Pädiatrie
Autoren
Stefan Mundlos

Molekulare Diagnostik und Genomanalyse

Viele angeborene Krankheiten sind genetisch bedingt und damit potenziell aus ihrer Ursache bestimmbar. Mit immer feineren Methoden der Genomanalyse werden zahlreiche genetische Krankheiten identifiziert, differenziert und neue Krankheitsgene gefunden. Damit beginnt sich das diagnostische Prozedere grundlegend zu verändern, zumindest bei monogenen Erbleiden, also solchen, die durch einen einzelnen Gendefekt hervorgerufen werden. Je nach Vererbungsmodus handelt es sich hierbei um dominant oder rezessiv erbliche oder auch um Imprintingdefekte. Im Allgemeinen sind diese Krankheiten selten. Häufigere Defekte, z. B. isolierte Lippen-Kiefer-Gaumenspalten, sind dagegen im Allgemeinen nicht monogen, sondern polygen bedingt durch Veränderungen mehrerer Gene. Solche Veränderungen lassen sich derzeit (noch) nicht molekular diagnostizieren. Allerdings ist die Lage auch bei den monogenen Krankheiten komplex. So kann eine Krankheit einerseits durch mehrere verschiedene Gendefekte ausgelöst werden (sog. genetische Heterogenität), andererseits können verschiedene (allele) Mutationen ein- und desselben Gens völlig verschiedene Krankheitsbilder verursachen. Einem Gen kann damit nicht unbedingt eine Krankheit (und vice versa) zugeordnet werden. Entsprechend sollte eine Diagnose immer nur im Zusammenspiel von Klinik (Phänotyp) und molekularem Befund (Genotyp) gestellt werden.

Genotyp und Phänotyp

Viele angeborene Krankheiten sind genetisch bedingt und damit potenziell aus ihrer Ursache bestimmbar. Mit immer feineren Methoden der Genomanalyse werden zahlreiche genetische Krankheiten identifiziert, differenziert und neue Krankheitsgene gefunden. Damit beginnt sich das diagnostische Prozedere grundlegend zu verändern, zumindest bei monogenen Erbleiden, also solchen, die durch einen einzelnen Gendefekt hervorgerufen werden. Je nach Vererbungsmodus handelt es sich hierbei um dominant oder rezessiv erbliche oder auch um Imprintingdefekte. Im Allgemeinen sind diese Krankheiten selten. Häufigere Defekte, z. B. isolierte Lippen-Kiefer-Gaumenspalten, sind dagegen im Allgemeinen nicht monogen, sondern polygen bedingt durch Veränderungen mehrerer Gene. Solche Veränderungen lassen sich derzeit (noch) nicht molekular diagnostizieren. Allerdings ist die Lage auch bei den monogenen Krankheiten komplex. So kann eine Krankheit einerseits durch mehrere verschiedene Gendefekte ausgelöst werden (sog. genetische Heterogenität), andererseits können verschiedene (allele) Mutationen ein- und desselben Gens völlig verschiedene Krankheitsbilder verursachen. Einem Gen kann damit nicht unbedingt eine Krankheit (und vice versa) zugeordnet werden. Entsprechend sollte eine Diagnose immer nur im Zusammenspiel von Klinik (Phänotyp) und molekularem Befund (Genotyp) gestellt werden.
Die Prognostizierbarkeit von Phänotyp und Verlauf wird weiterhin kompliziert durch Faktoren der Variabilität und Penetranz. So weisen z. B. Patienten mit einer Mutation in Fibrillin 1 und Marfan-Syndrom eine hohe klinische Variabilität auf, die nicht aus der Mutation vorhersehbar ist. Ob und wann eine Aortendissektion oder andere schwerwiegende Komplikationen auftreten, ist derzeit nicht prognostizierbar und hängt wahrscheinlich von modifizierenden Faktoren aus der Einwirkung anderer Gene ab. Dieses Prinzip gilt für viele genetische Defekte, insbesondere, wenn sie dominant vererbt werden. Der Begriff Penetranz bezeichnet die relative Häufigkeit von klinisch erkennbaren Veränderungen bei Mutationsträgern. Nicht-Penetranz bedeutet, dass ein Mutationsträger einer Familie keine Krankheitszeichen aufweist, die Krankheit bei ihm also „nicht durchdringt“. Dieses Phänomen findet sich z. B. häufig bei der Ektrodaktylie, einer schweren Extremitätenfehlbildung, aber auch bei vielen anderen Krankheiten. Auch hier zeigt sich, dass eine molekulare Anomalie ohne die Klinik nicht interpretiert werden kann. Alle Ergebnisse sind im Licht der jeweiligen Modifikatoren insbesondere Variabilität und Penetranz zu betrachten und zu beurteilen.
Über die letzten Jahre hat sich gezeigt, dass bestimmte Krankheiten aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu Gruppen zusammen gefasst bzw. einem Krankheitsspektrum zugeordnet werden können. Ferner zeigte sich, dass die phänotypische Ähnlichkeit häufig auf eine gleiche Pathogenese zurückzuführen ist. So kann ein- und derselbe molekulare Signalweg an verschiedener Stelle verändert sein und zu einer ähnlichen Fehlregulation der zellulären Funktion führen. Beispielsweise ähneln sich Noonan-Syndrom, Leopard-Syndrom, kardiofaziokutanes Syndrom. Sie werden alle durch Mutationen hervorgerufen, welche die Ras/Raf-Signalkaskade aktivieren. Hier, wie in anderen Fällen, kann es notwendig sein, mehrere Gene der Signalkaskade zu analysieren. Neue Verfahren, mit denen sog. Genpanels getestet werden können, ermöglichen eine entsprechende Diagnostik.

Spezifische Tests

Molekulargenetik

Grundsätzlich sind spezifische Tests von globalen Tests zu unterscheiden. Letztere dienen als Suchtest, meistens bei unklarer Diagnose, während für spezifische Tests eine klinische Verdachtsdiagnose notwendig ist. Molekulare Gentests, die auf Sequenzierung basieren und molekulare Zytogenetik mittels FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, Abschn. 2.2) sind spezifische Tests. Die gegenwärtig am häufigsten benutzte DNA-Sequenzierungsmethode basiert auf einem von Fred Sanger entwickelten enzymatischen Verfahren. Hierbei fungiert die DNA als Matrize für die In-vitro Synthese eines neuen komplementären DNA-Strangs mithilfe einer DNA-Polymerase. Die für die Synthese notwendigen dNTPs (Desoxynucleosidtriphosphate) werden hinzugegeben, zusammen mit vier analogen Didesoxynukleotiden (ddNTPs), die, wenn eingebaut, zu einem Kettenabbruch führen. Da die Nukleotide kompetitiv eingebaut werden, erfolgt der Kettenabbruch zufällig, aber entsprechend der passenden Base (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin) an einer spezifischen Stelle. Werden die ddNTPs farblich markiert, und die neu synthetisierten DNA-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt, so kann mittels entsprechender Detektionsverfahren die Sequenz bestimmt werden (Abb. 1).
Besteht der konkrete Verdacht auf eine genetisch bedingte Krankheit und ist das Gen bekannt, so kann ein Test die klinische Diagnose bestätigen. Diese Information ist aus mehreren Gründen wertvoll. Zum einen ist die klinische Diagnose insbesondere bei seltenen Krankheiten nicht immer eindeutig und kann so endgültig bestätigt werden. Zum anderen ermöglicht eine molekulare Diagnose es, eine Trägerschaft innerhalb der Familie zu bestimmen und ein Wiederholungsrisiko zu errechnen. Häufig erlauben Korrelationen von Genotyp und Phänotyp Aussagen zu Verlauf, Komplikationen und Schweregrad der Krankheit. Für viele Patienten ist schließlich das Wissen über die Ursache ihrer Krankheit von ganz wesentlicher Bedeutung, da so bestehende Unsicherheiten beendet werden und eine Akzeptanz der Situation erleichtert wird. Grundsätzlich sollte daher bei allen genetischen Krankheiten eine molekulare Diagnose angestrebt werden. Der fehlende Nachweis einer Mutation berechtigt jedoch nicht zum Ausschluss einer klinischen Diagnose. Dies liegt an Mutationen, die derzeit (noch) nicht getestet werden können, z. B. regulative Veränderungen, sowie an genetischer Heterogenität durch bisher unbekannte Loki.
Für die Testung wird im Allgemeinen der kodierende Abschnitt des Gens mittels PCR amplifiziert und dann sequenziert. Die Sequenz wird mit der Referenzsequenz abgeglichen. und Veränderungen werden hinsichtlich ihrer Pathogenität eingestuft. Das Ergebnis wird im Befundbericht mitgeteilt. Mögliche pathogene Veränderungen sind:
1.
Missense-Mutation (Austausch einer Aminosäure für eine andere),
 
2.
Nonsense-Mutation (Austausch eines Codons, das für eine Aminosäure kodiert, in ein Stopp-Codon,
 
3.
Spleiß-Mutation (Spleißstellen erzeugen oder verschließen, was zu einem abnormen Transkript führt),
 
4.
Insertion oder Deletion einer Base mit oder ohne Verschiebung des Leserasters (frame shift),
 
5.
Deletionen von ganzen Segmenten des Gens, z. B. mehreren Exons.
 
Die Sequenzierung gilt als Goldstandard zur Erkennung von Veränderungen (1–4.). Deletionen oder Duplikationen können im Allgemeinen nur erfasst werden, wenn sie klein sind bzw. zu einem PCR-Produkt führen, ansonsten wird nur das gesunde Allel amplifiziert. Ergänzende Verfahren sind hier die MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) und die quantitative PCR, mit denen sich Dosisunterschiede an einem zuvor definierten Ort im Genom nachweisen lassen.
Die neuen Verfahren des Next Generation Sequencing (NGS, Abschn. 3.2) ermöglichen die Sequenzierung vieler DNA-Fragmente auf einmal. Nach spezieller Anreicherung über PCR-basierte Verfahren oder Capture-Technologie ist es möglich, bestimmte Abschnitte des Genoms anzureichern und dann zu sequenzieren (Abb. 2). So können bestimmte Genpanels erstellt werden, mit denen z. B. alle Gene für erbliche Taubheit abgedeckt werden. Diese neuen Verfahren werden die molekulare Diagnostik grundlegend verändern und die Sequenzierung einzelner Abschnitte weitgehend ablösen. Zur genetischen Befundung gehören Überlegungen zur Pathogenität der gefundenen Abweichungen. Dies ist möglich durch den Vergleich mit Datenbanken, in denen Polymorphismen und deren Häufigkeit, wie auch krankheitsbezogene Mutationen aufgelistet sind. Bei bekannten Mutationen, die eindeutig mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, ist die Interpretation im Allgemeinen unproblematisch. Allerdings werden häufig Veränderungen gefunden, die nur in Zusammenhang mit der Gen-/Proteinfunktion und der Klinik interpretiert werden können. Zur weiteren Abklärung müssen dann evtl. weitere Familienangehörige untersucht werden, um festzustellen, ob die Veränderung auch bei Gesunden vorhanden ist oder beim Kranken de novo aufgetreten ist.

Molekulare Zytogenetik

Neben der PCR stehen molekularzytogenetischen Methoden zur Verfügung, mit denen einzelne Chromosomenabschnitte gezielt auf das Vorhandensein von Aberrationen, insbesondere Deletionen, untersucht werden. Mittels FISH werden markierte DNA-Fragmente, sog. Sonden auf luftgetrocknete Präparationen von Metaphasechromosomen auf einem Objektträger hybridisiert. Die Sonden-DNA wird direkt durch Einbau fluoreszierender Nukleotidvorstufen oder indirekt über Einbau eines Nukleotids mit einer Reportergruppe markiert. Die Auswertung erfolgt am Fluoreszenzmikroskop, wobei positive Signale oft als doppelte Signale erscheinen, die den beiden Chromatiden entsprechen. Über verschieden farbige Markierung der Sonden ist es möglich, mehrere Regionen gleichzeitig zu testen. Ferner kann die Fusion zweier benachbarter DNA-Fragmente, z. B. bei einer Translokation, dargestellt werden (überlappen eine rot und eine grün markierte Sonde, so wird das Signal gelb). Die maximale Auflösung einer Metaphasen-FISH-Analyse beträgt mehrere Mb.
FISH ist die Standardmethode, um spezifische Mikrodeletionssyndrome nachzuweisen. Da die Analyse pro Zelle erfolgt, sind mit dieser Methode Mosaike besonders gut nachzuweisen. Eine zusätzliche Erweiterung der Chromosomenfärbung ist die komparative Genomhybridisierung. Hierbei werden für bestimmte Bereiche, z. B. ganze Chromosomen, DNA-Sonden aus zwei verschiedenen Quellen verwendet, die unterschiedlich farblich markiert sind. Der Vergleich erfolgt aufgrund der Verhältniszahlen zwischen beiden Fluoreszenzsignalen (Array-CGH, Abschn. 3.1).

Epigenetik

Die Regulation der Genexpression ist ein entscheidender Prozess in der menschlichen Entwicklung und Homöostase. Durch den epigenetischen Code kann Genaktivität gesteuert und diese Information an die nächste (Zell-)Generation weitergegeben werden. Epigenetische Einflüsse erwachsen zum einen aus der spezifischen Methylierung der Cytosine der DNA, die spezifisch methyliert werden können und so die Genexpression herabregulieren. Zum anderen beeinflussen Proteine des Chromatins die Genexpression, vor allem durch Methylierung oder Acetylierung der Aminosäuren der Histone. Störungen des epigenetischen Codes können sowohl Wachstum und Entwicklung des Menschen beeinflussen als auch die zelluläre Differenzierung und damit der Entwicklung von Krebs.
Im Bereich der Pädiatrie sind Mechanismen wichtig, die Allelausschluss durch elterliche Prägung im Imprinting-Center steuern. Bei bestimmten Genen werden physiologischerweise die väterlichen oder mütterlichen Allele durch Methylierung abgeschaltet und es kommt zur allelspezifischen paternalen oder maternalen Genexpression. Diese Form der epigenetischen Prägung kann durch verschiedene Mechanismen gestört sein. Werden beispielsweise zwei Chromosomen von einem Elternteil vererbt (bei Verlust des anderen), so entsteht eine uniparentale Disomie mit zwei väterlichen oder zwei mütterlichen Chromosomen. In diesem werden Gene, die dem Imprinting unterliegen, zu stark oder nicht exprimiert. Einen ähnlichen Effekt hat die Deletion eines Imprinting-Centers, die eine korrekte Methylierung verhindert. Krankheiten, bei denen die epigenetische Genregulation gestört ist, sind u. a. das Prader-Willi-Syndrom, Angelman-Syndrom, Beckwith-Wiedemann-Syndrom oder das Russell-Silver-Syndrom.
Das Methylierungsmuster entsprechender DNA-Regionen kann mittels einer methylierungssensitiven restriktiven Verdauung untersucht werden. So kann das Vorhandensein bzw. das Fehlen unterschiedlich methylierter Allele identifiziert werden. Eine weitere Methode, mit der größere Bereiche der DNA auf ihren Methylierungsgrad untersucht werden können, ist die Bi-Sulfit-Sequenzierung. Durch Behandlung von DNA mit Natriumhydrogensulfit werden Cytosine (C), nicht aber 5-Methylcytosin (5-MeC) in Uracil (U) umgewandelt. Bei einer anschließenden Sequenzierung findet man daher an den Stellen, wo vorher ein nicht methyliertes C war, nun ein Thymin, während 5-MeC als Cytosin erscheint. Man kann mit dieser Methode exakt analysieren, welche CG-Dimere in einer bestimmten Zelle methyliert waren.

Globale Tests

Variationen der Kopienzahl und Array-CGH

Eine Variation in der Kopienzahl (copy number variation, CNV) ist eine Veränderung nicht in der Sequenz, sondern der Zahl und Struktur der vorhandenen DNA-Abschnitte. Der normalerweise vorhandene diploide Satz kann reduziert (Deletion), vermehrt (dupliziert oder auch mehrfach amplifiziert) oder invertiert vorliegen. Solche CNVs können von wenigen Kilobasen bis zu mehreren Megabasen oder ganzen Chromosomen (z. B. Trisomien, Monosomien) reichen. Deletionen führen häufig zum Verlust von Genen oder Teilen davon und äußern sich dann in einer Krankheit, wenn die Genfunktion dosisabhängig ist. Duplikationen resultieren oft in drei Kopien; allerdings gibt es auch Regionen im Genom, die in höheren Kopienzahlen vorliegen. Zahlreiche Studien haben belegt, dass Duplikation oder auch Deletionen in bestimmten Regionen des Genoms toleriert werden, d. h. auch Polymorphismen sein können. Als solche tragen CNVs erheblich zur Variabilität unseres Genoms bei.
Technisch sind Veränderungen von maximal 5–10 Mb mithilfe von konventionellem Chromosomen-Banding sichtbar. Kleinere Veränderungen können mittels molekularer Zytogenetik und FISH identifiziert werden. Letztere Technologie erlaubt die gezielte Suche nach Mikrodeletionssyndromen, z. B. Williams-Beuren-Syndrom (Deletion auf 7q11.23) oder Smith-Magenis-Syndrom (Deletion auf 17p12). Eine genomweite Suche ist hiermit aber nicht möglich. Erst die Entwicklung von Methoden der komparativen Genomhybridisierung machte die Untersuchung des ganzen Genoms auf CNVs möglich.
Die arraybasierte komparative Genom-Hybridisierung (Array-CGH) ist ein Verfahren, mit dem das ganze Genom (oder ein Teil davon) auf Imbalancen (Duplikationen, Deletionen) untersucht werden kann (Abb. 3). Der Begriff Array bezieht sich in diesem Kontext auf die regelmäßige, rasterförmige Anordnung von DNA-Fragmenten auf einem Objektträger. Die DNA-Fragmente wurden durch ein spezielles Verfahren auf der Oberfläche immobilisiert, sodass jeweils ein DNA-Fragment einem Bereich des Objektträgers zugeordnet ist. Je nach Verfahren handelt es sich hierbei um 100.000 bis 1 Mio. einzelne Fragmente. Es entsteht somit ein Abbild des Genoms auf dem Objektträger, bei dem jedes DNA-Fragment einem bestimmten Bereich im Genom entspricht. Die Array-CGH basiert auf dem Prinzip der vergleichenden Hybridisierung von Patienten-DNA gegen Referenz-DNA. In der Auswertung kann dann für jedes repräsentative DNA-Fragment eine Aussage über die Kopienzahl (normal 2×, Deletion 1×, Duplikation 3×) des jeweiligen DNA-Abschnitts gemacht werden. Die Methode erlaubt eine ungezielte genomweite Suche nach CNVs. Die Array-CGH ist technisch einfach, aber dennoch hoch effizient und benötigt im Vergleich zur konventionellen Zytogenetik keine sich teilenden Zellen, also keine Kultivierung der Proben. Benötigt wird nur genomische DNA, die beispielsweise aus einer Blutprobe, aber auch aus Fruchtwasser oder Chorionzotten isoliert werden kann.
Anzahl und Dichte der DNA-Fragmente auf dem Chip bestimmen die Auflösung der Array-CGH. Je mehr DNA-Fragmente auf dem Objektträger aufgetragen werden, umso genauer ist die Abbildung des Genoms. Hier liegt jedoch gleichzeitig eine der größten Herausforderungen dieser neuen Technologie, denn die Array-CGH führt zur Erkennung von zahlreichen Polymorphismen, d. h. Kopienzahl-Veränderungen, die auch in der Normalbevölkerung nachgewiesen werden und vermutlich keine klinische Relevanz haben. Viele Veränderungen sind individuell und daher in Bezug auf ihre klinische Relevanz schwer zu beurteilen. Insbesondere im Pränatalbereich ist eine sichere Korrelation zwischen DNA-Test (Genotyp) und klinischem Erscheinungsbild (Phänotyp) schwierig.
Mithilfe der Array-CGH wurden in den letzten Jahren zahlreiche „neue“ Mikrodeletionssyndrome beschrieben. Datenbanken wurden erstellt, welche die Beurteilung von Array-CGH-Befunden erleichtern. Die Ergebnisse einer Array-CGH-Untersuchung werden mit gespeicherten Daten verglichen und wie folgt gewertet:
1.
Kein Nachweis einer klinisch relevanten Aberration.
 
2.
Nachweis einer klinisch relevanten Aberration, die mit einer bekannten genetischen Krankheit/Phänotyp assoziiert ist.
 
3.
Veränderung unklarer klinischer Relevanz, die auch bei einem Elternteil nachgewiesen wurde.
 
4.
Veränderung unklarer klinischer Relevanz, die nur beim Patienten und nicht in der DNA der Eltern nachgewiesen wurde (De-novo-Veränderung).
 
Die Untersuchung der Eltern kann ebenfalls mit Array-CGH, oder besser mit alternativen Methoden (FISH, quantitative PCR) erfolgen.
Unter Berücksichtigung dieser Kriterien zeigten umfangreiche Studien, dass 10–15 % der Fälle mit unklarer Diagnose, z. B. bei Fällen mit unklaren Fehlbildungen und/oder mit geistiger Behinderung, pathologische Veränderungen im Array-CGH haben. Aufgrund dieser Häufigkeit sollte die Array-CGH in Fällen mit unklarer Diagnose (postnatal) als Standarddiagnostik eingesetzt und der herkömmlichen Chromosomenanalyse mit ihrer geringeren Auflösung vorgezogen werden.
Einschränkend ist zu bemerken, dass die Array-CGH zwar Methode der Wahl zum Nachweis von Veränderungen der Kopienzahl, nicht jedoch von Strukturveränderungen ist, die nicht mit einem Verlust oder Gewinn von genetischen Material einhergehen. So sind Inversionen oder auch Translokationen, sofern sie balanciert, also ausgeglichen sind, nicht nachweisbar. Sie können aber trotzdem pathogen wirken, indem sie z. B. die Einheit der regulativen Elemente und Exone eines Gens zerstören oder zur Fusion mit anderen Genen führen.

Genomsequenzierung

Das Humane Genomprojekt (Human Genome Project, HUGO) wurde offiziell 1990 mit dem Ziel begonnen, alle Gene des Menschen zu identifizieren, die ca. 3,2 Mrd. bp des menschlichen Genoms zu sequenzieren und damit weiteren Untersuchungen zugänglich zu machen. Weiterhin sollten im Zuge des Projekts neue Verfahren zur Genom- und Datenanalyse entwickelt, sowie ethische, rechtliche und soziale Fragestellungen diskutiert werden. 2001 wurde die vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms bekannt gegeben, aber erst einige Jahre später war die menschliche Genomsequenz wirklich in allen Abschnitten verfügbar. Mit der damals vorhandenen Technologie der Sanger-Sequenzierung war die Sequenzierung eines Genoms eine Herkulesaufgabe, die nur mit massivem personellen, materiellen und nicht zuletzt finanziellen Aufwand (insgesamt mehr als 1 Mrd. US $) durchgeführt werden konnte. Wenig später wurde das erste persönliche Genom mit Sanger-Sequenzierung durchgeführt (Craig Venter, veröffentlicht 2007). Der enorme Preis (ca. 10 Mio. US $) und Aufwand machten die medizinische Anwendung, z. B. in der medizinischen Diagnostik, allerdings wenig praktikabel.
Der Durchbruch in der DNA-Sequenziertechnologie erfolgte wenig später mit der Einführung des sog. Next Generation Sequencing (NGS). NGS-Technologien beruhen auf anderen Verfahren als die Sanger-Sequenzierung und unterscheiden sich im Wesentlichen dadurch, dass nicht ein DNA-Strang nach vorheriger Amplifizierung einzeln sequenziert wird, sondern dass viele Stränge gleichzeitig (massive parallel sequencing) sequenziert werden. Dies wird dadurch möglich, dass DNA-Moleküle einzeln und dann klonal expandiert werden. Die parallele Sequenzierung dieser Molekülklone kann über verschiedene Plattformen mit unterschiedlichen Nachweisverfahren erfolgen. So kann z. B. über den Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden die Farbreaktion über hochauflösende optische Scanner erkannt werden. Alternative Verfahren messen den Protonenfluss beim Einbau der spezifischen Nukleotide. Alle Verfahren bieten die Möglichkeit große Mengen von Klonen in einem Lauf zu sequenzieren. Nachteil der Sequenzierung des gesamten Genoms ist die Produktion großer Datenmengen und der erhebliche Aufwand. Die Interpretation der Varianten ist aufgrund der enormen Zahl (ca. 2 Mio. pro Genom ohne strukturelle Varianten) und der meist unklaren Bedeutung schwierig. Andere Verfahren, bei denen nur Teile des Genoms sequenziert werden, sind praktikabler und werden bereits klinisch genutzt. Zu ihnen gehört die Exom-Sequenzierung, d. h. die Sequenzierung nur der kodierenden Gene (Exom) des Genoms, ein Verfahren mit hoher Effizienz. Als Exom wird die Summe aller Exons oder der kodierenden Region des Genoms bezeichnet. Je nach Auslegung handelt es sich hierbei um ca. 1–1,5 % des Genoms und somit 30–60 Mb. Vor der Sequenzierung eines Exoms muss dieser Bereich des Genoms angereichert und vom Rest getrennt werden. Dies geschieht über Verfahren, bei denen DNA- oder RNA-Fragmente, die komplementär zur Ziel-DNA sind, mit der genomischen DNA hybridisiert und dann immobilisiert werden. Die nicht gebundene DNA kann dann weggewaschen und die angereicherte DNA sequenziert werden. Mit PCR und anderen Methoden lassen sich besonders interessierende Gene (gene panels), z. B. einer Krankheitsgruppe, anreichern und gezielt sequenzieren.
Für die Analyse der so gewonnenen Sequenzdaten sind bioinformatische Verfahren notwendig, zunächst zum Vergleich der Sequenz mit der Referenz-DNA und dann zur Identifikation und Interpretation von Sequenzvarianten. Bei einer Exom-Sequenzierung fallen ca. 20.000 Varianten an, unter denen es die pathogene Veränderung zu identifizieren gilt. Dies erfolgt über einen Abgleich mit Datenbanken, welche die Häufigkeit von Varianten, sog. single nucleotide polymorphisms (SNPs), zeigen. Polymorphismen werden identifiziert und aussortiert. Als nächster Schritt ist die funktionelle Relevanz zu prüfen, also ob es sich um Mutationen mit oder ohne Auswirkung auf die Proteinbildung (synonyme oder nichtsynonyme Veränderungen) handelt, ob Spleißmutationen vorliegen und welche Auswirkungen ein Aminosäurenaustausch auf die Proteinfunktion haben könnte. Aufgrund der Vielzahl von Varianten muss das Ergebnis der bioinformatischen Analyse immer im Zusammenhang mit der klinischen Symptomatik interpretiert werden.
Diese Verfahren haben die Herangehensweise an genetische Krankheiten grundlegend verändert. Sie ermöglichen jetzt Gendefekte auch in kleinen Familien oder Einzelfällen zu identifizieren. Hierzu sind grundsätzlich drei Zugänge möglich:
1.
Gen-Sequenzierung von mehreren Betroffenen mit gleichem Phänotyp und Suche nach einem gleichermaßen veränderten Gen,
 
2.
Gen-Sequenzierung von Familien mit rezessivem Vererbungsmodus und Suche nach einer gleichen Veränderung bei allen Betroffenen,
 
3.
Suche nach De-novo-Veränderungen durch den Vergleich von gesunden Eltern mit betroffenem Kind unter der Annahme, dass eine dominante Veränderung vorliegt.
 
Letzteres Verfahren ist besonders bei seltenen unbekannten Krankheiten aussichtsreich und wird in der klinischen Routine eingesetzt.

Ethische Aspekte

Die Untersuchung von DNA hat in vielfacher Hinsicht eine andere Wertigkeit als andere Laboruntersuchungen. Veränderungen in der DNA können weitervererbt werden bzw. bei anderen Familienmitgliedern vorhanden sein. Der besondere prädiktive Charakter von DNA-Veränderungen unterscheidet sie nicht unbedingt qualitativ, aber doch in ihrem Ausmaß von anderen Tests. Jeder Patient bzw. sein Vertreter sollten daher selbst entscheiden können, ob sie dieses Wissen haben wollen oder nicht. Dies ist durch eine schriftliche Einwilligung zu bestätigen. Die diagnostische Testung von Krankheitsgenen bei Betroffenen ist weniger problematisch. Bei der prädiktiven Testung, also der Testung von gesunden Personen, ist die Entscheidung möglicherweise von großer Tragweite und darf deshalb nur nach entsprechender Beratung erfolgen. In der Bundesrepublik Deutschland ist die Durchführung genetischer Untersuchungen beim Menschen sowie die Verwendung genetischer Proben und Daten durch das am 1. Februar 2010 (2012) in Kraft getretene Gendiagnostikgesetz geregelt.
Glossar
Alignieren: Bioinformatisches Verfahren zum Vergleich zweier oder mehrerer (DNA- oder Protein-) Sequenzen.
Komparative Genom-Hybridisierung (CGH): Verfahren, mit dem Gewinne und Verluste von genomischen Material erkannt werden können. Dies erfolgt im Allgemeinen über die kompetitive Hybridisierung von Patienten- und Kontroll-DNA auf eine Referenz-DNA. Über eine unterschiedliche farbliche Markierung der DNAs (rot und grün) kann das Verhältnis zueinander gemessen werden. Bei gleichen Anteilen ergibt sich eine gelbe Farbe und bei Abweichungen mehr grün bzw. rot.
Array-CGH: Verfahren der komparativen Genom-Hybridisierung, das über einen Chip funktioniert, auf dem geordnet repräsentative Teile des Genoms meistens als kleine DNA-Abschnitte (Oligos) abgebildet sind. Mit dieser Methode lassen sich sehr effektiv und sensitiv Variationen in der Kopienzahl feststellen.
Copy number variation (CNV): Variationen in der Kopienzahl. Neben Sequenzvarianten stellen Varianten in der Zahl der Kopien von DNA-Abschnitten einen wichtigen Teil von Varianten im Genom dar. CNVs können normale Varianten sein, oder pathologische Auswirkungen haben. Die Detektion erfolgt am besten über Array-CGH.
De-novo-Veränderung: Auftreten einer Neumutation, also einer Veränderung, die nicht bei den Eltern vorhanden ist.
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs): Varianten in der DNA-Sequenz, die als nichtpathogen gelten und somit zur interindividuellen Variation beitragen. Die Detektion erfolgt über Sequenzierung oder SNP-Arrays.
Mikrodeletionssyndrom: Syndrom, das durch eine Deletion im Genom verursacht wird, die im Allgemeinen mehrere Gene umfasst und zu klein ist, um mittels herkömmlicher Chromosomenuntersuchung detektiert zu werden. Zur Detektion werden z. B. FISH oder Array-CGH eingesetzt.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH): Technik für die Detektion und Lokalisation von spezifischen DNA-Sequenzen auf Chromosomen. Eine Sonde wird farblich markiert und auf die Chromosomen hybridisiert. Anhand der Anzahl und Lokalisation der Signale können z. B. Deletionen, Duplikationen oder Fusionen identifiziert werden.
Massiv-parallele (oder Next Generation) Sequenzierung (NGS): Eine Technologie, mit der Einzelmoleküle parallel in großer Zahl sequenziert werden können. Dies erlaubt die Analyse von großen DNA-Mengen zu geringen Kosten.
Single-Nucleotide-Polymorphism(SNP)-Array: Technologie, mit der bekannte Varianten in der Sequenz einer DNA-Probe bestimmt werden können. Das Ergebnis ermöglicht die Bestimmung von Genotyp bzw. die Kombination von Allelen, also ob die Allele AA, AB, oder BB vorliegen. Da SNP-Arrays-Information zum Genotyp bieten, können mit ihnen Kartierungen durchgeführt bzw. Regionen mit Homozygotie identifiziert werden. Das Verfahren kann auch zur Detektion von Deletionen und Duplikationen verwandt werden.
Gene panels: Zusammenstellung von Genen, die mit einem bestimmten Krankheitsbild vergesellschaftet sind; besonders bei Krankheiten, bei denen die phänotypische Zuordnung zu einzelnen Genen schwierig ist. Die Sequenzierung erfolgt über NGS.
Missense-Mutation: Veränderung der DNA-Sequenz im kodierenden Bereich, die zu einer (pathogenen) Veränderung in der Aminosäuresequenz führt.
Nonsense-Mutation: Veränderung der DNA-Sequenz, die zur Umwandlung eines Aminosäure-Codon in ein Stopp-Codon führt.
Strukturelle Varianten: Varianten im Genom, die sich auf die Kopienzahl auswirken, also Verringerung oder Vermehrung von bestimmten DNA-Abschnitten. Weitere strukturelle Varianten sind Inversionen und Translokationen. Strukturelle Varianten können Polymorphismen sein, oder pathogene Auswirkung haben.
Weiterführende Literatur
Aase JM (1990) Diagnostic dysmorphology. Plenum Medical Book Company, New York
Allanson JE, Cunniff C, Hoyme HE, McGaughran J, Muenke M, Neri G (2009) Elements of morphology: standard terminology for the head and face. Am J Med Genet A 149A:6–28CrossRef
Biesecker LG, Aase JM, Clericuzio C, Gurrieri F, Temple IK (2009) Elements of morphology: standard terminology for the hands and feet. Am J Med Genet A 149A:93–127CrossRef
Carey JC, Cohen MM Jr, Curry CJR, Devriendt K, Holmes LB (2009) Elements of morphology: standard terminology for the lips, mouth, and oral region. Am J Med Genet A 149A:77–92CrossRef
Cohen MM Jr (1997) The child with multiple birth defects, 2. Aufl. Oxford University Press, New York
Edelmann L, Hirschhorn K (2009) Clinical utility of array CGH for the detection ofchromosomal imbalances associated with mental retardation and multiple congenitalanomalies. Ann N Y Acad Sci 1151:157–166CrossRef
Gardner RJM, Sutherland GR, Shaffer LG (2012) Chromosome abnormalities and genetic counseling, 4. Aufl. Oxford University Press, New York
Gillessen K, Siebert R (2012) Stellenwert der Array-basierten molekularen Karyotypisierung in der Humangenetik. Medgen 24:84–85CrossRef
Hackmann K, Engels H, Schröck E (2012) Molekulare Karyotypisierung in der genetischen Diagnostik - Technologien und Anwendungen. Medgen 24:86–93CrossRef
Hanson JW, Smith DW (1975) U-shaped palatal defect in the Robin anomalad: developmental and clinical relevance. J Pediatr 83:30–33CrossRef
Hennekam RCM, Cormier-Daire V, Hall JG, Méhes K, Patton M, Stevenson RE (2009) Elements of morphology: standard terminology for the nose and philtrum. Am J Med Genet A 149A:61–76CrossRef
Horsthemke B (2010) Mechanisms of imprint dysregulation. Am J Med Genet C Semin Med Genet 154C:321–328CrossRef
Hunter A, Frias JL, Gillessen-Kaesbach G, Hughes H, Jones KL, Wilson L (2009) Elements of morphology: standard terminology for the ear. Am J Med Genet A 149A:40–60CrossRef
Knickmeyer RC (2012) Turner syndrome: advances in understanding altered cognition, brain structure and function. Curr Opin Neurol 25:144–149CrossRef
Kunze J (2010) Wiedemanns Atlas klinischer Syndrome: Phänomenologie-Ätiologie-Differenzialdiagnose, 6. Aufl. Schattauer Verlag, Stuttgart
Mundlos S (2009) The brachydactylies: a molecular disease family. Clin Genet 76(2):123–136CrossRef
Oneda B, Rauch A (2012) Molekulare Karyotypisierung in der Diagnostik neurokognitiver Entwicklungsstörungen. Medgen 24:94–98CrossRef
Opitz JM (1991) Entwicklungsstörungen des Menschen. Monatsschr Kinderheilk 139:259–272
Pinsker JE (2012) Clinical review: turner syndrome: updating the paradigm of clinical care. J Clin Endocrinol Metab 97:E994–E1003CrossRef
Reardon W (2008) The bedside dysmorphologist. Classic clinical signs in human malformation syndromes and their diagnostic significance. Oxford University Press, Inc, New York
Rimoin DL, Horton WA (1978) Short stature. Part I and Part II. J Pediatr 92:523–528. und 697–704CrossRef
Robinson PN, Krawitz P, Mundlos S (2011) Strategies for exome and genome sequencedata analysis in disease-gene discovery projects. Clin Genet 80(2):127–132CrossRef
Schinzel A (2001) Catalogue of unbalanced chromosome aberrations in man, 2. Aufl. de Gruyter, Berlin
Shaffer LG, McGowan-Jordan J, Schmid M (Hrsg) (2013) ISCN 2013 – an international system for human cytogenetic nomenclature. Karger, Basel
Slavotinek AM (2008) Novel microdeletion syndromes detected by chromosome microarrays. Hum Genet 124:1–17CrossRef
Speicher R, Carter NP (2005) The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat Rev Genet 6:782–792CrossRef
Spengler S, Begemann M, Brüchle NO et al (2012) Molecular karyotyping as a relevant diagnostic tool in children with growth retardation with Silver-Russell features. J Pediatr 161:933–942CrossRef
Sperling K, Neitzel H (2000) Chromosomopathien. In: Ganten D, Ruckpaul K (Hrsg) Handbuch der Molekularen Medizin. Bd. 7, Teil 2. Springer, Berlin
Spranger J (1989) Krankheit, Syndrom, Sequenz. Monatsschr Kinderheilk 137:2–7
Stankiewicz P, Beaudet AL (2007) Use of array CGH in the evaluation of dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardation. Curr Opin Genet Dev 17:182–192CrossRef
Strachan T, Read A (2005) Molekulare Humangenetik, 3. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
Tsuchiya KD (2011) Fluorescence in situ hybridization. Clin Lab Med 31(4):525–545CrossRef