Pneumonie
Autoren
Santiago Ewig und Sören Gatermann

Nosokomiale Pneumonie: Mikrobiologie – Methodik der Probengewinnung

Bei Patienten mit einem klinischen Verdacht auf eine nosokomiale Pneumonie ist immer eine mikrobiologische Diagnostik indiziert. Diese umfasst regelhaft neben Blutkulturen und Pleuraergussflüssigkeit die Gewinnung respiratorischer Materialien aus den tiefen Atemwegen. Respiratorisches Sekret aus den tiefen Atemwegen kann gewonnen werden in Form von Sputum, Tracheobronchialsekret und bronchoalveolärer Lavage (BAL). Die geschützte Bürste (PSB) sowie die transthorakale Feinnadelpunktion werden kaum mehr angewandt. Tracheobronchialsekret und bronchoalveoläre Lavage werden in quantitativen Kulturen aufbereitet, um die diagnostische Aussagekraft des potenziell durch die Flora der oberen Atemwege kontaminierten Materials zu verbessern. Quantitative Kulturen können durch Anlage von Kulturen aus seriellen Verdünnungen oder (vereinfacht) durch die Verwendung kalibrierter Ösen erfolgen. Die Grenzwerte der Keimzahlen, die in PSB und bronchoalveolärer Lavage als wegweisend angenommen werden, sind aus den typischerweise im Sputum oder Tracheobrochialsekret anzutreffenden hohen Keimzahlen und den bei PSB und BAL eintretenden Verdünnungen abgeschätzt. Neue Verarbeitungstechniken wie Multiplex-PCR, MALDI-TOF, PCR/Elektrospray-Ionisations-ESI- Massenspektrometrie und automatisierte Mikroskopie (FISH) können dazu beitragen, die Bearbeitungszeit von Proben deutlich zu verkürzen. Ob sie auch die Ausbeute relevanter Erreger erhöhen, ist zur Zeit noch offen.

Umfang der Diagnostik

Bei Patienten mit einem klinischen Verdacht auf eine nosokomiale Pneumonie ist immer eine mikrobiologische Diagnostik indiziert. Diese umfasst:
  • die Gewinnung respiratorischer Materialien aus den tiefen Atemwegen. Diese sind eindeutig die wichtigsten Untersuchungsmaterialien,
  • zwei Paar Blutkulturen,
  • ggf. Pleuraergussflüssigkeit,
  • ggf. einen Legionellen-Antigentest im Urin.
Über diese mikrobiologische Diagnostik hinaus ist immer eine klinische Differentialdiagnose anzuschließen (siehe Kap. Diagnose der nosokomialen Pneumonie).

Methodik der Gewinnung und Verarbeitung respiratorischer Materialien

Im Folgenden werden die Techniken der Gewinnung und der Verarbeitung respiratorischer Materialien im Einzelnen dargestellt. Die kritische Bewertung der Untersuchungsergebnisse erfolgt im Kap. Mikrobiologische Diagnostik: Aussagekraft quantitativer Kulturen respiratorischer Sekrete.
Respiratorische Materialien können sein:
  • Sputum (bei spontan atmenden Patienten)
  • Tracheobronchialaspirat
  • bronchoalveoläre Flüssigkeit (BALF)
Kaum mehr Anwendung finden:
  • die geschützte Bürste („protected specimen brush“, PSB)
  • die transthorakale Feinnadelpunktion

Quantitative Kulturen

Kulturen des Tracheobronchialsekrets haben zwar eine hohe Sensitivität, aber eine geringe Spezifität für das Vorliegen einer nosokomialen Pneumonie. Eine bessere Aussagekraft ergibt sich durch Anlage quantitativer (oder semiquantitativer) Kulturen. Unter quantitativen Kulturen werden Kulturen von Verdünnungsreihen verstanden. Quantitäten werden dabei als koloniebildende Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) angegeben (Abb. 1). Eine alternative Methode verwendet Ausstrichösen, die ein definiertes Volumen fassen, sodass Keimzahlbestimmungen analog quantitativer Urinkulturen möglich sind (Abb. 2) (Afessa et al. 2006).
Gelegentlich werden semiquantitative Methoden mit nur einer Verdünnungsstufe verwendet, die die Keimmenge reflektieren (und z. B. als gering, mäßig, viel und massenhaft angegeben werden), aber besser zur Abschätzung des Verhältnisses der gefundenen Spezies zueinander als zur Bestimmung der absoluten Keimzahl geeignet sind.
Aus Sputumkulturen von Patienten mit Pneumonien ist bekannt, dass dort in der Regel in einem Milliliter respiratorischen Sekrets Keimzahlen von ≥ 105 KBE/ml gefunden werden. Für das Tracheobronchialsekret werden in der Regel höhere Trennwerte zugrunde gelegt (Abb. 3).

Sputum

Das Sputum spielt in der Diagnostik der nosokomialen Pneumonie eine noch geringere Rolle als bei der ambulant erworbenen. Dies ist darin begründet, dass spontan atmende Patienten, die eine nosokomiale Pneumonie entwickeln, häufig immobil bzw. bettlägerig sind und kein adäquates Sputum hervorbringen können.

Technisches Vorgehen

Der Patient sollte aufrecht sitzen. Er sollte informiert werden, ein Sekret möglichst aus der Tiefe (nicht Speichel) abzuhusten. Nicht alle Patienten können ein Sekret abhusten. In diesen Fällen kann ggf. die Gewinnung eines induzierten Sputums durch Inhalation von 3 % NaCl-Lösung versucht werden. Wenn ein Sputum hervorgebracht wird, sollte es als solches makroskopisch verifiziert werden. Es sollte in der Regel Eiterflocken enthalten. Bei induziertem Sputum allerdings ist dieses Kriterium nicht mehr aussagekräftig.

Verarbeitung

Eine umgehende Verarbeitung binnen maximal vier Stunden ist erforderlich; ist diese Zeit nicht einzuhalten, kann das Material bei 4 ° C aufbewahrt und innerhalb von 24 h verarbeitet werden (de Lassence et al. 2001) Das Sputum sollte nach Gram gefärbt werden, um seine Qualität zu überprüfen und nach einer vorherrschenden Bakterienmorphologie zu suchen. Nur Ergebnisse aus einem qualitativ guten Sputum (>25 Neutrophile, < 10 Plattenepithelien pro Gesichtsfeld bei 400-facher Vergrößerung) können als valide betrachtet werden.
Anschließend erfolgt die Anlage von folgenden Kulturen:
  • Blutagar
  • Kochblutagar („Schokoladenagar“) (Nährmedium für Haemophilus influenzae und anspruchvollere Erreger)
  • MacConkey-Agar (Selektivmedium für Enterobakterien, Pseudomonas und Acinetobacter)
  • Sabouraud-Dextrose Agar (Selektivmedium für Hefe- und Schimmelpilze)
Ein Erreger gilt als gesichert, wenn Gramfärbung und Kultur hinsichtlich Morphologie und Identifizierung übereinstimmen.
Eine Quantifizierung der Erreger in der Sputumkultur ist möglich, ist aber bei Patienten mit nosokomialer Pneumonie nicht untersucht worden. Wenn eine Quantifizierung erfolgt, gelten dieselben Trennwerte wie für das Tracheobronchialaspirat (TBAS).

Tracheobronchialaspirat (TBAS)

Das Tracheobronchialaspirat repräsentiert potenziell alle Erreger, die sich im Tracheobronchialsystem befinden. Diese können, müssen aber nicht identisch sein mit Erregern, die im tiefen bronchopulmonalen Segment vorliegen.

Technisches Vorgehen

Für die Validität des Tracheobronchialaspirats ist es wichtig, bei der Entnahme eine Kontamination durch Sekrete und Flüssigkeiten, die im Tubus liegen, zu vermeiden. Zu diesem Zweck wird vor einer Gewinnung des Tracheobronchialsekrets der Tubus mit einem Absaugschlauch von Sekreten frei gemacht. Anschließend wird zuerst ein neuer Absaugschlauch eingeführt und nachfolgend das Sekret der tiefen Atemwege abgesaugt und in das frische, sterile Auffanggefäß geleitet.
Auch hier ist eine umgehende Verarbeitung binnen maximal vier Stunden erforderlich.
Cave
Jede „Anspülung“ führt zu einer Verdünnung des Sekrets und macht eine quantitative Untersuchung wenig aussagekräftig. Daher sollen „Anspülungen“ (Instillationen von Kochsalz-Lösung) unterlassen werden. Gelingt es nicht, ein natives Sekret zu gewinnen, so ist eine Untersuchung des Tracheobronchialsekrets nicht möglich.

Verarbeitung

Die Verarbeitung erfolgt analog der des Sputums. Quantitative Kulturen sind auch hier möglich.

Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF)

Die BALF ist ein kostbares Untersuchungsgut, da diese potenziell am besten die Verhältnisse im alveolären Segment reflektiert. Sie ist es aber nur dann, wenn sie technisch korrekt durchgeführt wird und umgehend innerhalb von maximal vier Stunden verarbeitet wird.
Die BALF reflektiert etwa 1 Mio. Alveolen, d. h. 1 % der Lungenoberfläche. Sie ergibt eine ca. 100-fache Verdünnung des epithelialen Lungenoberflächen-Films (engl. „epithelial line fluid“, ELF).

Technisches Vorgehen

Vor Beginn der eigentlichen Prozedur sollte festgelegt werden, welcher Lungenlappen bzw. welches Lungensegment angesteuert wird. Bei diffusen Infiltraten ist ein Mittellappen- bzw. Lingulasegment zu bevorzugen, da diese Lokalisationen die beste Lavage-Rückgewinnung ermöglichen. Im Falle lokalisierter Infiltrate muss der betroffene Lungenlappen bzw. das betroffene Lungensegment untersucht werden.
Voraussetzung für eine hinreichende Gewinnung von Material ist eine Präoxygenierung und tiefe Sedierung. Lokalanästhetika sollen möglichst keine Anwendung finden, da sie bakteriell wachstumshemmend wirken können. Eine Aspiration von tracheobronchialem Sekret vor Beginn der bronchoalveolären Lavage ist unbedingt zu vermeiden, da ansonsten der gesamte Arbeitskanal kontaminiert ist. In Fällen, in denen der Tracheobronchialbaum mit reichlich Eiter verlegt ist, sollte vor der bronchoalveolären Lavage eine gründliche Absaugung durch einen Schlauch erfolgen.
Das Bronchoskop wird rasch vor das gewünschte bronchiale Ostium geführt und segmental bzw. subsegmental geschlossen gehalten („gewedgt“).
Die bronchoalveoläre Lavage kann mit unterschiedlichen Mengen Lavageflüssigkeit erfolgen, sollte jedoch einem internen Standard folgen. Wir favorisieren 6 × 20 ml körperwarme physiologische Kochsalzlösung. Die Portionen werden instilliert und unmittelbar reaspiriert. Die Reaspiration sollte am besten per Hand erfolgen, da auf diese Weise ein Bronchialkollaps vermieden bzw. im Ausmaß kontrolliert werden kann. Die erste rückgewonnene Portion sollte verworfen werden; sie repräsentiert das sogenannte „bronchiale“ Kompartiment. Die fünf folgenden Portionen stellen das „alveoläre“ Kompartiment dar und werden am besten über eine sterile Gaze auf einem sterilen Gefäß gefiltert und gepoolt.
Bei geringer Rückgewinnungsmenge können noch ein bis zwei weitere Portionen gegeben und reaspiriert werden. Ideal ist eine Rückgewinnungsmenge von 30 ml; geringere Portionen bis ca. 10 ml können aber auch noch untersucht werden.
Die bronchoskopische Untersuchung wird beendet durch Herausziehen des Bronchoskops aus dem Lavagesegment. Anschließend kann ggf. der Tracheobronchialbaum noch einmal inspiziert werden. Jedwedes Sekret sollte abgesaugt werden.
Bei einigen Patienten, vor allem bei solchen mit ausgeprägtem Emphysem, kommt es zu einem Versacken der gesamten Lavageflüssigkeit ohne die Möglichkeit einer nennenswerten Rückgewinnung. In diesen Fällen sollte die Untersuchung abgebrochen werden; hier muss ein Tracheobronchialsekret untersucht werden.
Cave
Wird die BAL technisch nicht adäquat durchgeführt, ist ihr Wert deutlich geschmälert. Es handelt sich dann meist weniger um eine BALF als um eine gezielte Absaugung. Eine quantitativ-kulturelle Untersuchung solchen Sekrets ist wenig aussagekräftig und sollte daher unterlassen werden.

Verarbeitung

Die BALF sollte umgehend (maximal innerhalb von 4 Stunden oder maximal 24 Stunden nach Kühlung bei 4 Grad) verarbeitet werden.
Es erfolgt zunächst eine Gramfärbung. Anschließend wird das Material auf folgenden Kulturmedien ausgestrichen:
  • Blutagar
  • Kochblutagar („Schokoladenagar“) (Nährmedium für Haemophilus influenzae und anspruchvollere Erreger)
  • MacConkey-Agar (Selektivmedium für Enterobakterien, Pseudomonas und Acinetobacter)
  • Sabouraud-Dextrose-Agar (Selektivmedium für Hefe- und Schimmelpilze)
  • ggf. (bei entsprechendem klinischen Verdacht) Holzkohle-Hefeextrakt-Agar (Selektivmedium für Legionellen)
Zusätzlich können aus der BALF folgende Untersuchungen vorgenommen werden:
  • Untersuchung auf intrazelluläre Erreger (engl. „intracellular organisms“, ICOs) in polymorphkernigen Leukozyten und Makrophagen, über ein Gram- oder Giemsa-Zytozentrifugenpräparat. Grenzwerte werden bei ≥ 2–5 % ICOs angegeben. Intrazelluläre Einschlüsse Bakterien zuzuordnen, bedarf großer Erfahrung mit dem Verfahren.
  • Färbung mit KOH, Identifikation von Elastinfasern, als Marker einer Gewebezerstörung durch gramnegative Erreger, vor allem auch durch Pseudomonas aeruginosa
Grenzwerte für sogenanntes „signifikantes Wachstum“ sind Ergebnis einer Schätzung. Wie oben ausgeführt, ergeben sich bei Sputumkulturen von Patienten mit Pneumonien in der Regel in einem Milliliter respiratorischen Sekrets Keimzahlen von ≥ 105 KBE/ml. Für die BALF wird ein Verdünnungsfaktor von ca. 10 bis 100 angenommen, sodass der Trennwert meist bei ca. ≥ 104 bis 105 KBE/ml angesetzt wird (Abb. 3).

Korrektur durch Verdünnungsfaktor

Erst spät im Verlauf der Diskussion um den Wert der BALF wurde untersucht, ob die Ergebnisse der BALF unabhängig von einer Korrektur für die Verdünnung interpretiert werden können. Für die Berechnung des Verdünnungsfaktors wurde Harnstoff nach folgender Formel gewählt:
Konzentration des Harnstoffs im Plasma / Konzentration der Harnstoffs in der reaspirierten Lavageflüssigkeit
Während in einer Untersuchung die Verdünnungen erheblich variierten (zwischen 1,8 und 300) und entsprechend auch mehr Patienten mit signifikanten Keimzahlen resultierten (17 %), war dies in einer anderen weniger der Fall (Verdünnungen zwischen 10 und 100, signifikante Keimzahlen in 13,3 %) (Baldesi et al. 2009; Zedtwitz-Liebenstein et al. 2005).
Zudem ist zu bedenken, dass gegen Harnstoff als Verdünnungsfaktor grundsätzliche methodische Vorbehalte bestehen. Somit bleibt zur Zeit ungeklärt, ob eine Korrektur für die Verdünnung angegeben werden sollte oder nicht. In der aktuellen Praxis ist das nicht üblich.
Merke
Den quantitativen Trennwerten einer BALF liegen Schätzwerte und keineswegs exakte Messungen zugrunde. Trennwerte werden in Studien auch nicht einheitlich gehandhabt. Für die BAL finden sich Trennwerte zwischen ≥ 104 und ≥ 105 KBE/ml.

Der „bakterielle Index“

Einige Arbeitsgruppen haben Keimzahlen als Logarithmus angegeben. Dadurch ergeben sich besser handhabbare Zahlen. Durch Addition der Logarithmen entsteht der sogenannte „bakterielle Index“ (BI) (Johanson et al. 1988). Einige Autoren haben unter Zugrundelegung des bakteriellen Index überzeugende Untersuchungen zum diagnostischen Wert der BALF vorgelegt (z. B. Aubas et al. 1994)
Cave
Dabei ist allerdings zu beachten, dass es keine Untersuchungen darüber gibt, ob die Summe der Logarithmen der Keimzahlen zweier bzw. mehrerer Erreger (eigentlich also das Produkt der Keimzahlen) unterhalb von Trennwerten die gleiche Bedeutung hat wie die hohe Keimzahl eines Erregers oberhalb eines Trennwertes.

Potenzielle Komplikationen

Die bronchoalveoläre Lavage ist eine sehr sichere Untersuchungsmethode.
Dennoch muss beachtet werden, dass es zu ausgeprägten und mindestens 24 h anhaltenden Desoxygenierungen im Rahmen einer BAL kommen kann. Entgegen landläufiger Meinung hängt dieses Risiko nicht von der Lavagemenge ab. So fand sich diesbezüglich kein Unterschied in einer vergleichenden Untersuchung von 40 versus 160 ml Lavageflüssigkeit. Risikofaktoren sind vielmehr der Grad der Desoxygenierung vor BAL sowie eine tatsächlich durch BAL bestätigte Pneumonie (Bauer et al. 2001). Bei schweren Oxygenierungsstörungen (PaO2/FIO2 < 100) sollte daher von einer BAL abgesehen werden.
Auch ausgeprägte Gerinnungsstörungen sind keine Kontraindikation gegen eine BAL; allerdings sollte diese in solcher Konstellation von erfahrenden Untersuchern mit besonderer Umsicht durchgeführt werden, um Schleimhautverletzungen zu vermeiden.
Nicht selten kommt es nach einer BAL zu vorübergehendem, auch hohem Fieber. Dieses darf nicht mit einer nosokomialen Superinfektion gleichgesetzt werden, vielmehr rührt das Fieber aus einer Zytokinfreisetzung im Rahmen der BAL. Allerdings sind auch nosokomiale Pneumonien durch mikrobiell kontaminierte Bronchoskope möglich.

Modifikationen der BAL

Zahlreiche Modifikationen der BAL sind in der Literatur beschrieben. Keine von diesen hat sich der bronchoskopischen als überlegen erwiesen. Da sie jedoch besondere Erfahrung in der Durchführung verlangen, hat sich auch keine weitflächig durchgesetzt. Sie werden hier nur kurz der Vollständigkeit halber dargestellt.

Bronchoskopische Modifikationen

Hier ist die sogenannte „geschützte BAL“ (engl. „protected BAL“, p-BAL) zu nennen. Bei dieser Methode wird ein Lavagekatheter eingeführt, der distal einen aufblasbaren Ballon enthält und an der Spitze verschlossen ist. Das Segment wird weniger durch das Bronchoskop selbst, sondern in erster Linie durch Aufblasen des distalen Ballons verschlossen; anschließend erfolgt durch die erste eingegebene Lavageportion eine Perforation der Kunststoffmembran an der Spitze (Meduri et al. 1991 und 1992).
Theoretisch ermöglicht der p-BAL-Katheter somit in zuverlässigerer Weise, Kontaminationen durch Sekrete außerhalb des Lavagesegments zu vermeiden. In weiteren Untersuchungen hat sich jedoch eine diagnostische Überlegenheit des p-BAL-Katheters nicht bestätigen lassen. Der Katheter erschwert zudem die Untersuchung durch eine technisch schwierigere und dadurch geringere Rückgewinnung.

Nichtbronchoskopische Modifikationen

Statt eines Bronchoskops sind eine Reihe von Kathetern entwickelt worden, die eine sogenannte „blinde“ BAL erlauben. Bei der sogenannten „Mini-BAL“ handelt es sich um einen Lavageketheter, mit dem Lavagen von 30–40 ml durchgeführt werden. In den USA erfolgte die Prozedur durch erfahrene Atemtherapeuten (Kollef et al. 1995).
Auch mit der Mini-BAL ist weder ein diagnostischer Vorteil verbunden, noch handelt es sich um eine sicherere Methode. Da die Lage der Katheter nicht über Durchleuchtung kontrolliert wurde, ist ohnehin anzunehmen, dass diese „Lavagen“ in einigen Fällen eher Bronchialspülungen entsprechen.

Geschützte Bürste („PSB“)

Technik

Die Technik der geschützten Bürste (engl. „protected specimen brush“, PSB) wurde erstmals von Wimberly (Wimberly et al. 979) beschrieben. Bei der geschützten Bürste handelt es sich um einen Katheter, in den ein innerer Katheter eingelassen ist, der eine ausfahrbare Bürste enthält. Der äußere Katheter ist durch einen Verschluss (meist ein Zucker- oder Wachsstückchen) versiegelt. Der äußere Katheter wird bronchoskopisch über den Arbeitskanal unter Sicht vor ein Lungensegment geführt und anschließend der innere Katheter unter Auswurf des Verschlusses des äußeren Katheters in die Peripherie einige Zentimeter vorgefahren. Anschließend wird die Bürste ausgefahren und im Gewebe abgestrichen. In umgekehrter Reihenfolge wird die Bürste dann geborgen.

Verarbeitung

Die Spitze der Bürste wird über einem Gefäß mit 1 ml Trägermedium mit einer sterilen Schere abgeschnitten. Wieder ist eine rasche Verarbeitung bis zu 4 h nach Gewinnung erforderlich. Durch Transport in physiologischen Kochsalz- oder Ringerlösungen über eine Zeit über 4 h hinaus kann es zu einer erheblichen Reduktion im Wachstum empfindlicher Erreger kommen; bei Kühlung bis 4 Grad kann die PSB auch noch innerhalb von 24 h verarbeitet werden (de Lassence et al. 2001). Im Labor wird das Gefäß stark geschüttelt, um alle an der Bürste haftenden Bakterien in Suspension zu bringen. Anschließend erfolgen die kulturellen Ausstriche analog der BALF.
Grenzwerte für sogenanntes „signifikantes Wachstum“ aus quantitativen Kulturen ergeben sich aus einer Schätzung ähnlich der BALF. Für die PSB wird angenommen, dass sie 0,001 respiratorisches Sekret enthält, sodass 103 KBE/ml in der Kultur der PSB einer Keimlast von 106 im nativen respiratorischen Sekret entspricht. Entsprechend wird der Trennwert bei ≥ 103 KBE/ml angesetzt (Abb. 3).
Merke
Den quantitativen Trennwerten der PSB liegen Schätzwerte und keineswegs exakte Messungen zugrunde.

Potenzielle Komplikationen

Diese sind äußerst gering. Selten kann es zu einer (meist unbedeutenden) lokalen Blutung kommen.
Für die Einschätzung PSB gelten daher analoge Limitationen wie für die BALF. Weitere Limitationen der PSB ergeben sich aus der sehr geringen Sekretmenge, die gewonnen wird; somit besteht potenziell eine geringere Sensitivität. Außerdem ist die Aussagekraft daran gebunden, dass das beprobte Areal den Zustand des infizierten Areals widerspiegelt, d. h. die Untersuchung unterliegt einem „sampling-Error“. Zudem steht für weitere Untersuchungen in der Regel keine ausreichende Sekretmenge zur Verfügung und wurde daher oft in Kombination mit der BAL eingesetzt.

Modifikationen der PSB

Die PSB kann auch „blind“ nichtbronchoskopisch eingesetzt werden; die Ergebnisse sind vergleichbar zur Gewinnung über Bronchoskop.

Transthorakale Feinnadelpunktion

Besonders spanische Autoren haben wiederholt eindrückliche Ergebnisse der „blinden“ transthorakalen Feinnadelpunktion (ultrafeine Nadel, 25G) bei spontan atmenden Patienten mit nosokomialer Pneumonie berichtet. Auch bei einer der besten Studien zur nosokomialen Pneumonie des spontan atmenden Patienten wurde diese Technik eingesetzt (Dorca et al. 1995). Dabei handelt es sich um eine der ältesten Techniken zur Erregerdiagnostik.
Die transthorakale Feinnadelpunktion ergibt ein nahezu kontaminationsfreies Material aus dem alveolären Kompartiment; nahezu jeder Keimnachweis kann daher als Erregernachweis gelten. In der erwähnten Studie waren positive Resultate in 42/91 untersuchten Patienten zu erzielen, knapp ein Drittel davon ergab eine therapeutische Konsequenz. In nahezu der Hälfte der Fälle ergab die Feinnadelpunktion verglichen mit konventioneller Diagnostik eine zusätzliche Information, in nur 7 % ergab allein die konventionelle Diagnostik eine solche (Tab. 1 und 2).
Tab. 1
Bakterielle Isolate der transthorakalen Feinnadelpunktion bei spontan atmenden Patienten mit nosokomialer Pneumonie: Anzahl der bakteriellen Isolate bei 42 positiven Nachweisen durch transthorakale Feinnadelpunktion (Dorca et al. 1995)
Anzahl Isolate
Gefunden bei n/n
%
1
28/42
66,7
2
9/42
21,4
3
3/42
7,1
4
1/42
2,4
5
1/42
2,4
Tab. 2
Bakterielle Isolate der transthorakalen Feinnadelpunktion bei spontan Patienten mit nosokomialer Pneumonie: Erregerspektrum (Dorca et al. 1995)
Erreger
Anzahl, n
Anzahl, %
15
25
Legionella pneumophila
12
18,7
Anaerobier
8
12,5
Streptococcus pneumoniae
7
10,9
Alpha-hämolysierende Streptokokken
6
9,4
Staphylococcus aureus
6
9,4
4
6,2
Candida albicans
2
3,1
Bacillus spp.
1
1,6
Eikenella corrodens
1
1,6
Dennoch sind die Erfahrungen außerhalb Spaniens gering, die Vorbehalte der Untersuchung gegenüber weiterhin groß, sodass sich diese Untersuchung nicht durchgesetzt hat, auch nicht in Spanien selbst. Ob dies angemessen ist, bleibt eine offene Frage.

Technik

Die Methodik der transthorakalen Feinnadelpunktion findet sich in den Arbeiten von Zavala und Schoell 1989 und Manresa und Dorca 1999 wiedergegeben.

Verarbeitung

Die Verarbeitung entspricht derjenigen der anderen respiratorischen Sekrete, wenn möglich ergänzt durch weitere Nährmedien. Eine Quantifizierung ist nicht erforderlich, da es sich bei angemessener Technik um ein kontaminationsfreies Material handelt. Anaerobe Kulturen, eine Ansetzung von Anreicherungsbrühen und auf BHI-Agar können erwogen werden.

Potenzielle Komplikationen

Entgegen naheliegender Vorbehalte hinsichtlich Pneumothoraces und Blutungen ist die Feinnadelpunktion zumindest in erfahrenen Händen eine sichere Methode; so traten in der erwähnten Studie in 5 % transiente Hämoptysen und ein nicht drainagepflichtiger Pneumothorax in 3 % auf.

Neue molekularbiologische bzw. massenspektrometrische Methoden

Limitationen der klassischen mikrobiologischen Diagnostik

Die klassische mikrobiologische Diagnostik bringt folgende wesentliche Nachteile mit sich:
  • Die Verarbeitung der Proben (Kultur, Isolation des Erregers sowie Resistenztestung) benötigen zwischen 2 und 4 Tagen. Dieser Zeitverzug kann der klinischen Forderung nach einer möglichst gezielten Indikationsstellung und Fokussierung einer antimikrobiellen Therapie nicht hinreichend genügen.
  • In vielen Fällen gelingt gar kein Erregernachweis, sei es, weil manche Erreger nur schwer anzüchtbar sind, sei es aufgrund einer häufig vorbestehenden antimikrobiellen Therapie
Neue molekularbiologisch bzw. massenspektrometrisch basierte Untersuchungstechniken versprechen hier eine schnellere Diagnostik innerhalb weniger Stunden sowie eine höhere Ausbeute an Erregern (Basnayake und Waterer 2015; Douglas et al. 2016).

PCR und automatisierte Multiplex-PCR

PCR bzw. real-time PCR
Diese sind unabhängig von Kulturen aus dem Direktmaterial durchführbar und können ein Ergebnis binnen weniger Stunden (ca. 24 h) liefern. Automatisierte PCR-Verfahren auf dem Boden der real-time PCR können mehrere PCR parallel durchführen. Die Geräte können dabei bis zu 25 verschiedene Erreger identifizieren, zusätzlich ein Resistenzgen (mecA). Die Bestimmungen können in weniger als 6 h aus ca. 1,5 ml Vollblut durchgeführt werden.
MALDI-TOF (= matrix assisted laser desorption/ionisation – time of flight)
Diese basiert auf der Analyse ribosomaler Proteinspektren. Die Vorteile sind vielfältig. Die Messung ist unabhängig von der DNA. Sie erlaubt (nach kultureller Isolierung) die Identifikation von ca. 200 Mikroorganismen in weniger als 5 Minuten. Allerdings setzt die Methode ein Isolat in der Kultur voraus. Zudem unterscheidet sie nicht sicher sehr eng verwandte Bakterienspezies. Schließlich lässt sie bisher nur eingeschränkt eine Untersuchung auf Resistenzgene zu; allerdings lässt sie sich mit automatisierten Resistenzbestimmungs-Geräten kombinieren.
Die MALDI-TOF-Technologie ist bereits in vielen Laboratorien etabliert. Sie stellt einen erheblichen Rationalisierungsgewinn dar und trägt maßgeblich zur Verkürzung der Verarbeitungszeit der Proben bei. So kann die schnelle Identifizierung bereits zur Therapieeinleitung benutzt werden.
PCR und Elektrospray-Ionisations (ESI)-Massenspektrometrie (z. B. Iridica®)
Hierbei handelt es sich um eine massenspektrometrische Analyse von DNA-Amplifikaten. Durch eine universelle PCR werden die bei allen Pathogenen vorhandenen Gene für die rRNA amplifiziert und die Masse der Amplifikate bestimmt. Eine Datenbank identifiziert anhand der Massen die nachgewiesenen Mikroorganismen. Die Bestimmung ist kulturunabhängig und erlaubt die Identifikation von > 1000 Mikroorganismen in 4–6 h. Allerdings schließt auch dieses System nur wenige Resistenzbestimmungen ein. Diese Technik ist noch neueren Datums, sehr kostenintensiv und noch nicht vollständig evaluiert.
FISH (Fluorescent In-situ-Hybridization) automatisierte Mikroskopie (z. B. Accerlerate®)
Diese Technik erlaubt die automatisierte mikroskopische Identifikation (über fluoreszensmarkierte Sonden) von mehr als 30 Pathogenen sowie deren MHK-Bestimmung (über rechnergestützte Analyse mikroskopischer Bilder) binnen ca. 4–6 h. Die Anwendung auf respiratorische Proben befindet sich noch im experimentellen Stadium (Douglas et al. 2015).
Methodische Limitationen
Keine dieser Methoden ist aktuell in der Lage, die Kulturtechniken zu ersetzen. Zum einen ist eine „klassische“ Erregeridentifikation und Resistenztestung in der Regel unverändert erforderlich. Zum anderen identifizieren die neuen Systeme auch nicht alle konventionell gefundenen Erreger.
Zudem stellt sich die Frage nach der klinischen Relevanz der durch PCR identifizierten Erreger, mithin nach der tatsächlichen Bedeutung der Identifikation eines Erregers durch PCR, der kulturell nicht nachgewiesen werden kann.
Klinische Daten
Klinische Daten zur PCR und Elektrospray-Ionisations (ESI)-Massenspektrometrie liegen nur sehr begrenzt vor.
In einer Untersuchung von 101 BALF-Proben von 94 Patienten zeigten 91 % einen Keimnachweis. Die Übereinstimmung zwischen konventionellen Kulturen und PLEX-ID betrug 45 % (45/101) sowie 66 % (67/101), wenn Kommensalen ausgeschlossen wurden. PLEX-ID konnte 21 % aller Keime, die konventionell gefunden wurden, nicht nachweisen, umgekehrt verfehlten die traditionellen Kulturen 28 % der Keime, die durch PLEX-ID identifiziert wurden. Die Übereinstimmung für mecA war gering. Die Bedeutung der durch PLEX-ID identifizierten Erreger wurde durch zwei Infektiologen als nicht relevant eingeschätzt (Huttner et al. 2014).
In der sogenannten RADICAL-Studie wurden Vollbut, respiratorische Sekrete und normalerweise sterile Materialien in 911 Proben (darunter 185 mit Pneumonie) von 529 intensivstationären Patienten mittels dem Iridica-System untersucht. Hinsichtlich Bakteriämien lag die Identifikationsrate deutlich höher als bei Blutkulturen (37 % versus 11 %). Bei Atemwegssekreten von Patienten mit Pneumonien identifizierte das System 49 zusätzliche Erreger und verfehlte 13 kulturell identifizierte. Eine positive Übereinstimmung bestand in 68 Fällen, eine negative in 55 Fällen (Vincent et al. 2015).
Die Interpretation dieser Daten erscheint schwierig. Von einer „Sensitivität“ bzw. „Spezifität“ der Ergebnisse, die die Autoren berichten, kann eigentlich keine Rede sein, da der Goldstandard fehlt, anhand dessen die operativen Charakteristika bestimmt werden könnten. Noch dazu arbeiten diese Charakteristika auf einer unsicheren Diagnose einer Pneumonie, die durch einen einfachen Erregernachweis, sei es auch quantitativ, nicht valider wird. Ein fehlender Erregernachweis schließt demnach auf der anderen Seite eine Infektion keineswegs sicher aus.
Die lange Liste an identifizierten Species, darunter eine Vielzahl sicher apathogener Erreger, unterstützt Zweifel an der klinischen Relevanz der Ergebnisse.
Daten wie diese belegen eigentlich nur, dass das System in der Lage ist, in sehr kurzer Zeit eine Vielzahl von Erregern zu identifizieren, die kulturell nicht gefunden werden.
Der nächste Schritt muss daher sein, diese Erregernachweise weiter zu validieren, z. B. durch post-mortem Gewebsproben. Bevor klinische Entscheidungen auf solche Nachweise gestützt werden, müssen des Weiteren Untersuchungen aufgelegt werden, die die Ergebnisse solcher Therapieentscheidungen vergleichend mit bisherigen Strategien auf konventionell-mikrobiologischer Basis analysieren. Sicher wird es erforderlich sein, den Klinikern auch im Interventionsarm Raum für klinische Entscheidungen gegen die Intervention zu eröffnen, da ohne eine solche „Hintertür“ kein Kliniker sich bereitfinden wird, an einer solchen Studie teilzunehmen. In der dargelegten Studie waren jedenfalls nur 34 % einer Expertengruppe bereit, Therapieentscheidungen auf der Grundlage der Ergebnisse des Iridica-Systems zu fällen.
Nur wenig ist zur automatisierten Mikroskopie bekannt. Immerhin konnte in einer Pilotstudie eine Sensitivität von 100 % und eine Spezifität von 97 % für den Nachweis von typischen VAP-Erregern in signifikanter Konzentration einschließlich typischer Resistenzen gefunden werden, dabei betrug die Untersuchungszeit ca. 5 h (Douglas et al. 2015).
Zusammenfassende Wertung
Systeme wie das MALDI-TOF tragen schon heute dazu bei, die Zeit bis zum Erregernachweis deutlich zu verkürzen. Eine begleitende konventionelle mikrobiologische Diagnostik bleibt jedoch erforderlich. Der Stellenwert der Techniken, die PCR und die Elektrospray-Ionisations (ESI)-Massenspektrometrie verbinden, sowie der automatisierten Mikroskopie sind jedoch noch nicht ausgereift und spielen daher für die Behandlung von Patienten mit nosokomialer Pneumonie außerhalb von Studien zur Zeit keine Rolle.

Weiterführende Literatur

Grundlegende methodische Arbeit zur Verarbeitung der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF):
Baselski VS, el-Torky M, Coalson JJ, Griffin JP (1992) The standardization of criteria for processing and interpreting laboratory specimens in patients with suspected ventilator-associated pneumonia. Chest 102(5 Suppl 1):571S–579S
Experimentelle Studie zur Keimlast bei beatmeten Affen, Erstbeschreibung des „bakteriellen Index“:
Johanson WG Jr, Seidenfeld JJ, Gomez P, de los Santos R, Coalson JJ (1988) Bacteriologic diagnosis of nosocomial pneumonia following prolonged mechanical ventilation. Am Rev Respir Dis 137:259–264
Klinische Arbeit zum diagnostischen Wert der bronchoalveolären Lavage unter Zugrundelegung des „bakteriellen Index“:
Aubas S, Aubas P, Capdevila X, Darbas H, Roustan JP, Du Cailar J (1994) Bronchoalveolar lavage for diagnosing bacterial pneumonia in mechanically ventilated patients. Am J Respir Crit Care Med 149:860–866
Grundlegende Arbeit zum Vergleich von quantitativer Kultur durch eine kalibibrierte Öse und serielle Verdünnung; zeigt eine Gleichwertigkeit beider Methoden:
Afessa B, Hubmayr RD, Vetter EA, Keegan MT, Swanson KL, Baddour LM, Cockerill FR 3rd, Peters SG (2006) Bronchoscopy in ventilator-associated pneumonia: agreement of calibrated loop and serial dilution. Am J Respir Crit Care Med 173:1229–1132
Untersuchungen zur Bedeutung der Verdünnung für die Ergebnisse der quantitativen Kulturen der BALF:
Zedtwitz-Liebenstein K, Schenk P, Apfalter P, Fuhrmann V, Stoiser B, Graninger W, Schuster E, Frass M, Burgmann H (2005) Ventilator-associated pneumonia: increased bacterial counts in bronchoalveolar lavage by using urea as an endogenous marker of dilution. Crit Care Med 33:756–759
Baldesi O, Michel F, Guervilly C, Embriaco N, Granfond A, La Scola B, Portugal H, Papazian L (2009) Bacterial ventilator-associated pneumonia: bronchoalveolar lavage results are not influenced by dilution. Intensive Care Med 35:1210–1215
Kann respiratorisches Sekret nicht binnen maximal 4 h verarbeitet werden, ist eine Köhlung bei 4 °C angezeigt; diese kann dann innerhalb von 24 h nach Gewinnung verarbeitet werden:
de Lassence A, Joly-Guillou ML, Martin-Lefevre L, Le Mière E, Lasry S, Morelot C, Coste F, Dreyfuss D (2001) Accuracy of delayed cultures of plugged telescoping catheter samples for diagnosing bacterial pneumonia. Crit Care Med 29:1311–1317
Umfassendste Untersuchung zum Einfluss des Lavagevolumens auf die Oxygenierung; es zeigt sich ein Effekt unabhängig von niedrigen Lavagemengen:
Bauer TT, Torres A, Ewig S, Hernández C, Sanchez-Nieto JM, Xaubet A, Agustí C, Rodriguez-Roisin R (2001) Effects of bronchoalveolar lavage volume on arterial oxygenation in mechanically ventilated patients with pneumonia. Intensive Care Med 27:384–393
Vorstellung und Validierung der Technik des geschützten Lavagekatheters:
Meduri GU, Beals DH, Maijub AG, Baselski V (1991) Protected bronchoalveolar lavage. A new bronchoscopic technique to retrieve uncontaminated distal airway secretions. Am Rev Respir Dis 143(4 Pt 1):855–864
Meduri GU, Wunderink RG, Leeper KV, Beals DH (1992) Management of bacterial pneumonia in ventilated patients. Protected bronchoalveolar lavage as a diagnostic tool. Chest 101:500–508
Referenzuntersuchung zur Technik der Mini-BAL:
Kollef MH, Bock KR, Richards RD, Hearns ML (1995) The safety and diagnostic accuracy of minibronchoalveolar lavage in patients with suspected ventilator-associated pneumonia. Ann Intern Med 122:743–748
Erstbeschreibung der Technik der PSB:
Wimberly N, Faling U, Bartlett JG (1979) A fiberoptic bronchoscopy technique to obtain uncontaminated lower airway secretions for bacterial culture. Am Rev Respir Dis 119:337–343
Umfassende Evaluation der Technik der transthorakalen Feinnadelpunktion:
Dorca J, Manresa F, Esteban L, Barreiro B, Prats E, Ariza J, Verdaguer R, Gudiol F (1995) Efficacy, safety, and therapeutic relevance of transthoracic aspiration with ultrathin needle in nonventilated nosocomial pneumonia. Am J Respir Crit Care Med 151:1491–1496
Zwei Arbeiten, die die Technik der transthorakalen Feinnadelpunktion darlegen:
Zavala DC, Schoell JW (1989) Ultrathin needle aspiration of the lung in infectious and malignant disease. Am Rev Respir Dis 123:125–131
Manresa F, Dorca J (1999) Needle aspiration techniques in the diagnosis of pneumonia. Thorax 48:88–91
Zwei Übersichtsarbeiten zum Stand neuer diagnostischer Techniken:
Basnayake TL, Waterer GW (2015) Rapid diagnostic tests for defining the cause of community-acquired pneumonia. Curr Opin Infect Dis 28:185–192
Douglas IS (2016) New diagnostic methods for pneumonia in the ICU. Curr Opin Infect Dis 29:197–204
Zwei Originalien zur Evaluation der PCR/Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie, zum Teil in respiratorischen Materialien beatmeter bzw. intensivstationärer Patienten:
Huttner A, Emonet S, Harbarth S et al (2014) Polymerase-chain reaction/electrospray ionization-mass spectrometry for the detection of bacteria and fungi in bronchoalveolar lavage fluids: a prospective observational study. Clin Microbiol Infect 20:O1059–O1066
Vincent JL, Brealey D, Libert N et al (2015) Rapid diagnosis of infection in the critically ill, a multicenter study of molecular detection in bloodstream infections, pneumonia, and sterile site infections. Crit Care Med 43:2283–2291
Pilotstudie zur Übereinstimmung konventionell kultureller Methoden der Aufarbeitung der BALF und der automatisierten Mikroskopie. Die Autoren evaluieren hier zusätzlich einen präemptiven Ansatz der Therapie der VAP, der allerdings viele kritische Fragen aufwirft:
Douglas IS, Price CS, Overdier KH et al (2015) Rapid automated microscopy for microbiological surveillance of ventilator-associated pneumonia. Am J Respir Crit Care Med 191:566–573