Krankenhaushygienische Umgebungsuntersuchungen im Labor sind teilweise routinemäßig und zum anderen Teil nur in besonderen Situationen (z. B. Infektionsausbruch) erforderlich. Da hierfür neben den üblichen mikrobiologischen Methoden aber auch andere Untersuchungsgänge anfallen, soll hier eine Übersicht über diese speziellen Methoden mit praktischen Hinweisen für deren Durchführung gegeben werden.
Untersuchungen von Oberflächen
Abdruckverfahren (sog. Abklatschuntersuchungen) ermöglichen eine orientierende Aussage über den Grad der Kontamination von beispielsweise Arbeitsflächen, Geräten und anderen Gegenständen. Zur Untersuchung von Oberflächen werden sie am häufigsten angewendet. Es gibt dabei verschiedene Verfahren, die aber fast alle auf dem gleichen Prinzip basieren: Eine feste Nähragarfläche wird auf die zu untersuchende Oberfläche aufgedrückt, wobei ein repräsentativer Teil der Keime auf dem Kulturmedium haften bleibt. Eine andere Methode für die Oberflächenuntersuchung ist die Abschwemmmethode.
Abklatschmethoden
Die Nährböden sollen möglichst flexibel sein, damit auch nicht ganz plane Flächen untersucht werden können. Es werden nach Form und Zusammensetzung unterschiedlich vorgefertigte Nährböden zur
Probennahme angeboten.
Abschwemmmethode
Die Abschwemmmethode mit Wattetupfer oder Gummiwischer bzw. mit speziellen Abschwemm- oder Absaugschalen liefert stets eine höhere Keimzahl als die Abklatschmethode, da durch die intensive Bearbeitung der zu untersuchenden Oberfläche auch die in Unebenheiten haftenden Keime miterfasst werden. Nachteil ist die höhere Variabilität der Befunde.
Probenentnahme
Abklatschuntersuchungen
sollen möglichst nur bei glatten Oberflächen angewendet werden. Die Abklatschplatten werden bei der Untersuchung von Flächen von Hand auf den zu untersuchenden Gegenstand schräg aufgesetzt und mit einer Kraft von 2–5 N über 3 s angedrückt. Die Schale darf dabei nicht verschoben werden, weil sonst der
Agar beschädigt wird. Bei Abklatschuntersuchungen von Händen wählt man am besten die Innenseite des Mittel- und Endgliedes der 2.–4. Finger sowie die Handinnenfläche.
Für die routinemäßige Abklatschuntersuchung von Flächen eignet sich am besten Blutagar (Columbia-Agar mit Schafblut) beziehungsweise CASO-Agar mit Enthemmer (CASO+E). Für Flächen, die mit Desinfektionsmittel behandelt wurden, muss Nähragar mit Enthemmer (0,5 % Tween 80, 0,07 % Lecithin, 0,1 %
Histidin) verwendet werden (Tab.
1).
Tab. 1
Inaktivierungsmittel für einige antimikrobielle Wirkstoffe
Glutaraldehyd, Quecksilberverbindungen | Natriumhydrogensulfit (Natriumbisulfit) |
| Verdünnung |
Aldehyde | Glycin |
Quaternäre Ammoniumsalze, Parahydroxybenzoate (Parabene), Bis-biguanide | Lecithin |
Quaternäre Ammoniumsalze, Iod, Parabene | Polysorbat |
Quecksilberverbindungen | Thioglycolat |
Quecksilberverbindungen, Halogene, Aldehyde | Thiosulfat |
| Mg2+- oder Ca2+-Ionen |
Bei Suche nach besonderen Erregern sollten Spezialabklatschplatten
verwendet werden:
Abklatschkulturen werden 24–48 h bei 36±1 °C im Brutschrank inkubiert. Bei negativem Befund oder Suche nach den häufig langsamer wachsenden Pilzen erfolgt eine weitere Inkubation für mindestens 24 h bei 36±1 °C. Danach lässt man die Platten weitere 2–3 Tage bei Zimmertemperatur stehen, weil relevante Mikroorganismen als Optimum teilweise niedrigere Wachstumstemperaturen haben können. Die Abklatschplatten werden hinsichtlich der Keimzahl (quantitativ) und der unterschiedlichen angewachsenen Kolonien (qualitativ) untersucht. Eine genaue Differenzierung der Keime erfolgt nur in ausgewählten Situationen, wie zum Beispiel bei der Suche nach Kontaminationsquellen, nach laborüblichen Methoden. Bei speziellen Fragestellungen werden evtl. auch Typisierungen (z. B. Serotypisierungen oder molekularbiologische Methoden wie die Pulsed-field-Gelelektrophorese, „Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis“ oder DNA-Sequenz-basierten Typisierungsverfahren) durchgeführt.
Beurteilung
Die Angabe der Gesamtkeimzahl ist obligatorisch und kann entweder auf die Gesamtfläche der RODAC-Platte von ca. 21 cm
2 oder auf 16 cm
2 bezogen werden. Die 16 cm
2 sind auf dem Boden der Kunststoffträger als 4×4 kleine Quadrate markiert. Zur Befundung können die Bakterienkoloniezahlen auch folgendermaßen definiert werden:
-
+ + + +: massenhaft (=Rasenwachstum)
-
+ + + : reichlich (≥51 Kolonien)
-
+ +: mäßig (=16–50 Kolonien)
-
+: wenig (=6–15 Kolonien)
-
(+): vereinzelt (=1–5 Kolonien)
Meist erfolgt, je nach Fragestellung, neben einer quantitativen auch eine qualitative Beurteilung. Vor allem potenziell pathogene Keime (z. B. Enterobakteriazeen, Pseudomonaden und Staphylococcus aureus) sollten differenziert und in dem Befund mit angegeben werden. Nur auf besondere Anforderung hin ist die Differenzierung aller auf den Abklatschplatten gewachsenen Keime erforderlich.
Abstrichuntersuchungen
Tupferabstriche
müssen überall dort verwendet werden, wo man geformte Nährböden nicht einsetzen kann, zum Beispiel an Endoskopöffnungen oder an Ecken, Kanten und Fugen. Der Nachteil besteht darin, dass nur eine qualitative Aussage möglich ist. Die mit steriler physiologischer Kochsalzlösung oder Bouillon angefeuchteten sterilen Wattestäbchen werden in Bouillon (Trypton-Soja-Bouillon) gegeben oder auf einen Nähragar ausgestrichen. Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass andere Tupfermaterialien aus zellulärem Polyurethan-Schaum oder beflocktes Nylon die
Nachweisgrenzen verbessern können (Warnke et al.
2016). Falls die
Abstriche nicht innerhalb von 2–3 h verarbeitet werden können, müssen die Wattestäbchen in geeigneten Transportmedien (Transportagar, physiologische Kochsalzlösung oder Amies-Puffer) aufbewahrt werden. Wenn mit Desinfektionsmittelrückständen gerechnet werden muss, müssen der Bouillon oder den Agarplatten Enthemmer zugesetzt werden (Tab.
1).
Wasseruntersuchung aus Geräten
Die Wasserreservoire von
Beatmungsgeräten, Verneblern, O
2-Sprudlern oder Inkubatoren müssen kontaminationsfrei mit sterilem Aqua dest. befüllt werden. Routinemäßige Untersuchungen sind somit nicht sinnvoll. In speziellen epidemiologischen Situationen (v. a. Ausbruch) kann es jedoch erforderlich sein, Wasserproben aus solchen Geräten zu untersuchen.
Probenentnahme
Die
Probenmenge muss repräsentativ für die Gesamtflüssigkeitsmenge sein, zum Beispiel ca. 20 ml aus Verneblern oder 100 ml bei Inkubatoren. Die Proben werden unter aseptischen Kautelen (z. B. mit steriler Spritze) entnommen.
Methode
Die Proben werden in Anlehnung an die Trinkwasserverordnung untersucht, also sowohl ausgespatelt als auch filtriert. Die Membranfiltration mit dem Vakuumfiltrationsgerät (Abschn.
4.3) kann bei Probenvolumina von 5–20 ml durch ein anderes Filtrationsverfahren ersetzt werden. Bei diesen kleinen Filtratmengen kann man direkt an die Einwegspritzen Filtrationsvorsätze stecken (z. B. Swinnex-Scheibenfilterhalter, 25 mm Durchmesser, SXOO 02500, Fa. Millipore), die mit Filtermembranen GSWPO 2500 zu bestücken sind. Die Flüssigkeit wird mithilfe des Spritzenkolbens durch das
Filter gedrückt. Die Membran entnimmt man aseptisch dem aufschraubbaren Filterhalter und legt sie luftblasenfrei auf einen Nährboden (zur Auswahl der Nährmedien, der Inkubationsdauer und -temperatur Abschn.
7.2).
Beurteilung
Da die oben genannten Geräte teilweise nur desinfiziert und nicht sterilisiert werden, ist nicht immer Keimfreiheit zu erwarten. Die Proben müssen mindestens Trinkwasserqualität haben (Abschn.
7.4).
Untersuchung von sterilen Flüssigkeiten
Sterile Flüssigkeiten müssen beispielsweise bei der Endproduktkontrolle für Arzneimittel, Infusionslösungen oder Blutplasma untersucht werden. Die in der Routine üblichen mikrobiologischen Nachweismethoden erfassen aufgrund der Nährbodenwahl und der Inkubationszeit nur die üblichen schnell wachsenden
Bakterien. Langsam wachsende Keime, wie Mykobakterien, entziehen sich dem Nachweis. Sollen auch diese erfasst werden, müssen sich zusätzliche Prüfungsverfahren anschließen.
Probenentnahme
Eine Sterilitätsüberprüfung
muss bei jeder neuen Charge (Produktionseinheit) vorgenommen werden (Tab.
2) (Anonymous
2014a). Neben dem Europäischem Arzneibuch (European Pharmacopoeia – Ph. Eur.) sei hier auch auf einige weitere gesetzliche Reglungen hingewiesen, wie das Gesetz über den Verkehr mit Arzneimitteln (Arzneimittelgesetz – AMG), die Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung (AMWHV), die ADKA-Leitlinie „Aseptische Herstellung und Prüfung applikationsfertiger Parenteralia“ vom Bundesverband Deutscher Krankenhausapotheker e.V. (ADKA; früher Arbeitsgemeinschaft Deutscher Krankenhausapotheker e.V.) und die Verordnung über den Betrieb von Apotheken (Apothekenbetriebsordnung – ApBetrO) sowie die EU-Richtlinien zur sogenannten Guten Herstellungspraxis („good manufacturing practice“ – GMP).
Tab. 2
Empfohlene Mindestprobenzahl für die Prüfung auf Sterilität (nach Ph. Eur. 8)
Parenteralia
| ≤100 | 10 % der Behältnisse, jedoch mindestens 4 Behältnisse; stets die größere Anzahl |
>100, jedoch ≤500 | 10 Behältnisse |
>500 | 2 % der Behältnisse, jedoch höchstens 20 Behältnisse (bei großvolumigen Parenteralia 10 Behältnisse); stets die kleinere Anzahl |
Zubereitungen zur Anwendungen am Auge und anderen nicht zur Injektion bestimmte Zubereitungen | ≤200 | 5 % der Behältnisse, jedoch mindestens 2 Behältnisse; stets die größere Anzahl |
>200 | 10 Behältnisse |
Chirurgisches Nahtmaterial und Catgut-Nahtmaterial | | 2 % der Charge, jedoch mindestens 5 Packungen; stets die größere Anzahl, aber höchstens 20 Packungen |
Feste Stoffe als Bulkprodukte | ≤4 | Jedes Behältnis |
>4, jedoch ≤50 | 20 % der Behältnisse, jedoch mindestens 4 Behältnisse; stets die größere Anzahl |
>50 | 2 % der Behältnisse, jedoch mindestens 10 Behältnisse; stets die größere Anzahl |
Die Aufnahme einer Prüfung von Arzneimitteln
, muss nach Angaben des Bundesinstituts für Arzneimittel und
Medizinprodukte (BfArM) im Voraus der zuständigen Überwachungsbehörde (Regierungspräsidium) anzeigt werden (§ 67 AMG).
Methode
Bei der Sterilitätsprüfung ist das Arbeiten unter einer Sicherheitswerkbank Klasse II (mit Vertikalströmung) erforderlich, um eine Kontamination von außen auszuschließen. Von verschiedenen Aufsichtsbehörden werden unterschiedliche Auffassungen zum
Qualitätsmanagement und zu den räumlichen Umgebungsbedingungen gefordert. In Teilen wird wie von der pharmazeutischen Industrie auch von den Laboren ein GMP-konformes Vorgehen verlangt. Das bedeutet unter anderem, dass die Sicherheitswerkbank sich in einem Schleusensystem mit entsprechend qualifizierter Raumluft befinden muss oder alternativ die Prüfung in Sterilisolatoren stattfinden muss. Für Einzelheiten soll hier nur auf den Anhang 1 zum EG-Leitfaden der „Guten Herstellungspraxis 1“ verwiesen werden.
Je nach Flüssigkeitsmenge des Prüfproduktes kann zwischen der Membranfiltration (Abschn.
4.3) oder einer Direktbeschickungsmethode (Abschn.
5.2) gewählt werden.
Die
erforderliche Probenmenge für Parenteralia entspricht nach Ph. Eur. 8. der Füllmenge bei Flüssigkeiten (Tab.
3).
Flüssigkeiten | <1 ml | Gesamtinhalt eines Behältnisses |
1–40 ml | Die Hälfte des Inhalts, jedoch mindestens 1 ml |
>40 ml, aber ≤100 ml | 20 ml |
>100 ml | 10 % des Inhalts, jedoch mindestens 20 ml |
| 1 ml |
Unlösliche Zubereitungen, Cremes, Salben nach Suspension oder Emulsion | | Gesamtinhalt, jedoch mindestens 200 mg |
Feststoffe | <50 mg | Gesamtinhalt |
≥50 mg, aber <300 mg | Die Hälfte des Inhalts, jedoch mindestens 50 mg |
≥300 mg, aber ≤5 g | 150 mg |
>5 g | 500 mg |
Chirurgisches Nahtmaterial | | 3 Proben eines Fadens, jeweils 30 cm lang |
Membranfiltration
Verwendbar zur Sterilitätsprüfung
sind
Beurteilung
Sind bei Sterilprodukten
Bakterien nachweisbar, genügt das Produkt den Anforderungen nicht, es sei denn, dass die Prüfung aus nicht mit dem Produkt im Zusammenhang stehenden Gründen als ungültig angesehen wird (Anonymous
2014a). Dies können Negativkontrollen mit mikrobiellem Wachstum, der Nachweis von Fehlern der Sterilitätsprüfungsanlage im Rahmen des mikrobiellen Umgebungsmonitorings oder eine nach der Kontrolle der Verfahrensweise der betreffenden Prüfung offenkundig fehlerhafte Durchführung sein. Auch der Nachweis von Keimen, die nach der Identifizierung eindeutig Fehlern des bei der Durchführung der Sterilitätsprüfung verwendeten Materials und/oder der angewandten Technik zuzuschreiben sind, können Gründe für eine ungültige Prüfung sein. In diesen Fällen muss sich zur Befundbestätigung eine Wiederholungsprüfung anschließen. Ist bei dieser kein Keimwachstum vorhanden, so kann das Prüfobjekt als steril gelten. Findet sich dagegen bei der zweiten Untersuchung der gleiche Befund wie bei der ersten, so ist die Prüflösung als unsteril anzusehen. Werden bei der Wiederholungsuntersuchung andere Keime als bei der ersten Untersuchung isoliert, muss sich eine zweite Wiederholungsprüfung mit doppelter Probenzahl anschließen.
Bakteriologische Qualitätsprüfung von Therapeutika
Eine primäre bakterielle Verunreinigung von Therapeutika (Flüssigkeiten, Öle, Pulver, Cremes, Salben, feste Körper) kann durch unzureichende Konservierung oder Sterilisation der Präparate bedingt sein. Im klinischen Alltag spielen allerdings Sekundärkontaminationen eine größere Rolle.
Probenentnahme
Die Prüfobjekte werden unter aseptischen Bedingungen, zum Beispiel mit steriler Pipette, sterilem Spatel oder steriler Pinzette, direkt in das
Nährmedium eingebracht (Direktbeschickungsmethode). Die
Probenmenge richtet sich nach der Füllmenge im Probenbehälter. Nach Ph. Eur. 8 gelten die in Tab.
3 gelisteten Mindestprobenmengen.
Direktbeschickungsmethode
Das Verhältnis Prüfobjekt zu
Nährmedium sollte bei flüssigen Stoffen 1:10, bei festen Stoffen 1:100 betragen. Bei Verbandsstoffen, Nahtmaterial und ähnlichem muss das Nährmedium die Proben vollständig bedecken. In der Regel genügen 20–150 ml. Als Nährbouillon verwendet man zum Nachweis von aeroben
Bakterien Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon (CSB), zum Nachweis von Anaerobiern Thioglycolatbouillon. Besteht bei den Untersuchungsmaterialien der Verdacht auf antimikrobielle Wirksamkeit, müssen den Nährmedien geeignete Enthemmersubstanzen bzw. Inaktivierungsmittel zugesetzt werden. Da es nicht immer leicht zu ermitteln ist, welche Inaktivierungssubstanz für das Prüfobjekt erforderlich ist, und es auch labortechnisch zu aufwendig wäre, für die unterschiedlichen Untersuchungsmaterialien jeweils eine eigene Enthemmerbouillon vorrätig zu haben, kann man als „Universalenthemmerbouillon“ folgende Zusammensetzung wählen:
Tween 80
bewirkt neben der Inaktivierung von antimikrobiellen Substanzen bei Salben, Cremes und Ölen auch eine Emulgierung. Alternativ ist es auch möglich, vor dem Einbringen in das
Nährmedium die Cremes und Salben mit einem geeigneten Emulgator in gepufferter Natriumchloridlösung im Verhältnis 1:100 zu emulgieren. Die Bebrütung der Nährmedien erfolgt zum Nachweis von
Bakterien bei 30–35 °C, zum Nachweis von Pilzen bei 20–25 °C. Als Inkubationszeit sollten mindestens 7 Tage, bei Sterilitätsüberprüfungen mindestens 14 Tage eingehalten werden. Während der Bebrütungszeit ist tägliches Aufschütteln der Gefäße bzw. Röhrchen erforderlich. Bei Thioglycolatbouillon darf nur vorsichtig geschüttelt werden, um das anaerobe Milieu aufrechtzuerhalten. Am dritten und fünften Tag werden die Anreicherungsmedien auf Agarplatten ausgeimpft.
Bei Keimwachstum schließt man weitere Subkulturen und Differenzierungen über Selektivplatten sowie biochemische, DNA-Sequenzierungs- oder massenspektrometrische (MALDI-Biotyper) Verfahren zur Identifizierung an.
Wird eine semiquantitative bakteriologische Auswertung eines Prüfobjektes gewünscht, so wird nach Einbringen des Präparates in das Kulturmedium und ggf. nach 20-minütiger Einwirkung mit den Inaktivierungssubstanzen eine definierte Menge der Bouillon (z. B. 100 μl) auf einer Agarplatte ausgespatelt. Zusätzlich erfolgt eine weitere Bebrütung des Prüfobjektes im Kulturmedium zur qualitativen Beurteilung.
Beurteilung
Bei Produkten, die als steril deklariert werden (z. B. Parenteralia oder Augenpräparaten), darf kein Keimwachstum nachgewiesen werden (Anonymous
2014a). Sollte Bakterienwachstum auftreten, so schließen sich ein oder mehrere Kontrolluntersuchung an (Abschn.
4.5).
Präparate, die zur topischen oder lokalen Anwendung, z. B. auf der Haut, in Nase, Rachen oder Ohr, aufgetragen werden, müssen nicht steril sein (Anonymous
2014b). Eine Gesamtkeimzahl von 10
2 KBE an
Bakterien und 10
1 KBE an Pilzen pro 1 g bzw. pro 1 ml darf aber nicht überschritten werden. Enterobakteriazeen,
P. aeruginosa und
S. aureus dürfen nicht nachgewiesen werden. Das gleiche gilt für Zubereitungen zur Anwendung zur Inhalation mit Ausnahme von solchen, die steril sein müssen.
Für wässerige Zubereitungen zur oralen Anwendung gelten folgende Keimzahlen als Grenzwerte für vermehrungsfähige Keime pro g bzw. pro ml: 10
2 KBE bei aeroben
Bakterien und 10
1 KBE bei Pilzen.
E. coli darf nicht vorhanden sein (Anonymous
2014b). Für nicht wässerige Zubereitungen zur oralen Anwendung liegen die Grenzwerte um eine Größenordnung höher. Diese gelten auch für Darreichungsformen zur rektalen Anwendung.
Lassen sich natürliche Ausgangsstoffe solcher Zubereitungen nicht antimikrobiell vorbehandeln, gelten als Grenzwerte 10
4 KBE bei aeroben
Bakterien, 10
2 Enterobakteriazeen sowie 10
2 KBE bei Hefen und Schimmelpilzen. Dabei dürfen
E. coli,
Salmonellen und
S. aureus nicht vorhanden sein (Anonymous
2014b).
Präparate, die lediglich aus pflanzlichen Drogen bestehen, dürfen, wenn ihnen vor der Anwendung siedendes Wasser zugesetzt wird, höchstens 10
7 KBE aerobe
Bakterien, 10
2 E. coli bzw. 10
5 KBE Pilze pro 1 ml oder 1 g aufweisen. Solche Mittel, denen nicht vorher siedendes Wasser zugesetzt wird, dürfen höchstens 10
5 KBE aerobe Bakterien, 10
4 KBE Pilze und höchstens 10
2 Enterobakteriazeen, aber keine
E. coli oder
Salmonellen enthalten (Anonymous
2014b).
Untersuchung von entmineralisiertem Wasser für die Dialyse und Dialyseflüssigkeit
In Anlehnung an die entsprechenden Monographien des Europäischen Arzneibuchs wird hier zwischen „gereinigtem Wasser“ (Aqua purificata) und „hochgereinigtem Wasser“ (Aqua valde purificata) mit unterschiedlichen Grenzwerten für die Anwendung in verschiedenen Dialyseverfahren unterschieden.
Probenentnahme
Die Häufigkeit der Untersuchungen von entmineralisiertem Wasser (E-Wasser) für die
Dialyse und Dialyserflüssigkeit sowie die Abnahmestellen sind im Kap. Dialyse: Hygienische Maßnahmen beschrieben. Die Proben sollen innerhalb von 30 min verarbeitet werden. Ist dies nicht möglich, können die Proben im Kühlschrank bei 4–8 °C maximal 24 h aufbewahrt werden.
Beurteilung
Als maximal zulässige Keimzahl gilt für die E-Wasserprobe und Dialyseflüssigkeit entsprechend „gereinigtem Wasser“ 100 KBE/ml. Nach Ausspateln dürfen somit maximal 20 KBE pro Agarplatte im E-Wasser bzw. in der Dialyseflüssigkeit angewachsen sein. Coliforme
Bakterien oder
Pseudomonas aeruginosa sollten in 100 ml nicht nachweisbar sein (DGfN
2006). Bei speziellen neueren Dialyseverfahren (hocheffiziente Hämodiafiltration) werden wie beim „hochgereinigtem Wasser“ wesentlich höhere Anforderungen an die Wasserqualität der Dialyseflüssigkeit mit maximal 0,1 KBE/ml diskutiert (Anonymous
2002). Bei höheren Keimzahlen wird die Untersuchung wiederholt. Es ist sinnvoll, bei der Befundung zusätzlich den Vermerk „Probe entspricht den Qualitätsanforderungen“ anzugeben.
Untersuchung von Trinkwasser
Trinkwasser
muss so beschaffen sein, dass eine Schädigung der menschlichen Gesundheit ausgeschlossen ist. Auf die bakteriologische Wasserqualität bezogen heißt das: Jedes Trinkwasser muss frei sein von Krankheitserregern. Man beschränkt sich in der Regel auf den bakteriologischen Nachweis, da virologische Untersuchungen für die Routine zu aufwendig wären. Zusätzlich ist hier jährlich Wasser aus zentralen Warmwasseraufbereitungsanlagen systemisch auf
Legionellen zu untersuchen (Abschn.
8; Kap.
Legionellosen und andere durch Wasser übertragbare Infektionen: Risikofaktoren, Erreger und
Hygienemaßnahmen). Vom Gesundheitsamt angeordnete und gesetzlich geforderte Untersuchungen können nur von Trinkwasserlaboratorien durchgeführt werden, die entsprechend akkreditiert und von den Gesundheitsbehörden auf Landeslisten geführt sind. Aus krankenhaushygienischer Sicht können jedoch Untersuchungen in Risikobereichen oder bei vermuteten Ausbrüchen von durch Wasser übertragene Infektionen angezeigt sein, ohne dass diese von akkreditierten Probennehmern oder Untersuchungseinrichtungen durchgeführt werden müssen.
Probenentnahme
Nach Entfernen von Teilen der Wasserentnahmearmatur, die die mikrobiologische Beschaffenheit der Wasserprobe beeinflussen (z. B. Perlatoren), wird die Entnahmestelle abgeflammt und danach so lange gespült bis keine Nachwirkung des thermischen Verfahrens mehr anzunehmen ist. Man füllt 200–750 ml Wasser kontaminationsfrei in sterile gut verschließbare Glasgefäße. Zum Binden freien Chlors sind pro Liter mindestens 2 mg Natriumthiosulfat vorzulegen. Um Keimwachstum in den Wasserproben zu verhindern, werden die Proben nach Eingang im Kühlschrank bei 5±3 °C gelagert, wenn sie nicht innerhalb von 3 h bearbeitet werden. Die kulturelle Anlage soll innerhalb von 24 h erfolgen.
Spezielle Differenzierungen nach Trinkwasserverordnung
Einzelne Bakterienarten haben als mikrobiologischer Parameter in der Trinkwasserverordnung (TrinkwV) besondere Bedeutung, in der auf die entsprechenden Standardnormen zu ihrer Identifizierung verwiesen wird. Bei behördlich angeordneten Untersuchungen ist strikt danach vorzugehen. Diese sind unter anderem
E. coli, coliforme
Bakterien und
Enterokokken als Indikatoren fäkaler Verunreinigung sowie
P. aeruginosa.
Beurteilung
Als Beurteilungskriterien für die mikrobielle Sauberkeit des Wassers gelten die Koloniezahl und der Nachweis von
E. coli oder coliformen
Bakterien, d. h. die Gattungen
Escherichia,
Citrobacter,
Klebsiella,
Enterobacter.
Enterokokken,
E. coli und coliforme Bakterien dienen als Indikatorkeime für fäkale Verunreinigungen. In der normalen Dickdarmflora des Menschen ist
E. coli in einer Konzentration von 10
6–10
10 KBE pro g Stuhl vorhanden. Kleinste Spuren von fäkalen Verunreinigungen
im Wasser können so mithilfe von
E. coli und coliformen Keimen nachgewiesen werden. Hier besteht auch die Gefährdung der Verunreinigung durch pathogene Darmbakterien, wie beispielsweise
Salmonellen.
Laut Trinkwasserverordnung dürfen in 100 ml Trinkwasser weder
E. coli noch coliforme Keime oder
Enterokokken bei einer Bebrütungstemperatur von 22±2 °C und 36±1 °C enthalten sein.
Nach einer Empfehlung des Umweltbundesamtes darf in Krankenhäusern sowie anderen medizinischen Einrichtungen und Pflegeeinrichtungen P. aeruginosa in 100 ml Trinkwasser nicht nachweisbar sein.
Für Wasser, das zur Abfüllung in Flaschen oder sonstigen Behältnissen zum Zwecke der Abgabe bestimmt ist, gelten strengere Grenzwerte, da hier bei der Lagerung nach dem Abfüllen und vor dem Verbrauch einer Vermehrung von
Bakterien Rechnung zu tragen ist. Hier dürfen in 250 ml keine
E. coli oder coliforme Bakterien,
Enterokokken und keine
P. aeruginosa enthalten sein.
Folgende Grenzwerte gelten für die Koloniezahl pro ml Wasser:
Nachweis von Legionellen im Wasser
Der kulturelle Nachweis erfordert immer die Anlage der Wasserproben auf speziellen Legionellenmedien, die erst das Wachstum dieser
Bakterien ermöglichen: „Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE-)Agar“ oder als Selektivnährboden für Umweltproben BCYE zusätzlich mit Glycin,
Vancomycin, Polymyxin B und Cycloheximid (GVPC-Agar). Nach der Trinkwasserverordnung muss Wasser aus zentralen Erwärmungsanlagen in Einrichtungen mit Patienten, die ein höheres Risiko für Krankenhausinfektionen haben, jährlich auf
Legionellen untersucht werden. Dazu zählen neben Krankenhäusern auch Vorsorge- und Rehabilitationseinrichtungen, Einrichtungen für ambulantes Operieren, Dialyseeinrichtungen und Entbindungseinrichtungen.
Es werden orientierende, systemische Untersuchungen von weitergehenden Untersuchungen (z. B. bei überschrittenen technischen Maßnahmewerten) unterschieden, die beide nur von akkreditierten Laboratorien durchzuführen sind. Daneben können aber auch aus krankenhaushygienischer Sicht Untersuchungen zu Informationszwecken in Risikobereichen oder bei vermuteten Ausbrüchen angezeigt sein.
Probenentnahme
Mit der Probenentnahme ist eine Messung der Wassertemperatur durchzuführen. Bei gechlorten Proben werden 0,5 ml 10 % Natriumthiosulfat pro 1000 ml Probe in die sterile Flasche vorgelegt.
Während vor einer Probenentnahme zur systemischen Untersuchung einer Trinkwasserinstallation eine Desinfektion der Auslaufstellen und Spülung der Entnahmearmatur mit 1 bis max. 3 l Trinkwasser erfolgt, kann abhängig von der krankenhaushygienischen Fragestellung davon abgewichen werden. Zur Abklärung von Erkrankungsfällen im Zusammenhang mit Armaturen, wie beispielsweise einer Dusche, kann es sinnvoll sein, eine Probe ohne vorheriges Ablaufenlassen zu nehmen. Bei Hinweisen auf Erwärmung der Kaltwasserleitung sind auch an Kaltwasserentnahmestellen Proben zu entnehmen. Die Beprobung von Mischwasser ist möglichst zu vermeiden, indem ggf. die Eckventile der nicht zu untersuchenden Zuleitungen vor der Probenentnahme geschlossen werden. Gegebenenfalls sind auch Proben aus Leitungsteilen, die stagnierendes Wasser führen, zu nehmen.
Methode
Von der Wasserprobe werden zweimal je 0,5 ml mittels Direktausstrich auf GVPC-Agar untersucht und 100 ml mittels Vakuumfiltration auf Nylon- oder Polycarbonatfilter (0,22–0,45 μm Porengröße) filtriert. Dieses
Filter kann direkt auf GVPC-Agarplatten gelegt und bebrütet werden. Um die Nachweissensitivität zu steigern, beispielsweise in Wasserproben von Transplantationseinheiten oder nach Auftreten nosokomialer
Legionellosen, können größere (1 l) Volumina filtriert werden. Die Proben werden auf GVPC-Agar inkubiert.
Bei Wasser mit Belastung von Begleitflora muss die Probe durch eine Säurebehandlung dekontaminiert werden (Anonymous
2000). Dazu wird nach Filtration die Membran mit 10 ml Säurelösung (pH 2,2±0,2) überschichtet: Diese besteht aus 3,9 ml 0,2 M HCl und 25 ml 0,2 M KCl. Nach 5 min Einwirkzeit wird die Säurelösung abgesaugt und die Membran mit 10 ml Puffer (z. B. Ringerlösung 1:40) gespült.
Die Agarplatten werden bei 36±1 °C und erhöhter Luftfeuchtigkeit (5 % CO
2) über 10 Tage bebrütet und in Abständen von 2 Tagen auf ein Wachstum Legionellen-verdächtiger Kolonien hin beurteilt. Solche Kolonien werden in Replika auf BCYE-Agar und auf Blutagar übertragen und während 2 Tagen bei 36±1 °C bebrütet. Alle Kolonien, die auf BCYE-Agar, nicht aber auf Blutagar oder anderen Cystein-defizienten Medien wachsen, werden vorläufig als
Legionellen betrachtet. Die genaue
L. pneumophila-Spezies-Identität sollte durch einen serologischen Test (Immunfluoreszenz: MonoFluo Legionella pneumophila IFA Test Kit, Bio-Rad 32514) oder mittels
Massenspektrometrie bestätigt werden. Für die Identifizierung nahezu aller
Legionella spp. ist der PCR-Nachweis des „macrophage infectivity potentiator“-Gens (
mip) etabliert (Ratcliff et al.
1998), der über eine DNA-Sequenzierung auch die Identifizierung der selteneren Non-Pneumophila-Spezies ermöglicht.
Beurteilung
Zur Interpretation von Befunden gibt es hinsichtlich eines Infektionsrisikos keine einheitlichen, sachlich ausreichend begründbaren Grenzwerte. Dennoch wird in der Regel Bezug auf das Arbeitsblatt W 551 der Deutschen Vereinigung des Gas- und Wasserfaches (DVGW) zu „Trinkwassererwärmungs- und Leitungsanlagen; Technische Maßnahmen zur Verminderung des Legionellenwachstums“ und auf die Empfehlungen des Umweltbundesamtes genommen (Schaefer et al.
2011). Hier wird in Krankenhäusern zwischen Hochrisiko- und
Normalbereichen unterschieden. Danach liegt in Risikobereichen der Zielwert bei 0 KBE pro 100 ml und ab 1 KBE/100 ml sind unverzüglich Nutzungseinschränkungen oder endständige Filtration sowie weitergehende Untersuchungen einzuleiten. In Normalbereichen sowie anderen medizinischen und Pflegeeinrichtungen gilt ein Zielwert von <100 KBE pro 100 ml. Bei Konzentration darüber sind kurzfristige Kontrollen zu wiederholen und bei wiederholt bestätigten Befunden Sanierungsmaßnahmen erforderlich. Im Bereich mit besonders gefährdeten Patienten darf Legionellen-haltiges Wasser nicht für die Patientenpflege verwendet werden (Kap.
Legionellosen und andere durch Wasser übertragbare Infektionen: Risikofaktoren, Erreger und
Hygienemaßnahmen). Präventions- und Sanierungsmaßnahmen sind an anderer Stelle beschrieben (Kap.
Technische Hygiene).
Untersuchung von Badewasser aus Therapie- und Bewegungsbecken
Die wichtigsten Keime, die im Beckenwasser und dem Reinwasser vorkommen können, sind Enterobakteriazeen, Pseudomonaden,
Enterokokken,
Staphylokokken,
Legionellen, Mykobakterien und Hefen. Reinwasser
ist das aufbereitete Wasser nach Zugabe des Desinfektionsmittels.
Probenentnahme
Häufigkeit und Abnahmestellen von Becken- und Reinwasser sind in Kap. Physiotherapie: Hygienische Maßnahmen beschrieben. Zum Auffangen des Wassers werden sterile, gut verschließbare Gefäße verwendet.
Methode
Die bakteriologische Untersuchung wird, wie unter Abschn.
6.2 beschrieben, durchgeführt.
Beurteilung
Badewasser muss so beschaffen sein, dass von ihm keine Schädigung der menschlichen Gesundheit durch Krankheitserreger ausgeht. Dies gilt für Schwimm- oder Badebeckenwasser ebenso wie für Bewegungsbäder. Bei Reinwasser darf die Koloniezahl 20 KBE/ml bei 20±2 °C und bei 36±1 °C nicht überschreiten. Bei Badewasser liegt der Grenzwert für beide Inkubationstemperaturen bei 100 KBE/ml. In 100 ml dürfen kein
E. coli, keine coliformen Keime und kein
P. aeruginosa enthalten sein.
E. coli und coliforme Keime dienen als Indikatorkeime für fäkale Verunreinigung durch die Badenden,
P. aeruginosa ist Indikatorkeim für mangelnde Wartung der
Filter. Darüber hinaus dürfen in Beckenwasser keine
Legionellen pro 1 ml bei 36±1 °C nachweisbar sein.
Untersuchung von raumlufttechnischen (RLT-)Anlagen
Der Aufbau von RLT-Anlagen sowie die Messgeräte und -verfahren zur Luftkeimzahlbestimmung sind in Kap.
Technische Hygiene beschrieben.
Keimzahlbestimmung im Befeuchterwasser
Von der Gesamtmenge werden etwa 100 ml entnommen, davon je 100 μl zur Keimzählung auf die entsprechenden Platten gespatelt und bei 36±1 °C bzw. 20–25 °C inkubiert. Die Restflüssigkeit wird mittels Membranfiltration (
Filter je nach Volumengröße auswählen, Porengröße 0,45 μm, Durchmesser 25 mm oder 50 mm) untersucht. Die Filter werden unter aseptischen Bedingungen halbiert. Die eine Hälfte wird auf die CBA/CAB-Platte gelegt und 48–72 h bei 36±1 °C zum Nachweis aerober Keime inkubiert. Die andere Hälfte wird auf eine Sabouraud-Glucoseagarplatte gelegt und 3–5 Tage bei 20–25 °C zum Nachweis von Pilzen inkubiert. Wurde dem Wasser Desinfektionsmittel zugesetzt, muss die Anlage des Materials auf Agarplatten mit Enthemmer erfolgen (Abschn.
1.3).
Beurteilung
Der Richtwert ist 102 KBE pro ml Wasser und soll nicht mehrmalig überschritten werden. Bei Überschreitung muss eine Kontrolle der Frischwasserzufuhr sowie eine Reinigung und die Desinfektion der Anlage erfolgen.
Untersuchungen in der Küche
Probenentnahme
Als feste Nährmedien dienen RODAC-Columbia-Blutagarabklatschplatten, RODAC-Enthemmer-Agarabklatschplatten, Columbia-Blutagarplatten, Nissui/MacConkey-Agarplatten, Cetrimidagarplatten und Enthemmeragarplatten (Abschn.
1.3). Als flüssige Nährmedien werden Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon (CSB) oder Thioglycolatbouillon (ggf. mit Enthemmer) verwendet.
Methode
Bei den Abstrichuntersuchungen werden die Tupfer direkt auf Blut- oder Enthemmerplatten abgerollt und in der entsprechenden Bouillon angereichert (Anreicherung nur bei gezielter Suche nach bestimmten Erregern, z. B.
Salmonellen). Die Agarplatten werden 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert. Die Bouillon wird bis zu 5 Tage bei 36±1 °C inkubiert und bei
Trübung auf die entsprechende Agarplatte ausgeimpft und 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert und die gewachsenen Kolonien differenziert.
Bei der gezielten Probenentnahme, wobei es sich meist um Flüssigkeiten handelt, werden 100 μl Flüssigkeit auf die entsprechenden Agarplatten ausgespatelt und zur anschließenden Keimzählung 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert. Die Restflüssigkeit wird mit der Membranfitration (
Filter je nach Volumengröße auswählen, Porengröße 0,45 μm, Durchmesser 25 mm bzw. 50 mm) verarbeitet. Die Filter werden auf die entsprechende Platte gelegt und 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert.
Bei gezielter Suche nach bestimmten Erregern wird die Anreicherungsbouillon nach Bebrütung über Nacht auf Selektivmedien ausgestrichen und wieder bei 36±1 °C für 24–48 h inkubiert. Bei Suche nach Pilzen müssen die Nährmedien 3–5 Tage bei 20–25 °C inkubiert werden.
Beurteilung
Bedeutung und Interpretation mikrobiologischer Küchenuntersuchungen werden in Kap. Krankenhausküchen: Hygienische Maßnahmen diskutiert.
Untersuchungen in der Milchküche
Muttermilch
Bei Verdacht auf Mastitis wird Muttermilch nach Desinfektion der Brustwarzen in sterilen Behältern (getrennt für die rechte und linke Brust) aufgefangen und möglichst sofort bakteriologisch untersucht. Bringen gesunde Mütter für ihre (kranken) Kinder abgepumpte Milch von zu Hause in die Klinik, wird lediglich eine Probe aus der Gesamtmilchmenge untersucht (Kap. Neonatologie und Pädiatrie: Hygienische Maßnahmen).
Pulvernahrung
Untersucht werden Proben von in der Milchküche zubereiteter Nahrung aus industriell hergestellter Pulvernahrung. Die Untersuchung solcher Proben ist wie auch bei Muttermilch routinemäßig nicht erforderlich, ggf. aber bei Frühgeborenennahrung unter bestimmten Bedingungen sinnvoll (Kap. Neonatologie und Pädiatrie: Hygienische Maßnahmen).
Methode
Es werden jeweils 0,1 ml Milch auf Columbia-Blutagar ausgespatelt und bei 36±1 °C 18–24 h inkubiert. Auf MacConkey-Agarplatten werden 0,05 ml Milch ausgespatelt und ebenfalls bei 36±1 °C 18–24 h inkubiert. Anschließend erfolgt die Keimzählung und die laborübliche Differenzierung.
Beurteilung
Allgemein akzeptierte Grenzwerte für zulässige Keimzahlen in Muttermilch oder Pulvernahrung gibt es nicht (zur Interpretation der Befunde Kap. Neonatologie und Pädiatrie: Hygienische Maßnahmen). Ein pragmatischer Vorschlag lautet, dass Milch mit Nachweis von Enterobakteriazeen oder mit einer Keimzahl von >100.000/ml verworfen wird. Bei einer Keimzahl von unter 10.000 KBE/ml wird sie unbehandelt verfüttert. Bei Keimzahlen zwischen 10.000 und 100.000 KBE/ml wird sie pasteurisiert, wenn β-hämolysierende
Streptokokken oder
S. aureus nachgewiesen werden, nicht aber beim Nachweis von sonstigen Hautkeimen.
Überprüfung thermischer Desinfektionsverfahren in Reinigungs- und Desinfektionsautomaten
Die Überprüfung von Reinigungs- und Desinfektionsautomaten und Taktwaschanlagen für die Aufbereitung von Instrumenten und beispielsweise Beatmungsschläuchen sowie anderen Gegenständen (z. B. Sekretauffanggläser, Waschschüsseln) wird an kontaminierten Testobjekten (in der Regel Schrauben und Schläuche) durchgeführt (Kap.
Medizinprodukte: Sichere und umweltschonende Aufbereitung).
Testobjekte
Als Testobjekte werden Schrauben aus Edelstahl (z. B. DIN 84 M 6×20) und ca. 7 cm lange Schläuche (6 mm Lumen; Hersteller: W. Rüsch & CoKG, Waiblingen) verwendet (Empfehlung des ehemaligen BGA für die Prüfung von thermischen Desinfektionsverfahren in Reinigungsautomaten).
Kontamination der Testobjekte
Pro Maschine werden mindestens 5 Schrauben und, falls in der Maschine auch Schläuche aufbereitet werden, außerdem 5 Schläuche als Testobjekte verwendet, die mit
E. faecium ATCC 6057 (DSM-Nr.: 2146) in einer Keimzahl von 10
5–10
6 KBE pro Testobjekt kontaminiert werden. Dafür wird der Testkeim auf Blutagarplatten bei 36±1 °C 48 h inkubiert. Anschließend werden die Kolonien von 3–4 Agarplatten mit einem sterilen Tupfer abgenommen und in 6 ml Pferdeblut suspendiert. Mit dieser Suspension werden die Schrauben und Schläuche kontaminiert und in
Petrischalen 24 h über CaCl
2 getrocknet. Kontaminierte Prüfobjekte können bei −20 °C bis zum Gebrauch gelagert werden.
Prüfung der Testobjekte nach Desinfektion
Nach der Desinfektion werden Schrauben und Schläuche in Röhrchen mit TSB mit Enthemmer gegeben und 7 Tage bei 36±1 °C inkubiert. Bleibt die Bouillon nach dieser Zeit klar, ist kein Wachstum erfolgt, sodass man von einer Reduktion der Keimzahl um 5 Log
10-Stufen ausgehen kann, was die erforderliche Keimzahlreduktion für ein Desinfektionsverfahren ist (Kap.
Medizinprodukte: Sichere und umweltschonende Aufbereitung). Kommt es zu einer
Trübung der Bouillon, wird ein Ausstrich auf CASO-Agar mit Enthemmer angefertigt. Wächst nach Inkubation der Testkeim an, war das Desinfektionsverfahren nicht ausreichend wirksam.
Überprüfung thermischer Desinfektionsverfahren in Geschirrspülmaschinen
Mehrtankspülmaschinen müssen eine Desinfektionsleistung mit einer Keimreduktion um 5 Log-Stufen haben. Zur Prüfung wird ein vergleichsweise hitzeresistenter E.-faecium-Stamm (ATCC 6057) verwendet, mit dem Prüfkörper kontaminiert werden. Neben der aufwendigeren quantitativen Vorgehensweise nach DIN 10510 mit einer Kontamination mit 107–108 KBE je Prüfkörper kann die mindest-erforderliche Keimreduktion vereinfacht auch wie folgt überprüft werden.
Kontamination der Prüfkörper
Als Prüfkörper werden Metallplättchen (10×1 cm) verwendet, die mit
E. faecium ATCC 6057 als Bioindikator kontaminiert werden (Abschn.
13.1 für die Anzüchtung des Testkeims). Mit Kochsalz-Pepton-Lösung und mithilfe eines sterilen Spatels werden die Kolonien von der Agarplatte abgeschwemmt, in ein steriles Röhrchen gegeben und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in RAMS (0,6 % Rinderalbumin, 1,0 % Mucin, 3,0 % Maisstärke, wobei die Substanzen für die Herstellung einzeln in Aqua dest. konzentriert gelöst und sterilisiert werden) suspendiert. Pro Metallplättchen werden 0,1 ml des in RAMS suspendierten Testkeims aufgetragen. Dies entspricht einer Kontamination mit 10
5–10
6 KBE pro Metallplättchen (Abschn.
13.2 für die Kontrolle der Ausgangskeimzahl auf den Testobjekten).
Prüfung der Testobjekte nach dem Spülgang
Nach Beendigung des Spülzyklus werden die Metallplättchen in leere sterile Röhrchen gegeben und ca. 20 ml TSB mit Enthemmer zugegeben, sodass die Metallplättchen vollständig bedeckt sind. Die Röhrchen werden 2 Tage bei 36±1 °C inkubiert. Bleibt die Bouillon nach dieser Zeit klar, ist die für eine Desinfektion erforderliche Keimzahlreduktion erreicht (Abschn.
12.3, ebenso für das weitere Vorgehen bei
Trübung).
Überprüfung von Sterilisatoren
Dampfsterilisatoren werden mit Sporen von
Geobacillus stearothermophilus, Heißluftsterilisatoren mit Sporen von
Bacillus atrophaeus (früher
B. subtilis) überprüft. Die Sporenpäckchen werden nach Entnahme aus dem Sterilisator in TSB eingelegt und 7 Tage bei 55–60 °C (
G. stearothermophilus) bzw. 30–35 °C (
B. atrophaeus) inkubiert (Kap.
Medizinprodukte: Sichere und umweltschonende Aufbereitung). Bei
Trübung der Bouillon werden Subkulturen auf Blutagarplatten angelegt, um ein Wachstum der Testsporen zu bestätigen bzw. eine Kontamination auszuschließen.
Überprüfung von Endoskopen
Die
Abstriche von Ventilen und Eingängen werden in TSB mit Enthemmer gegeben, und die Kanäle werden mit 0,9 % NaCl durchgespült (Kap. Endoskopie: Hygienische Maßnahmen). Die Proben werden 5 Tage bei 36±1 °C inkubiert. Positive Proben werden auf Blutagarplatten ausgestrichen und die Kolonien differenziert.
Literatur
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