägerfolie inkubiert werden. Die Sonden hybridisieren dabei mit den komplementären DNA-Fragmenten (z. B. Patienten-DNA) auf der Trägerfolie und bilden ein stabiles Hybridmolekül, das entsprechend der Markierung durch Autoradiografie (P32) oder Chemielumineszenz (DIG, Biotin) nachgewiesen wird. Die Größen der dargestellten DNA-Fragmente werden anhand von mitgeführten DNA-Markern bestimmt.
Die Southern-Blot-Analyse ermöglicht eine Kartierung und Zuordnung von DNA-Fragmenten im Rahmen einer RFLP-Analyse (Restriktionsfragmentlängenanalyse) und die Detektion pathologischer bzw. abweichender DNA-Fragmente im Krankheitsfall.
Die Methode hat in den vergangenen Jahren zugunsten der PCR-Techniken (s. PCR (Polymerase-Kettenreaktion)) an Bedeutung verloren und wird diagnostisch nur noch selten, wie z. B. zur Methylierungsanalyse bei fraX-Patienten (FMR1) eingesetzt.
Literatur
Roche Molecular Biochemicals (2000) DIG application manual for filter hybridization. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning – a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York