Molekulare und genetische Zusammenhänge in der pädiatrischen Endokrinologie

Auf der Basis der Röntgenstrukturanalysen von Rosalind Franklin entwickelten James Watson und Francis Crick 1953 das Modell der DNA-Doppelhelix, wofür sie 1962 den Nobelpreis für Medizin erhielten.

Jeder Strang besteht aus einem Rückgrat eines Desoxyribosephosphatpolymers, an dem nach innen die Nukleotidbasen gerichtet sind. Die Nukleotidbasen sind die Purine Adenin (A) und Guanin (G) und die Pyrimidine Zytosin (C) und Thymin (T) bzw. Urazil (U) für die RNA. Die zwei Stränge der Doppelhelix sind komplementär durch zwei Wasserstoffbrücken zwischen Adenin und Thymin sowie drei Wasserstoffbrücken zwischen Guanin und Zytosin miteinander verbunden. Die Komplementärstruktur der DNA erlaubt eine basengenaue Replikation und bietet gleichzeitig einen Schutz vor Beschädigungen der DNA. So kann der Verlust einer Base auf einem Strang durch den intakten Komplementärstrang ausgeglichen werden. Die Präsenz von nur vier Nukleotidbasen sichert eine erstaunliche genetische Vielfalt. In den proteinkodierenden Regionen, den Genen, werden die Nukleotide in Tripletts (Kodons) abgelesen, die jeweils eine der 20 proteinogenen Aminosäuren kodieren. Aus vier Nukleotidbasen können somit 4³ = 64 unterschiedliche Kodons gebildet werden. Viele Aminosäuren, aber auch das Translationsende werden durch verschiedene Tripletts kodiert, während es nur ein Startkodon (AUG) gibt. Da die Anzahl der Kodons die Anzahl der Aminosäuren übersteigt, bezeichnet man den genetischen Code als degeneriert. (Tab. 2 und 3).

Das menschliche haploide Genom besteht aus ca. 3 Mrd. Basenpaaren (bp), die beim Menschen in 23 Chromosomen angeordnet sind. Das kleinste Chromosom (21) besteht aus ca. 50 Mio. bp, das größte Chromosom (1) aus ca. 250 Mio. bp.

Mit dieser überraschenden, durch das internationale „Human Genome Project“ gewonnenen Erkenntnis war die Einsicht in die grundlegende Bedeutung alternativen Spleißens für die Proteinvielfalt verbunden.

Jede diploide menschliche Zelle enthält 46 Chromosomen, die aus 22 Autosomenpaaren (Chromosomen 1–22) und einem Paar Geschlechtschromosomen (Chromosomen X und Y) bestehen. Weibliche Individuen haben zwei X-Chromosomen (Karyotyp 46,XX), während männliche Individuen ein X- und ein Y-Chromosom tragen (Karyotyp 46,XY). Durch den Prozess der Meiose entstehen die Keimzellen mit jeweils einem haploiden Satz Chromosomen (Oozyt 23,X; Spermium 23,Y oder 23,X). Während der Fertilisation vereinigen sich die homologen Chromosomen wieder zum diploiden Chromosomensatz. Bei der normalen Teilung somatischer Zellen (Mitose) hingegen werden die Chromosomen repliziert, neu gepaart und auf zwei Tochterzellen aufgeteilt. Meiose findet nur in den primären Keimzellen der Gonaden in zwei Phasen statt, an deren Ende die haploiden Keimzellen stehen.

Der Austausch homologer väterlicher und mütterlicher Chromosomenabschnitte (Rekombination) ist für die genetische Vielfalt essenziell. Jedes Chromosomenpaar teilt sich in zwei Schwesterchromatiden. Dabei erfolgt ein Austausch („crossing over“) von DNA-Abschnitten zwischen homologen Chromosomen. Anschließend werden die väterlichen bzw. mütterlichen Chromosomen nach dem Zufallsprinzip an vier Gameten mit einem haploiden Chromosomensatz weitergegeben. Durch dieses Zufallsprinzip und die Rekombinationen entsteht eine so große genetische Vielfalt, dass jeder Gamet als genetisch einzigartig betrachtet werden kann. Die Prozesse sind die Grundlage für Kopplungsanalysen („linkage“), bei denen man die Vererbung gekoppelter (nichtrekombinierter) Gene oder genetischer Marker und die Segregation einer Krankheit untersuchen kann.

Ein Gen besteht aus regulatorischen Regionen (Promotor), gefolgt von Exons, Introns und untranslatierten Regionen. In Ableserichtung wird die vordere Region als das 5’-Ende („stromauf“) und die hintere Region als das 3’-Ende („stromab“) bezeichnet. Die Genexpression regulierenden Regionen liegen meist stromauf (5’) der Transkriptionsinitiationsstelle. Exons stellen Regionen dar, die zur reifen mRNA gespleißt werden. Introns liegen zwischen den Exons und werden im Rahmen des Spleißprozesses aus der Vorläufer(„Precursor“)-RNA herausgeschnitten. Durch die Nutzung alternativer Promotoren und/oder unterschiedlicher Spleißstellen können von einem Gen verschiedene Transkripte abgelesen werden, deren Produkte Isoproteine genannt werden, die unterschiedlich aufgebaut sind (Abb. 1).

Die Promotorregion enthält spezifische Sequenzen, sog. „Responsive Elements“, die Transkriptionsfaktoren binden können. Während die Sequenzmotive ubiquitär verteilt sind, kommen die Transkriptionsfaktoren zellspezifisch vor. Als Enhancer bezeichnet man eine Gruppe kurzer Sequenzelemente, die spezifisch die Transkription eukaryotischer Gene verstärken können. Im Gegensatz zu den Promotoren, deren Abstand zu den Transkriptionsstartstellen relativ konstant ist, befinden sich Enhancer oft weit vom Gen entfernt. Silencer sind entsprechende Regulationselemente, die die Transkriptionsaktivität bestimmter Gene unterdrücken. Transkriptionsfaktoren, die an den Promotor oder Enhancer binden, interagieren mit anderen nukleären Proteinen, sog. Koaktivatoren oder Korepressoren und bilden somit größere regulierende Komplexe, die die Transkription entweder aktivieren oder hemmen. Man bezeichnet die Transkriptionsfaktoren als trans-aktiv, da sie von weit entfernt gelegenen Genen synthetisiert werden und erst zu den Stellen, an denen sie aktiv werden, wandern müssen. Dagegen werden Promotorelemente als cis-aktiv bezeichnet, da ihre Funktion auf den Abschnitt der Doppelhelix beschränkt ist, auf der sie sich befinden.

In eukaryotischen Zellen ist die DNA durch Histone in sog. Nukleosomen verpackt. Dadurch werden die Bindung der Transkriptionsfaktoren an die Responsive Elements und damit konsekutiv die Transkription gehemmt. Die Gentranskription wird durch eine Veränderung der Chromatinstruktur mit Deacetylierung (Gensuppression) oder Acetylierung (Genaktivierung) der Histone modifiziert. Mit der Bindung der Transkriptionsfaktoren an die DNA werden weitere Proteine einschließlich der DNA-abhängigen RNA-Polymerase rekrutiert, die den Transkriptionskomplex bilden (Abb. 2). Den ersten Schritt, die RNA-Synthese mithilfe einer RNA-Polymerase, bezeichnet man als Transkription. Dieser findet im Zellkern statt. Der zweite Schritt, die Polypeptidsynthese oder Translation, erfolgt extranukleär in Ribosomen, großen RNA-Proteinkomplexen, die frei im Zytoplasma oder gebunden an das endoplasmatische Retikulum vorliegen. Die RNA-Moleküle, die die Zusammensetzung der Polypeptide festlegen, werden als mRNA („messenger“ RNA, auch Boten-RNA) bezeichnet. Die Transkriptions-Stop-Signale liegen in der 3’-Region der Gene. Ein Polyadenylierungssignal kodiert den Poly-A-Schwanz, der den mRNA-Transport ins Zytoplasma, die RNA-Stabilität und die Translationseffizienz beeinflusst (Abb. 1).

Da einige der Transkriptionsfaktoren gewebespezifisch exprimiert werden, verursachen sie nicht selten einen syndromalen Phänotyp. Wenn nur die mütterliche (oder väterliche) Genkopie eines Gens durch eine Mutation ausgeschaltet ist und die zweite väterliche (oder mütterliche) gesunde oder Wildtypkopie eine ausreichende Proteinsynthese und -funktion allein nicht gewährleisten kann, liegt eine sog. Haploinsuffizienz vor. Sind beide Allele mutiert, resultiert dies oft in einem schwereren Phänotyp. So resultieren heterozygote Mutationen im THOX2-Gen in einer transienten Hypothyreose mit verminderter H₂O₂-Bildung, während biallelische Mutationen in diesem Gen eine permanente Hypothyreose verursachen.

Die Genexpression wird auch durch epigenetische Faktoren und Prozesse beeinflusst. Hier sind vor allem die X-Inaktivierung und das genomische Imprinting (Prägung), d. h. die durch unterschiedliche DNA-Methylierung beeinflusste monoallelische Expression in Abhängigkeit von der elterlichen Herkunft des Allels, zu nennen. Eine DNA-Methylierung geht in der Regel mit einer Suppression der Genexpression einher. Genomisches Imprinting spielt bei verschiedenen genetischen Erkrankungen wie z. B. bei der hereditären Albright-Osteodystrophie und beim Prader-Willi-Syndrom eine entscheidende pathogenetische Rolle. So werden die für das Prader-Willi-Syndrom verantwortlichen Gene nur auf dem väterlichen Chromosom exprimiert; auf dem mütterlichen Chromosom sind sie durch Imprinting inaktiviert. Kommt es zu einer Deletion der Region 15q11–q13 des väterlichen Allels oder stammen beide Chromosomen von der Mutter (uniparentale Disomie), stehen dem betroffenen Patienten nur die durch Imprinting von der Expression ausgeschlossenen inaktivierten Gene des mütterlichen Allels zur Verfügung.

Mit der FISH-Technologie können kleinere chromosomale Aberrationen wie Deletionen oder Translokationen von einer Größe zwischen 20 kb und 1 Mb detektiert werden.

Die Hybridisierung von Nukeinsäuresträngen beruht darauf, dass zwei komplementäre Stränge von Nukleinsäuren eine Doppelhelix bilden. Es können sich so DNA-DNA-, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Doppelhelices bilden. Die Hybridisierungssonde stellt den komplementären Strang dar und kann eine natürlich vorkommende, geklonte oder eine synthetisierte Sequenz sein. Die Sonden sollen aus mindestens 16 Nukleotiden bestehen, da diese Sequenz statistisch gesehen mit hoher Wahrscheinlichkeit nur einmal im Genom vorkommen kann. Eine Sonde mit ≥16 Nukleotiden kann sich nur an eine spezifisch komplementäre, also „passende“ Sequenz im Genom anlagern. Kurze Sonden werden nur mit exakt übereinstimmenden Sequenzen hybridisieren, während längere Sonden auch trotz einiger Fehlpaarungen („Mismatches“) hybridisieren können. Dies ist dann von Bedeutung, wenn man in einer größeren Probandenzahl eine bestimmte Sequenz untersuchen will, die naturgemäß einige individuelle Polymorphismen aufweist. Diese Technik wird für die Erkennung von DNA und RNA mittels Southern und Northern Blots angewandt und war Grundlage für die Entwicklung der Microarray-DNA-Chips.

Sowohl Southern Blots als auch Northern Blots werden heutzutage nur noch selten angewandt. Die Northern Blots sind in den letzten Jahren zum großen Teil durch sensitivere Methoden wie die Reverse-Transkriptase(RT)-PCR (Abschn. 5.3) oder Genexpressions-Microarrays ersetzt worden.

Microarrays bestehen aus tausenden von Hybridisierungssonden, die auf Miniglasplatten punktförmig aufgebracht sind. Diese Sonden können DNA-Oligonukleotide oder cDNA-Sonden aus einer sog. EST(„expressed sequence tag“)-Bibliothek sein. Mit dieser Methode kann man die differenzielle Genexpression und damit die Genregulation erfassen (Abb. 3).

Die Einführung einer zellfreien Methode zur Vervielfältigung von DNA-Fragmenten hat die molekularbiologische Analyse von DNA ebenso nachhaltig beeinflusst wie die Entwicklung der Methoden zur DNA-Sequenzanalyse. Für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden benötigt:

Die beiden Primer müssen komplementär zu den beiden 3’-Enden der zu amplifizierenden DNA sein. Die DNA wird durch eine gereinigte thermostabile DNA-Polymerase z. B. aus dem Bakterium Thermus aquaticus (Taq) synthetisiert. Eine PCR besteht aus drei sich 25- bis 35-mal wiederholenden Zyklen von DNA-Synthesen, der Denaturierung der DNA bei 92–95 °C, der Anheftung der Primer bei 50–65 °C und der DNA-Polymerase-gesteuerten DNA-Synthese bei 68–72 °C (Abb. 4). Die wiederholten Zyklen führen zu einer exponentiellen Amplifikation des ursprünglichen DNA-Fragmentes. Das sog. Amplikon kann anschließend z. B. für eine Sequenzierung weiterverwendet werden. Die PCR kann auch zur RNA-Analyse genutzt werden. In diesem Fall wird zunächst eine reverse Transkription eingesetzt, um die RNA in den komplementären DNA-Strang (cDNA, „complementary“ DNA) umzuschreiben, die dann mittels PCR amplifiziert wird (RT-PCR). Die RT-PCR wird häufig für eine quantitative Analyse der Genexpression genutzt.

Zur Detektion von DNA-Dosisunterschieden wurde die MLPA-Analyse entwickelt, die gleichzeitig bis zu 50 verschiedene Nukleinsäurefragmente in einem Ansatz nachweisen kann. Das Prinzip der MLPA beruht auf einer Amplifikation von DNA-Abschnitten nach Hybridisierung und Ligation der MLPA-Proben mit anschließender Größentrennung der Amplifikationsprodukte durch Kapillarelektrophorese. Die Menge der sequenzspezifisch hybridisierten und ligierten Oligonukleotide ist dabei proportional zur Kopienzahl der Zielsequenz. Dosisunterschiede sind durch Reduktion oder Vergrößerung der Peakhöhen und -flächen erkennbar. Mittlerweile sind mehr als 300 verschiedene MLPA-Kits zur Detektion von Deletionen/Duplikationen einzelner Exons von Genen, Genbereichen, ganzen Genen, Chromosomenbereichen und ganzen Chromosomen kommerziell verfügbar.

Die DNA-Klonierung war bis zur Einführung der PCR die einzige Methode, um spezifische Sequenzen zu vervielfältigen. Auch heute noch ist die Klonierung von DNA-Fragmenten Grundlage für die Expression rekombinanter Proteine und die funktionelle Charakterisierung mutierter Genprodukte. Bei der Klonierung von DNA wird ein DNA-Fragment („Insert“) in einen Klonierungsvektor eingesetzt. Das korrekte Einsetzen des Fragmentes hängt entscheidend von der Herstellung komplementärer Enden an Vektor und Insert ab, die durch den Einsatz spezifischer Restriktionsenzyme entstehen. Restriktionsenzyme schneiden die DNA an hochspezifischen Sequenzen, die gewöhnlich 4–6 bp lang sind.

Die Klonierung eines DNA-Fragmentes in ein Bakterienplasmid gehört zu den am häufigsten verwendeten Klonierungsmethoden (Abb. 5).

Mittlerweile ermöglichen zahlreiche Vektoren (Fremd-DNA-tragende Plasmide) und Empfänger(„host“)-Zellen einen breiten Einsatz dieser Methode, so z. B. für die Herstellung genomischer oder cDNA-Bibliotheken („libraries“), einer großen Sammlung von DNA-Klonen.

Die Standardmethode der Sequenzierung von DNA-Fragmenten beruhen auf der Kettenabbruchmethode nach Sanger, bei der Didesoxynukleotide der vier bekannten Basen (A, G, T, C) genutzt werden, um die DNA-Polymerisierung nach dem Zufallsprinzip zu stoppen. Nach der Auftrennung der so entstandenen verschieden terminierten und damit unterschiedlich langen DNA-Fragmente mittels einer Gel- oder Kapillarelektrophorese kann indirekt auf die Sequenz rückgeschlossen werden.

In den vergangenen Jahren sind enorme Weiterentwicklungen bei den Sequenziertechnologien vollzogen worden. Verschiedene Firmen haben hochparallele Sequenzierverfahren entwickelt und optimiert (Pyrosequenzierung: Roche 454 Life Sciences, 2005; Sequenzierung durch Synthese: Illumina, 2006; Sequenzierung durch Ligation: Applied Biosystems SOLiD-Technologie, 2008; pH-vermittelnde Sequenzierung: Ion Torrent Inc., 2010) und damit das Potenzial, neue krankheitsverursachende Mutationen zu identifizieren, um ein Vielfaches gesteigert. Dieses sog. „Next Generation Sequencing“ (NGS) bietet eine extrem hohe Sequenzierkapazität mit einer höheren diagnostischen Sensitivität durch die parallele Sequenzierung krankheitsrelevanter Gen-Sets (Gen-Panels: „Targeted Exon Sequencing“, TES) bzw. des gesamten Exoms (Exomsequenzierung: „Whole Exome Sequencing“, WES) oder des vollständigen Genoms (Genomsequenzierung: „Whole Genome Sequencing“, WGS). Neben einer Vielzahl von Vorteilen (höherer Durchsatz und Maßstab; parallele Sequenzierung vieler Gene, des Exoms oder Genoms mehrerer Patientenproben gemeinsam in einem Lauf; Verringerung von Zeit und Kosten) ist der Einsatz der NGS-Technologie in der klinischen Diagnostik mit Herausforderungen verbunden. Ein großes Problem stellt die Aufdeckung genetischer Risiken, die nichts mit der eigentlichen diagnostischen Fragestellung zu tun haben, dar. Daher muss vor Beginn der Untersuchung geklärt werden, wie mit solchen unerwarteten Befunden umgegangen werden soll. Weiterhin ist bei Genomsequenzierungen mit sehr umfangreichen Datensätzen zu rechnen, deren Sicherheit gewährleistet sein muss.

Zum indirekten Nachweis der Expression eines bestimmten Gens durch Untersuchung des kodierten Proteins wird häufig der Western Blot verwendet. Bei dieser Methode werden Proteine aus Zellextrakten nach ihrer Größe fraktioniert. Normalerweise geschieht das in einem eindimensionalen Polyacrylamidgel. Nach Übertragung der aufgetrennten Proteine auf eine Membran (z. B. Nitrozellulose oder Nylon) können diese mit spezifischen Antikörpern untersucht werden (Abb. 6). Bei der 2D-Elektrophorese werden die Proteine in der ersten Dimension nach ihrer Ladung in einem pH-Gradienten aufgetrennt (isoelektrische Fokussierung), während die zweite Dimension im rechten Winkel zur ersten Dimension verläuft und die Proteine nach ihrer Größe fraktioniert werden. Der meist computergestützte differenzielle Vergleich von Proteinmustern aus Geweben kranker und gesunder Probanden kann zur Identifikation durch die Krankheit veränderter Proteine führen. Die Bestimmung der Identität eines Proteinspots erfolgt mithilfe der Massenspektrometrie.

Die Methode der In-situ-Hybridisierung dient dem direkten Nachweis der Expression eines Gens im zu untersuchenden Gewebe, wie z. B. Mäuseembryoschnitte. Dabei hybridisiert eine künstlich hergestellte DNA-Sonde an die nachzuweisende mRNA. Zur Untersuchung des gesamten Transkriptoms einer Zelle, z. B. zur Erstellung von Expressionsprofilen wird die RNA-Sequenzierung mittels NGS, das sog. RNA-Seq, angewendet. Mit dieser Methode ist es möglich, molekulare Zusammenhänge bei der Krankheitsentstehung zu erkennen wie z. B. die Einflussnahme pathogener Mutationen in Transkriptionsfaktoren auf deren Aktivität oder das Entstehen von Fusionstranskripten als Resultat von Translokationen. Mit der Methode der Immunzytochemie kann mit Antikörpern als „Sonde“ das Synthesemuster eines Proteins und damit indirekt das Expressionsmuster eines Gens innerhalb eines Gewebes oder eines Zellverbandes untersucht werden. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die subzelluläre Lokalisation eines Genproduktes. Die Gewebe werden mit Antikörpern inkubiert, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Alexa-Farbstoffe, Rhodamin, Cy3 oder Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) gekoppelt sind. Diese lassen sich durch Licht geeigneter Wellenlänge anregen und emittieren Licht einer spezifischen längeren Wellenlänge, das im Fluoreszenzmikroskop beobachtet und als Bild gespeichert werden kann (Abb. 7).

Mithilfe der Elektronenmikroskopie ist eine noch höhere Auflösung der intrazellulären Lokalisierung eines Genproduktes möglich. Dabei wird der Antikörper meist mit einem elektronendichten Partikel wie z. B. kolloidalem Gold markiert.

Tiermodelle entstehen entweder durch natürlich vorkommende Mutationen bzw. chemische Induktion (z. B. mit 1-Ethyl-1-Nitrosoharnstoff, ENU) und werden über den Phänotyp gefunden oder werden durch verschiedene Eingriffe des Molekularbiologen am Wildtyp künstlich entwickelt. „Gene Targeting“, d. h. das Einbringen einer Mutation in ein endogenes Gen embryonaler Stammzellen, und andere Verfahren zur Einbringung von Transgenen in einen Organismus stehen zur Entwicklung von Tiermodellen zur Verfügung. Mit der Anwendung der CRISPR/Cas9-Technologie, einer neuen molekularbiologischen Methode, können einzelne Gene von Organismen gezielt verändert werden. Diese Technologie stammt aus dem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem CRISPR(„clustered regularly interspaced short palindromic repeats“)/Cas9(CRISPR-associated protein 9)-System. Durch die Rekrutierung des Cas9-Enzyms an einen genomischen Locus, komplementär zur Sequenz einer ausgewählten spezifischen Führungs-RNA, wird ein doppelsträngiger DNA-Bruch erzeugt, welcher durch zelleigene Reparatursysteme wieder geschlossen wird. Dabei dient ein zugefügtes DNA-Oligo als Vorlage für die Reparatur. Wenn in dieses Oligo eine Veränderung eingebracht wurde, kann diese vom Reparatursystem übernommen werden. Damit können Punktmutationen, Insertionen und Deletionen erzeugt werden, die wiederum zu einer permanenten Störung der Expression des Zielgens führen können.

DNA-Sequenzvarianten sind sowohl Grundlage der genetischen Variabilität als auch Ursache von Krankheiten. Da es Unsicherheiten in der Terminologie von Mutation (einfache Sequenzvariante oder krankmachende Veränderung?) und Polymorphismus (Sequenzvariante, die mit einer Häufigkeit von >1 % in der Population vorkommt oder nichtkrankmachende Veränderung) gibt, wurden Begriffe wie Sequenzvariante, allelische Variante oder Alteration vorgeschlagen. Die breit geführte Diskussion darüber hat durchaus ihre Berechtigung, da der Begriff Mutation in der Bevölkerung zunehmend eine negative Bedeutung erfahren hat.

Mutationen können eines oder wenige Nukleotide oder auch größere Abschnitte einzelner Gene oder Chromosomen betreffen, die zu strukturellen oder numerischen Veränderungen führen. Dabei können Sequenzvarianten in allen Bereichen eines Gens (Exons, Introns, regulatorische Bereiche) auftreten oder das gesamte Gen betreffen (Gendeletion oder -duplikation). Sind mehrere Gene eines Chromosomenabschnitts deletiert, spricht man von einem Contiguous-gene-Defekt wie z. B. bei einer Deletion der auf Chromosom Xp21.2 benachbart liegenden Gene NR0B1 (DAX1), GK und DMD. Patienten mit dieser die drei Gene umfassenden Deletion leiden unter einer angeborenen Nebenniereninsuffizienz (DAX1), einer Hyperglycerolämie (GK) und einer Muskeldystrophie Duchenne (DMD). Eine fehlerhafte Paarung homologer Sequenzen führt zu einem ungleichen Cross-over oder zu Genkonversionen, die oft zu Genduplikationen auf dem einen Chromosom und entsprechender Gendeletion auf dem anderen Chromosom oder einem nichtreziproken Austausch homologer DNA-Abschnitte führen. Das Vorhandensein funktionell inaktiver Pseudogene, die eine starke Homologie zum benachbarten aktiven Gen aufweisen, erhöht die Wahrscheinlichkeit solcher Rekombinationen mit konsekutiven Duplikationen, Deletionen oder allelischen Varianten des aktiven Gens. So werden beim 21-Hydroxylase-Mangel häufig Anteile und damit Mutationen des inaktiven Pseudogens CYP21A1P in das aktive Gen CYP21A2 rekombiniert, die zur Ausprägung eines adrenogenitalen Syndroms führen (Kap. „Primäre Nebenniereninsuffizienz bei Kindern und Jugendlichen“).

Trinukleotidwiederholungen („Repeats“) sind ebenso gefährdete Regionen für ungleiche Rekombinationen und eine verschobene Fehlpaarung der DNA-Stränge.

Diese kann z. B. bei der myotonen Dystrophie (DM1, MIM #160900) oder beim fragilen X-Syndrom (MIM #300624) beobachtet werden. Auch eine Verkürzung von Trinukleotidwiederholungen kann funktionell von Bedeutung sein. Während z. B. ein verlängertes CAG-Repeat im Exon 1 des Androgenrezeptorgens (AR) die spinale und bulbäre Muskelatrophie mit mangelnder Virilisierung (Kennedy-Krankheit, MIM #313200) verursacht, geht eine Verkürzung eines Polyglycinrepeats in der Transaktivierungsdomäne des AR-Gens mit einer verminderten Aktivität des Androgenrezeptors einher und kann so die phänotypische Ausprägung einer Androgenresistenz (MIM #300068) beeinflussen.

Durch die Degeneration des genetischen Codes (Abschn. 4.1) führen nicht alle Mutationen zu einem Aminosäureaustausch (stumme Mutationen, z. B. CAC>CAT → Histidin>Histidin). Eine Punktmutation in der kodierenden Genregion, die in einem Aminosäureaustausch resultiert, nennt man Missense-Mutation (z. B. AGC>ATC → Serin>Isoleuzin). Führt hingegen eine Punktmutation zur Umwandlung eines Aminosäurekodons in ein Stopkodon, so liegt eine Nonsense-Mutation vor (z. B. TGT>TGA → Zystein>Stop). Eine solche Mutation führt zum Abbruch der Translation und damit zur Verkürzung des durch das Gen kodierten Proteins. Alternativ wird die fehlerhafte mRNA bereits durch „Nonsense-mediated mRNA decay“ abgebaut und somit gar kein Protein gebildet.

Kleine Deletionen oder Insertionen, die nicht ein Vielfaches eines Nukleotidtriplets darstellen, führen zu einer Verschiebung des Leserahmens (Out-of-frame- oder Frameshift-Mutation) und damit zu einer nachfolgenden falschen Proteinsequenz, die meist durch ein vorzeitiges Stopkodon beendet wird. Wird dagegen ein Vielfaches eines Kodons deletiert oder eingefügt, so resultiert eine In-frame-Mutation ohne Verschiebung des Leserasters, was in vielen Fällen mit einem milderen Phänotyp einhergeht (Abb. 8).

Mutationen in Introns oder an den hoch konservierten Exon-Intron-Übergängen können entweder eine vorhandene Spleißstelle löschen oder eine zusätzliche Spleißstelle schaffen (Spleißmutation), sodass durch fehlerhaftes Spleißen der mRNA entweder Exons ausgeschnitten oder Introns bzw. Intronteile belassen werden. Auch bei diesen Mutationen kann der Leserahmen entweder erhalten oder zerstört werden.

So kommt beim McCune-Albright-Syndrom (MIM #174800) die aktivierende Mutation des Kodons Arginin²⁰¹ des GNAS1-Gens nur in bestimmten Geweben vor (z. B. Ovarien, Haut, Knochen), was zu der typischen klinischen Trias Pseudopubertas praecox, landkartenartige Café-au-lait-Flecken der Haut und fibröse Knochendysplasie führt. Betrifft ein Mosaik auch die Keimzellen (Oozyten oder Spermien), so wird eine Mutation unter Umständen nicht an alle Nachfahren weitergegeben, was zu Schwierigkeiten bei der Feststellung des Vererbungsmodus führen kann.

Epigenetische Einflüsse führen nicht zu Sequenzvarianten, können jedoch z. B. über eine veränderte Methylierung der DNA die Genexpression modifizieren oder zu DNA-Schäden beitragen.

Dazu gehören die oben genannten stummen Mutationen und Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP, engl. „single nucleotide polymorphisms“), die im Genom ungleichmäßig stark verteilt vorkommen können. Obgleich Polymorphismen meist nicht zu einer Erkrankung führen, können stumme Mutationen im Ausnahmefall die mRNA-Stabilität oder die Translation modifizieren. Einige SNP oder bestimmte SNP-Kombinationen spielen bei komplexen Krankheiten eine pathogenetische Rolle, indem sie die Anfälligkeit des Organismus für die Ausprägung einer Krankheit beeinflussen.

Findet man bei einer Sequenzierung eines Kandidatengens für eine Krankheit eine noch unbekannte Sequenzvariante (Punktmutation), so ist die Unterscheidung zwischen krankheitsverursachender Mutation und Polymorphismus von besonderer Bedeutung. Als ersten Schritt sollte man aus den Datenbanken die genomische oder cDNA-Referenzsequenz heraussuchen (Tab. 1). Dafür kann z. B. die BLAST-Funktion („Basic Local Alignment Search Tool“) des NCBI-Servers (National Center for Biotechnology Information) genutzt werden, um die genaue Lokalisation der Mutation zu bestimmen. Mithilfe von SNP-Datenbanken kann man die neue Mutation mit bereits bekannten Polymorphismen abgleichen. Hilfreich ist auch die Verwendung des Online-Programms MutationTaster (Tab. 1), mit dem eine Vorhersage einer krankheitsverursachenden Mutation oder eines Polymorphismus schnell getroffen werden kann. Für den Nachweis der Pathogenität einer Mutation kommen verschiedene Methoden in Betracht. So sollte man (z. B. durch Sequenzierung der entsprechenden Genregion bei allen relevanten Familienmitgliedern) zunächst zeigen, dass in einer Familie die Mutation mit der Erkrankung kosegregiert. Des Weiteren muss nachgewiesen werden, dass die Mutation bei mindestens 60 Kontrollpersonen (= 120 Allele) nicht vorkommt. Schließlich kommen funktionelle Untersuchungen in Betracht, für die die Mutation kloniert und das mutierte Protein im Vergleich zum Wildtyp-Protein in vitro exprimiert werden muss. Die Genprodukte können dann mit verschiedenen Methoden (z. B. Bindungsstudien, Immunzytochemie, Enzymassays, Reportergenassays) funktionell charakterisiert werden. Die Untersuchung der Pathogenität von Mutationen in Tiermodellen runden die funktionellen Analysen ab.

Eine einheitliche, einfache und eineindeutige Bezeichnung einzelner Sequenzvarianten ist in der Molekulargenetik, Biologie und Medizin essenziell.

Genetiker aus den Niederlanden und den USA haben eine einheitliche, international verbindliche Nomenklatur für die „Human Genome Variation Society“ (HGVS) entwickelt (Ogino et al. 2007; den Dunnen et al. 2016). Im Folgenden werden die Grundlagen dieser Nomenklatur vorgestellt.

Zunächst soll das offizielle Gensymbol des „HUGO Gene Nomenclature Committees“ (HGNC) benutzt werden (HGNC 2017; HUGO 2017). Alle Gene und DNA-Marker werden prinzipiell kursiv und die entsprechenden Proteine nicht kursiv geschrieben (z. B. MC2R = Melanokortin-2-Rezeptorgen, MC2R = Melanokortin-2-Rezeptorprotein).

Die „coding“ cDNA ist eine synthetisch hergestellte DNA, die komplementär der mRNA und damit dem kodierenden Teil genomischer DNA entspricht. Die allgemein gültige Nummerierung basiert auf der cDNA-Referenzsequenz und der sich daraus ableitenden Aminosäuresequenz des Proteins. Die cDNA-Referenzsequenz ist die cDNA-Sequenz, die die volle Länge der kodierenden Region und die nichtkodierenden und damit nicht translatierbaren Abschnitte (5’-untranslated region [UTR] und 3’-UTR) enthält. Bei Spleißvarianten können eine oder mehrere Exons fehlen. Die Nummerierung der Nukleotide richtet sich nach dem Initiationskodon, wobei das A des Startkodons ATG das Nukleotid Nummer 1 darstellt. Nukleotide, die sich 5’ vom Initiationskodon befinden, werden mit einem „-“ gekennzeichnet (z. B. c.-3), während Nukleotiden 3’ des Stopkodons (3’-UTR inklusive der Poly-A-Region) ein „*“ vorangesetzt wird (z. B. c.*3). Das Startkodon ATG kodiert ein Methionin, das die Nummer 1 der Aminosäuresequenz des Proteins darstellt (Abb. 9). In Abhängigkeit von der verwendeten Referenzsequenz werd en den Mutationen unterschiedliche Präfixe vorangestellt: „c.“ für eine „coding“ DNA-Sequenz, „g.“ für eine genomische, „m.“ für eine mitochondriale, „r.“ für eine RNA- und „p.“ für eine Proteinsequenz.

Ein einfacher Austausch eines Nukleotids wird durch ein „>“ kenntlich gemacht, dabei steht die Nummer des Nukleotids vor der Angabe des Basenaustausches (z. B. c.28G>A). Bei der Angabe des Aminosäureaustausches steht die Nummer der Aminosäure zwischen den ausgetauschten Aminosäuren im Ein-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Code (z. B. p.G10S oder p.Gly10Ser). Dabei wird der Drei-Buchstaben-Code bevorzugt, um Verwechslungen zu vermeiden. Entsteht durch eine Punktmutation aus einem Aminosäurekodon ein Stopkodon, so wird dies durch ein * verdeutlicht (z. B. p.Arg8*; Abb. 10). Es wird empfohlen, den Datenbankeintrag der verwendeten Referenzsequenz wie folgt mit anzugeben (z. B. NM_000492.3: c.350G>A, entspricht p.Arg117His).

Andere Sequenzvarianten werden wie folgt gekennzeichnet: Deletionen (z. B. c.250delA oder – anderes Beispiel – c.250_254delATTCG), Duplikationen (z. B. c.250dupA oder – anderes Beispiel – c.250_254dupATTCG), Insertionen (hier z. B. zwischen den Nukleotiden 250 und 251 des Wildtyps c.250_251insT oder – anderes Beispiel – c.250_251insGCGTGA). Die SNP sollten immer die Angabe des verwendeten Datenbankeintrages beinhalten (z. B. AC043217.2: g.78654C>G). In der SNP-Datenbank des National Centers for Biotechnology Information (NCBI 2017) findet man den Namen des SNP (z. B. rs2306220:A>G) und dessen Lokalisation in verschiedenen Referenzsequenzen. Bei gemischt heterozygoten („compound heterozygous“) Mutationen werden die beiden Mutationen in eckige Klammern gesetzt und durch ein „+“ verbunden (z. B. c.[250A>G]+[1598insC]). Treten zwei Mutationen auf einem Allel auf, so werden diese in einer eckigen Klammer hintereinander, getrennt durch ein Semikolon angegeben, z. B. c.[250A>G; 457delA]. Frameshift-Mutationen werden auf Proteinebene beschrieben, wobei meist die Kurzform (z. B. p.Ser56fs) ausreichend ist. Möchte man die Frameshift-Mutation detailliert beschreiben (z. B. p.Ser56ArgfsX21), so versteckt sich in dieser Formel die erste veränderte Aminosäure, deren Position im Protein, gefolgt von der ersten veränderten Aminosäure mit dem Kürzel fs (für „frameshift“) und die Länge der durch die Leserahmenverschiebung entstandenen Nonsense-Aminosäuresequenz bis zum Stopkodon *, wobei die erste veränderte Aminosäure und das Stopkodon mitgezählt werden.

Intronmutationen sollten auf der Basis einer genomischen Referenzsequenz, die eine durchgängige genomische DNA-Sequenz mit Introns darstellt, und parallel dazu auch auf der Basis einer cDNA-Sequenz angegeben werden (z. B. AJ574942.1: g.2410G>T und NM_000492.3: c.489-1G>T). Dabei gibt die Änderung der cDNA-Referenzsequenz die Relation der Intronmutation zum benachbarten Exon wieder. Das G in dem gewählten Beispiel ist ein nichtkodierendes Nukleotid eines Introns und liegt eine Position vor dem kodierenden Nukleotid 489. Diese Information ist oft von klinischer Bedeutung, da sie Rückschlüsse auf den pathogenetischen Effekt der Sequenzvariante zulässt.

Häufig findet man eine Haploinsuffizienz bei Mutationen in Transkriptionsfaktoren, wie z. B. bei heterozygoten Mutationen im PAX8-Gen, die zu einer kongenitalen Hypothyreose führen. Monoallelische Mutationen können aber auch durch einen dominant-negativen Effekt einen Funktionsverlust des Genproduktes verursachen. In diesem Fall interferiert das mutierte Protein mit dem normalen Genprodukt

Eine Veränderung der Gendosis kann ebenfalls pathogenetisch bedeutsam sein. So führen Duplikationen des NROB1(DAX1)-Gens zur dosissensitiven Geschlechtsumkehr.

Unter dem Phänotyp versteht man die Gesamtheit der an einem Individuum beobachteten Merkmale. Die genetische Information, die einen bestimmten Phänotyp verursacht, wird als Genotyp bezeichnet. Alternative Varianten eines Gens oder eines genetischen Markers am selben Genort nennt man Allele, die entweder Polymorphismen oder Mutationen darstellen können. Da jedes gesunde Individuum zwei Kopien jedes autosomalen Chromosoms besitzt, kann jedes Individuum nur zwei Allele eines Genortes aufweisen. Innerhalb einer Population können jedoch mehrere Allele auftreten, was man sich bei der Kopplungsanalyse mittels Mikrosatellitenmarker oder SNP zunutze macht. Das normale oder gewöhnlich auftretende Allel nennt man Wildtyp. Wenn beide Allele eines Genortes identisch sind, spricht man von Homozygotie. Kommt die Homozygotie in konsanguinen Familien durch eine Ursprungsmutation in dieser Familie zustande und wird das Allel „identical by descent“ in der Familie so vererbt, dass die Nachkommen dieses Allel homozygot tragen, so spricht man von Autozygotie. Unterscheiden sich die Allele eines Genortes, so ist das Individuum an diesem Genort heterozygot. Wenn bei einer autosomal-rezessiven Erkrankung zwei nicht identische mutierte Allele an den Patienten vererbt werden, so ist er am Genort gemischt („compound“) heterozygot. Hemizygot sind z. B. ein männlicher Patient mit einer Mutation auf dem singulären X-Chromosom oder ein Patient mit dem Verlust eines Allels eines bestimmten Genortes. Unter einem Haplotyp versteht man eine Gruppe nebeneinander liegender Allele in einer bestimmten chromosomalen Region.

Die Bedeutungen der Begriffe Penetranz und Expressivität stehen inhaltlich zwar in Beziehung, sind jedoch klar voneinander abzugrenzen. Unter Penetranz versteht man die Häufigkeit oder Wahrscheinlichkeit, mit der sich ein Genotyp im Phänotyp seines Trägers manifestiert (Strachan und Read 1996). Die Expressivität bezieht sich auf die Art oder das Ausmaß der phänotypischen Expression des Gens oder Genotyps. Bei fehlender Expressivität eines vorhandenen Allels spricht man von fehlender Penetranz. Vollständige Penetranz meint, dass alle mutationstragenden Individuen den Phänotyp ausprägen, während bei unvollständiger Penetranz einige mutationstragende Individuen keinen Phänotyp zeigen. Eine unvollständige Penetranz kommt vorrangig bei autosomal-dominant vererbten Erkrankungen vor und zeigt sich darin, dass Generationen durch klinisch nicht betroffene Merkmalsträger übersprungen werden.

Einige Mutationen verursachen einen geschlechtsspezifischen Phänotyp, wie z. B. Mutationen auf dem X- oder Y-Chromosom. So führen Mutationen auf dem X-Chromosom gewöhnlich nur bei Jungen zur Ausprägung eines Krankheitsbildes wie der angeborenen Nebenniereninsuffizienz (MIM #300200; Abschn. 6), während heterozygote Mädchen je nach Grad der X-Inaktivierung einen milden oder keinen Phänotyp aufweisen. Mutationen auf dem männlichen Y-Chromosom, wie z. B. Mutationen im DAZ-Gen („deleted in azoospermia“), verursachen Störungen der Spermatogenese oder Azoospermie.

Dabei kommt der Familienanamnese eine besondere Bedeutung zu, da diese entscheidende Hinweise für eine genetische Komponente der Erkrankung geben kann.

Da die Penetranz und Expressivität einer genetischen Krankheit altersabhängig sein und neue Familienmitglieder dazukommen können, sollte man die Familienanamnese in Abständen wiederholen und ergänzen. Vermutet man aufgrund der gewonnenen Daten eine genetische Krankheit, so findet man auf der kontinuierlich aktualisierten Datenbank „Online Mendelian Inheritance in Man“ (OMIM 2017), in der mehrere tausend genetische Erkrankungen aufgelistet sind, auf schnellem Weg alle relevanten Informationen.

Die OMIM-Datenbank ist außerdem mit zahlreichen weiteren elektronischen Datenbanken, wie z. B. GenBank, UniGene oder Medline, verbunden und bietet eine Übersicht über die relevante Literatur.

Bei Keimbahnmutationen reicht in den meisten Fällen die DNA aus den kernhaltigen Zellen einer EDTA-Blutprobe aus. Bei somatischen Mutationen, wie z. B. beim McCune-Albright-Syndrom (MIM #174800), bei dem die aktivierende Mutation des Kodons Arginin²⁰¹ des GNAS1-Gens nur in bestimmten Geweben vorkommt, kann die Mutation nur in diesen betroffenen Geweben (beim McCune-Albright-Syndrom z. B. in ovariellem Gewebe oder der Gewebeprobe eines hyperpigmentierten Hautareals) nachgewiesen werden.

Wenn eine molekulare Diagnose eines Patienten möglich erscheint, sind bestimmte Grundregeln zu beachten, die den ethischen Grundsätzen für die medizinische Forschung am Menschen (Weltärztebund von Helsinki 2017) Rechnung tragen müssen.

Der Patient kann jederzeit die Einstellung der Untersuchung verlangen, deshalb ist auf die Freiwilligkeit einer genetischen Untersuchung immer hinzuweisen (Deutsche Gesellschaft für Humangenetik (GfH) und Berufsverband Deutscher Humangenetiker e.V. (BVDH) 2007a). Eine genetische Diagnostik bei minderjährigen Patienten unterliegt besonderen ethischen Richtlinien, die durch die Richtlinie der Gendiagnostik-Kommission (GEKO) zu genetischen Untersuchungen bei nicht einwilligungsfähigen Personen nach § 14 in Verbindung mit § 23 Abs. 2 Nr. 1c Gendiagnostikgesetz in der Fassung vom 26.07.2011, veröffentlicht und in Kraft getreten am 27.07.2011 definiert wurden (Bundesgesundheitsbl 2011). Folgt man diesen Richtlinien, so ist eine genetische Diagnostik bei Kindern und Jugendlichen dann angezeigt, wenn sie zur Klärung der Differenzialdiagnose einer bestehenden Symptomatik bzw. zur Feststellung einer Erkrankungsursache erforderlich ist. Ziel dieser genetischen Untersuchung muss es sein, eine genetisch bedingte Erkrankung oder gesundheitliche Störung zu vermeiden, zu behandeln oder dieser vorzubeugen. Eine prädiktive genetische Diagnostik im Kindes- und Jugendalter ist somit nur dann erlaubt, wenn mit dem Auftreten einer Erkrankung in diesem Lebensalter zu rechnen ist und medizinische Maßnahmen zur Prävention oder Therapie ergriffen werden können. Für eine erst im Erwachsenenalter auftretende Erkrankung, für die keine Präventionsmaßnahmen möglich sind, darf dagegen bei einem gesunden Kind keine genetische Diagnostik durchgeführt werden. Eine genetische Untersuchung ohne unmittelbaren Nutzen für das Kind kann ausnahmsweise zulässig sein, wenn das Ergebnis der Mituntersuchung des Kindes zwingend erforderlich ist, um zu klären, ob im Hinblick auf eine geplante Schwangerschaft einer genetisch verwandten Person eine bestimmte genetisch bedingte Erkrankung oder gesundheitliche Störung bei einem zukünftigen Nachkommen der genetisch verwandten Person auftreten kann.

Das menschliche Genom ist ein grundlegendes Element der persönlichen und familiären Identität. Im Gegensatz zu vielen anderen medizinischen Untersuchungen können genetische Untersuchungen schwerwiegende Auswirkungen auf die psychosoziale Verfassung und die Familienplanung der Ratsuchenden haben. Deshalb kommt der Beratung vor und nach genetischen Tests eine besondere Bedeutung zu und geht über die übliche ärztliche Aufklärung hinaus (Deutsche Gesellschaft für Humangenetik (GfH) und Berufsverband Deutscher Humangenetiker e.V. (BVDH) 2007b).

Ist eine molekulargenetische Analyse zur Sicherung der klinischen Verdachtsdiagnose möglich, sollten der Patient und/oder die Eltern vor der Blutabnahme über mögliche Konsequenzen des Befundes, auch hinsichtlich des Erkrankungsrisikos für die Nachkommen, aufgeklärt werden. Der Berufsverband Deutscher Humangenetiker empfiehlt, die Ergebnisse genetischer Diagnosen immer im Rahmen einer genetischen Beratung mitzuteilen. Von einer telefonischen Übermittlung genetischer Befunde ist dringend abzuraten. Trotz vorheriger detaillierter Beratung der Patienten und Eltern wird ein telefonischer Befund häufig nicht richtig verstanden oder fehlinterpretiert. Jugendliche Patienten sollten in angemessener Weise und entsprechend dem individuellen Reifegrad in den Beratungsprozess mit einbezogen werden. So sollte der genetischen Beratung der Eltern eines Mädchens mit Ullrich-Turner-Syndrom eine altersgerecht formulierte Aufklärung der heranwachsenden Patientin folgen, um ihr ein frühes Verständnis für die eigene Erkrankung zu ermöglichen.

Neben der Differenzialdiagnostik für Erkrankte ist auch eine pränatale Diagnostik für einige genetisch bedingte endokrinologische Erkrankungen möglich. Hierbei muss mit jedem Ratsuchenden gut überlegt werden, ob das Wissen um den Genträgerstatus für die weitere Familienplanung und Lebensplanung hilfreich und erforderlich ist. So ist z. B. die Untersuchung des Überträgerstatus bei Familien mit einem Indexpatienten mit adrenogenitalem Syndrom durch 21-Hydroxylase-Mangel nur dann sinnvoll, wenn die Familie weiteren Kinderwunsch äußert und einer pränatalen Dexamethasontherapie zur Verhinderung der Virilisierung eines potenziell betroffenen Mädchens offen gegenübersteht.