Praktische Krankenhaushygiene und Umweltschutz
Autoren
Daniel Jonas
Krankenhaushygienische Umgebungsuntersuchungen im Labor sind teilweise routinemäßig und zum anderen Teil nur in besonderen Situationen (z. B. Infektionsausbruch) erforderlich. Da hierfür neben den üblichen mikrobiologischen Methoden aber auch andere Untersuchungsgänge anfallen, soll hier eine Übersicht über diese speziellen Methoden mit praktischen Hinweisen für deren Durchführung gegeben werden.

Untersuchungen von Oberflächen

Abdruckverfahren (sog. Abklatschuntersuchungen) ermöglichen eine orientierende Aussage über den Grad der Kontamination von beispielsweise Arbeitsflächen, Geräten und anderen Gegenständen. Zur Untersuchung von Oberflächen werden sie am häufigsten angewendet. Es gibt dabei verschiedene Verfahren, die aber fast alle auf dem gleichen Prinzip basieren: Eine feste Nähragarfläche wird auf die zu untersuchende Oberfläche aufgedrückt, wobei ein repräsentativer Teil der Keime auf dem Kulturmedium haften bleibt. Eine andere Methode für die Oberflächenuntersuchung ist die Abschwemmmethode.

Abklatschmethoden

Die Nährböden sollen möglichst flexibel sein, damit auch nicht ganz plane Flächen untersucht werden können. Es werden nach Form und Zusammensetzung unterschiedlich vorgefertigte Nährböden zur Probennahme angeboten.
RODAC-Platten
Wegen der besseren Vergleichbarkeit haben sich RODAC-Platten („replicate organism detection and counting“) durchgesetzt. Sie haben einen Durchmesser von 55–65 mm, tragen auf der Unterseite ein Gitternetz, das die spätere Auswertung erleichtert, und fassen ca. 16 ml Agar, wobei durch die Konstruktion der Kunststoffschale der Nährboden den Schalenrand etwas überragt. Die Kontaktfläche beträgt ca. 21 cm2.
RODAC-Platten können unbefüllt als steriles Einmalgut bezogen und mit dem jeweilig benötigten Nährboden beschickt werden (RODAC-Platten, steril, unbefüllt, 65×15 mm; Hersteller: Becton Dickinson).
Indirekte Abklatschmethode
Bei dieser Methode wird die zu untersuchende Oberfläche, die ebenfalls nicht plan sein muss, mit einer sterilen Folie oder einem Klebestreifen (z. B. Tesafilm) beprobt, diese nach einigen Sekunden Kontaktzeit abgezogen und dann auf eine Agarplatte aufgebracht.

Abschwemmmethode

Die Abschwemmmethode mit Wattetupfer oder Gummiwischer bzw. mit speziellen Abschwemm- oder Absaugschalen liefert stets eine höhere Keimzahl als die Abklatschmethode, da durch die intensive Bearbeitung der zu untersuchenden Oberfläche auch die in Unebenheiten haftenden Keime miterfasst werden. Nachteil ist die höhere Variabilität der Befunde.

Probenentnahme

Abklatschuntersuchungen sollen möglichst nur bei glatten Oberflächen angewendet werden. Die Abklatschplatten werden bei der Untersuchung von Flächen von Hand auf den zu untersuchenden Gegenstand schräg aufgesetzt und mit einer Kraft von 2–5 N über 3 s angedrückt. Die Schale darf dabei nicht verschoben werden, weil sonst der Agar beschädigt wird. Bei Abklatschuntersuchungen von Händen wählt man am besten die Innenseite des Mittel- und Endgliedes der 2.–4. Finger sowie die Handinnenfläche.
Für die routinemäßige Abklatschuntersuchung von Flächen eignet sich am besten Blutagar (Columbia-Agar mit Schafblut) beziehungsweise CASO-Agar mit Enthemmer (CASO+E). Für Flächen, die mit Desinfektionsmittel behandelt wurden, muss Nähragar mit Enthemmer (0,5 % Tween 80, 0,07 % Lecithin, 0,1 % Histidin) verwendet werden (Tab. 1).
Tab. 1
Inaktivierungsmittel für einige antimikrobielle Wirkstoffe
Antimikrobieller Wirkstoff
Methode zum Neutralisieren
Glutaraldehyd, Quecksilberverbindungen
Natriumhydrogensulfit (Natriumbisulfit)
Phenole, Ethanol, Aldehyde, Sorbat
Verdünnung
Aldehyde
Glycin
Quaternäre Ammoniumsalze, Parahydroxybenzoate (Parabene), Bis-biguanide
Lecithin
Quaternäre Ammoniumsalze, Iod, Parabene
Polysorbat
Quecksilberverbindungen
Thioglycolat
Quecksilberverbindungen, Halogene, Aldehyde
Thiosulfat
EDTA
Mg2+- oder Ca2+-Ionen
Bei Suche nach besonderen Erregern sollten Spezialabklatschplatten verwendet werden:
  • Staphylokokken: Mannit-Agar
  • Enterokokken: Esculin-Azid-Agar
  • Pseudomonaden: Cetrimid-Agar
  • Enterobakteriazeen:
    • MacConkey-Agar
    • Endo-Agar
    • CLED-Agar
  • Schimmelpilze: Malzextrakt-Agar, DG 18-Agar
Abklatschkulturen werden 24–48 h bei 36±1 °C im Brutschrank inkubiert. Bei negativem Befund oder Suche nach den häufig langsamer wachsenden Pilzen erfolgt eine weitere Inkubation für mindestens 24 h bei 36±1 °C. Danach lässt man die Platten weitere 2–3 Tage bei Zimmertemperatur stehen, weil relevante Mikroorganismen als Optimum teilweise niedrigere Wachstumstemperaturen haben können. Die Abklatschplatten werden hinsichtlich der Keimzahl (quantitativ) und der unterschiedlichen angewachsenen Kolonien (qualitativ) untersucht. Eine genaue Differenzierung der Keime erfolgt nur in ausgewählten Situationen, wie zum Beispiel bei der Suche nach Kontaminationsquellen, nach laborüblichen Methoden. Bei speziellen Fragestellungen werden evtl. auch Typisierungen (z. B. Serotypisierungen oder molekularbiologische Methoden wie die Pulsed-field-Gelelektrophorese, „Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis“ oder DNA-Sequenz-basierten Typisierungsverfahren) durchgeführt.

Beurteilung

Die Angabe der Gesamtkeimzahl ist obligatorisch und kann entweder auf die Gesamtfläche der RODAC-Platte von ca. 21 cm2 oder auf 16 cm2 bezogen werden. Die 16 cm2 sind auf dem Boden der Kunststoffträger als 4×4 kleine Quadrate markiert. Zur Befundung können die Bakterienkoloniezahlen auch folgendermaßen definiert werden:
  • + + + +: massenhaft (=Rasenwachstum)
  • + + + : reichlich (≥51 Kolonien)
  • + +: mäßig (=16–50 Kolonien)
  • +: wenig (=6–15 Kolonien)
  • (+): vereinzelt (=1–5 Kolonien)
Meist erfolgt, je nach Fragestellung, neben einer quantitativen auch eine qualitative Beurteilung. Vor allem potenziell pathogene Keime (z. B. Enterobakteriazeen, Pseudomonaden und Staphylococcus aureus) sollten differenziert und in dem Befund mit angegeben werden. Nur auf besondere Anforderung hin ist die Differenzierung aller auf den Abklatschplatten gewachsenen Keime erforderlich.

Abstrichuntersuchungen

Tupferabstriche müssen überall dort verwendet werden, wo man geformte Nährböden nicht einsetzen kann, zum Beispiel an Endoskopöffnungen oder an Ecken, Kanten und Fugen. Der Nachteil besteht darin, dass nur eine qualitative Aussage möglich ist. Die mit steriler physiologischer Kochsalzlösung oder Bouillon angefeuchteten sterilen Wattestäbchen werden in Bouillon (Trypton-Soja-Bouillon) gegeben oder auf einen Nähragar ausgestrichen. Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass andere Tupfermaterialien aus zellulärem Polyurethan-Schaum oder beflocktes Nylon die Nachweisgrenzen verbessern können (Warnke et al. 2016). Falls die Abstriche nicht innerhalb von 2–3 h verarbeitet werden können, müssen die Wattestäbchen in geeigneten Transportmedien (Transportagar, physiologische Kochsalzlösung oder Amies-Puffer) aufbewahrt werden. Wenn mit Desinfektionsmittelrückständen gerechnet werden muss, müssen der Bouillon oder den Agarplatten Enthemmer zugesetzt werden (Tab. 1).

Wasseruntersuchung aus Geräten

Die Wasserreservoire von Beatmungsgeräten, Verneblern, O2-Sprudlern oder Inkubatoren müssen kontaminationsfrei mit sterilem Aqua dest. befüllt werden. Routinemäßige Untersuchungen sind somit nicht sinnvoll. In speziellen epidemiologischen Situationen (v. a. Ausbruch) kann es jedoch erforderlich sein, Wasserproben aus solchen Geräten zu untersuchen.

Probenentnahme

Die Probenmenge muss repräsentativ für die Gesamtflüssigkeitsmenge sein, zum Beispiel ca. 20 ml aus Verneblern oder 100 ml bei Inkubatoren. Die Proben werden unter aseptischen Kautelen (z. B. mit steriler Spritze) entnommen.

Methode

Die Proben werden in Anlehnung an die Trinkwasserverordnung untersucht, also sowohl ausgespatelt als auch filtriert. Die Membranfiltration mit dem Vakuumfiltrationsgerät (Abschn. 4.3) kann bei Probenvolumina von 5–20 ml durch ein anderes Filtrationsverfahren ersetzt werden. Bei diesen kleinen Filtratmengen kann man direkt an die Einwegspritzen Filtrationsvorsätze stecken (z. B. Swinnex-Scheibenfilterhalter, 25 mm Durchmesser, SXOO 02500, Fa. Millipore), die mit Filtermembranen GSWPO 2500 zu bestücken sind. Die Flüssigkeit wird mithilfe des Spritzenkolbens durch das Filter gedrückt. Die Membran entnimmt man aseptisch dem aufschraubbaren Filterhalter und legt sie luftblasenfrei auf einen Nährboden (zur Auswahl der Nährmedien, der Inkubationsdauer und -temperatur Abschn. 7.2).

Beurteilung

Da die oben genannten Geräte teilweise nur desinfiziert und nicht sterilisiert werden, ist nicht immer Keimfreiheit zu erwarten. Die Proben müssen mindestens Trinkwasserqualität haben (Abschn. 7.4).

Untersuchung von sterilen Flüssigkeiten

Sterile Flüssigkeiten müssen beispielsweise bei der Endproduktkontrolle für Arzneimittel, Infusionslösungen oder Blutplasma untersucht werden. Die in der Routine üblichen mikrobiologischen Nachweismethoden erfassen aufgrund der Nährbodenwahl und der Inkubationszeit nur die üblichen schnell wachsenden Bakterien. Langsam wachsende Keime, wie Mykobakterien, entziehen sich dem Nachweis. Sollen auch diese erfasst werden, müssen sich zusätzliche Prüfungsverfahren anschließen.

Probenentnahme

Eine Sterilitätsüberprüfung muss bei jeder neuen Charge (Produktionseinheit) vorgenommen werden (Tab. 2) (Anonymous 2014a). Neben dem Europäischem Arzneibuch (European Pharmacopoeia – Ph. Eur.) sei hier auch auf einige weitere gesetzliche Reglungen hingewiesen, wie das Gesetz über den Verkehr mit Arzneimitteln (Arzneimittelgesetz – AMG), die Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung (AMWHV), die ADKA-Leitlinie „Aseptische Herstellung und Prüfung applikationsfertiger Parenteralia“ vom Bundesverband Deutscher Krankenhausapotheker e.V. (ADKA; früher Arbeitsgemeinschaft Deutscher Krankenhausapotheker e.V.) und die Verordnung über den Betrieb von Apotheken (Apothekenbetriebsordnung – ApBetrO) sowie die EU-Richtlinien zur sogenannten Guten Herstellungspraxis („good manufacturing practice“ – GMP).
Tab. 2
Empfohlene Mindestprobenzahl für die Prüfung auf Sterilität (nach Ph. Eur. 8)
 
Anzahl der Behältnisse je Chargea
Mindestprobenzahl für die Prüfung auf Sterilitätb
Parenteralia
≤100
10 % der Behältnisse, jedoch mindestens 4 Behältnisse; stets die größere Anzahl
>100, jedoch ≤500
10 Behältnisse
>500
2 % der Behältnisse, jedoch höchstens 20 Behältnisse (bei großvolumigen Parenteralia 10 Behältnisse); stets die kleinere Anzahl
Zubereitungen zur Anwendungen am Auge und anderen nicht zur Injektion bestimmte Zubereitungen
≤200
5 % der Behältnisse, jedoch mindestens 2 Behältnisse; stets die größere Anzahl
>200
10 Behältnisse
Chirurgisches Nahtmaterial und Catgut-Nahtmaterial
 
2 % der Charge, jedoch mindestens 5 Packungen; stets die größere Anzahl, aber höchstens 20 Packungen
Feste Stoffe als Bulkprodukte
≤4
Jedes Behältnis
>4, jedoch ≤50
20 % der Behältnisse, jedoch mindestens 4 Behältnisse; stets die größere Anzahl
>50
2 % der Behältnisse, jedoch mindestens 10 Behältnisse; stets die größere Anzahl
aFalls die Chargengröße nicht bekannt ist, wird die maximale Anzahl Einheiten, die vorgeschrieben ist, verwendet
bFalls der Inhalt eines Behältnisses für die Inokulation beider Nährmedien (aerob/anaerob) ausreicht, gibt diese Spalte die benötigte Anzahl Behältnisse für beide Nährmedien gemeinsam an
Die Aufnahme einer Prüfung von Arzneimitteln, muss nach Angaben des Bundesinstituts für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) im Voraus der zuständigen Überwachungsbehörde (Regierungspräsidium) anzeigt werden (§ 67 AMG).

Methode

Bei der Sterilitätsprüfung ist das Arbeiten unter einer Sicherheitswerkbank Klasse II (mit Vertikalströmung) erforderlich, um eine Kontamination von außen auszuschließen. Von verschiedenen Aufsichtsbehörden werden unterschiedliche Auffassungen zum Qualitätsmanagement und zu den räumlichen Umgebungsbedingungen gefordert. In Teilen wird wie von der pharmazeutischen Industrie auch von den Laboren ein GMP-konformes Vorgehen verlangt. Das bedeutet unter anderem, dass die Sicherheitswerkbank sich in einem Schleusensystem mit entsprechend qualifizierter Raumluft befinden muss oder alternativ die Prüfung in Sterilisolatoren stattfinden muss. Für Einzelheiten soll hier nur auf den Anhang 1 zum EG-Leitfaden der „Guten Herstellungspraxis 1“ verwiesen werden.
Je nach Flüssigkeitsmenge des Prüfproduktes kann zwischen der Membranfiltration (Abschn. 4.3) oder einer Direktbeschickungsmethode (Abschn. 5.2) gewählt werden.
Die erforderliche Probenmenge für Parenteralia entspricht nach Ph. Eur. 8. der Füllmenge bei Flüssigkeiten (Tab. 3).
Tab. 3
Probenmengen für die Sterilitätsprüfung (nach Ph. Eur. 8)
Art der Zubereitung
Füllmenge
Mindestprobenmenge für jedes Nährmedium
Flüssigkeiten
<1 ml
Gesamtinhalt eines Behältnisses
1–40 ml
Die Hälfte des Inhalts, jedoch mindestens 1 ml
>40 ml, aber ≤100 ml
20 ml
>100 ml
10 % des Inhalts, jedoch mindestens 20 ml
Flüssige Zubereitungen mit Antibiotika
1 ml
Unlösliche Zubereitungen, Cremes, Salben nach Suspension oder Emulsion
 
Gesamtinhalt, jedoch mindestens 200 mg
Feststoffe
<50 mg
Gesamtinhalt
≥50 mg, aber <300 mg
Die Hälfte des Inhalts, jedoch mindestens 50 mg
≥300 mg, aber ≤5 g
150 mg
>5 g
500 mg
Chirurgisches Nahtmaterial
 
3 Proben eines Fadens, jeweils 30 cm lang

Membranfiltration

Verwendbar zur Sterilitätsprüfung sind
  • wiederverwendbare Vakuumfiltrationssysteme oder
  • geschlossene Einwegsysteme.
Wiederverwendbare Vakuumfiltrationsgeräte
Sie sollen beim Filtrieren steriler Flüssigkeiten mit einem Deckel mit Luftansaugfilter versehen sein (z. B. Schleicher & Schüll MV050/0/08). Als Filterscheiben (50 mm Durchmesser) mit einer maximalen Porengröße von 0,45 μm eignen sich für wässrige und ölige Lösungen Membranen aus Cellulosenitrat, für Lösungen mit hohem Ethanolgehalt solche aus Celluloseacetat. Zur Senkung der Viskosität von öligen Lösungen können diese vor dem Filtrieren mit einem geeigneten Mittel (z. B. mit Isopropylmyristat) verdünnt werden.
Nach Abschluss der Filtration des Prüfproduktes wird bei öligen Lösungen und, falls sonst erforderlich, das Filter mit 300 ml Membranfilterwaschbouillon (z. B. Merck, Artikel 5286) nachgespült, um antibakteriell wirksame Substanzen auszuwaschen. Das Membranfilter wird unter aseptischen Bedingungen aus dem Filterhalter entnommen, in 2 Teile zerschnitten und je eine Hälfte in Thioglycolatbouillon, die andere Hälfte in Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon (CSB) eingelegt. Die Inkubationsdauer soll 14 Tage betragen, die Inkubationstemperatur für CSB 20–25 °C, für Thioglycolatbouillon 30–35 °C.
Filtration mit geschlossenen Einwegfiltrationssystemen
Diese Einwegfiltrationsgeräte (z. B. von Sartorius oder Merck Millipore Steritest-Systeme) für wässerige Lösungen ohne antimikrobielle Aktivität (TZHASV210), für Lösungen mit antimikrobieller Aktivität (TZHVAB210) oder für visköse, ölige Produkte (TZHVSL210) sind in sich vollständig geschlossen. Über Schlauchleitungen wird die Probe mithilfe einer Schlauchpumpe gleichmäßig in 2 Filtrationskammern gepumpt. Hat die Prüfflüssigkeit vollständig die am Boden der Filtrationskammern integrierten Filtermembranen (0,45 μm Porengröße) passiert, werden die Kammern mit bis zu 300 ml Waschbouillon durchgespült und mit den Anreicherungsmedien (Thiogycolatbouillon und CSB) gefüllt. Die Bebrütung erfolgt in den Testsystemen für 14 Tage, bei 30–35 °C für Thioglycolatbouillon und 20–25 °C für CSB. Nur bei auftretender Trübung wird aus der Anreicherungsbouillon mit einer Einwegspritze am Schlauchabschnitt aseptisch eine Probe entnommen und auf 2 Blutagarplatten ausgeimpft. Die Bebrütung unter aeroben und anaeroben Bedingungen erfolgt für 48–72 h bei 36±1 °C. Ist eine Trübung durch das Prüfprodukt selbst bedingt, sodass ein mikrobielles Wachstum nach 14 Tagen visuell nicht beurteilt werden kann, werden geeignete Mengen des Nährmediums in frische Gefäße mit dem gleichen zubereiteten Nährmedium übertragen. Die Bebrütungszeit des ursprünglichen und des neu überimpften Gefäßes wird über insgesamt mindestens 14+7 Tage fortgesetzt, von Zeitpunkt der ursprünglichen Beimpfung gerechnet (Ph. Eur. 8).

Nährmedienkontrolle

Sterilität
Die gebrauchsfertigen Nährlösungen müssen vor Verwendung oder parallel zur Untersuchung auf Sterilität überprüft werden. Dazu müssen die Nährmedien 14 Tage bei 30–35 °C (für Bakterien) bzw. bei 20–25 °C (für Pilze) bebrütet werden. Ein mikrobielles Wachstum darf nicht nachweisbar sein.
Prüfung auf Eignung des Mediums für aerobe und anaerobe Bakterien sowie Pilze
Bei jeder neuen Nährbodencharge (abgepackte Trockennährböden) werden mit geringen Keimeinsaaten Wachstumskontrollen durchgeführt. Ein Nährmedium gilt dann als tauglich, wenn es das Wachstum von 10–100 lebensfähigen Mikroorganismen gewährleistet. Zur Überprüfung der Thioglycolatbouillon sind zur Kontamination folgende Spezies empfohlen (Ph. Eur. 7):
  • Staphylococcus aureus ATCC 6538 (CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518)
  • Clostridium sporogenes ATCC 19404 (CIP 79.3, NCTC 532, ATCC 11437)
  • Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118)
Die Überprüfung der Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon erfolgt pro Gefäß mittels 10–100 KBE folgender Spezies:
  • Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (IP 1431.83, IMI 149007)
  • Bacillus subtilis ATCC 6633 (CIP 52.62, NCIMB 8054)
  • Candida albicans ATCC 10231 (CIP 48.72, NCPF 3179)
Thioglycolatbouillon wird bei 30–35 °C, Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon bei 20–25 °C bebrütet. Die Inkubationsdauer beträgt 3 Tage bei den Ansätzen mit Bakterien, 5 Tage bei denen mit Pilzen. Es ist jeweils nur ein Testkeim jeder Spezies zur Nährmedienkontrolle zu verwenden. Eine einfache Bezugsquelle dieser Teststämme sind Einmalimpfösen mit gefriergetrockneten Keimen (Culti-Loops, Oxoid GmbH, Wesel).
Wachstumskontrolle in Anwesenheit des Prüfobjektes
Auch in Anwesenheit des Prüfobjektes (z. B. eines Membranfilters, Arzneimittels etc.) darf das Bakterienwachstum nach Kontamination mit den ≤100 lebensfähigen Keimen nicht geringer ausfallen als in Abwesenheit des Prüfobjektes. Diese Wachstumskontrolle sollte für jede Rezeptur einmalig durchgeführt werden.
Die Prüfung wird unter Anwendung des gleichen Verfahrens durchgeführt, das zur Sterilitätsüberprüfung des Prüfobjektes verwendet wird (Membranfiltration oder Direktbeschickung). Bei der Membranfiltermethode wird der letzten Portion der sterilen Verdünnungsflüssigkeit zum Spülen des Filters eine kleine Menge vermehrungsfähiger Mikroorganismen (≤100 KBE) zugesetzt.
Es gilt für die Kontamination der Nährmedien in Anwesenheit des Prüfobjektes dieselbe Auswahl an Testkeimen, Inkubationszeit und Bebrütungstemperatur wie bei der Nährmedienkontrolle (s. oben) in Abwesenheit des Prüfobjektes.

Beurteilung

Sind bei Sterilprodukten Bakterien nachweisbar, genügt das Produkt den Anforderungen nicht, es sei denn, dass die Prüfung aus nicht mit dem Produkt im Zusammenhang stehenden Gründen als ungültig angesehen wird (Anonymous 2014a). Dies können Negativkontrollen mit mikrobiellem Wachstum, der Nachweis von Fehlern der Sterilitätsprüfungsanlage im Rahmen des mikrobiellen Umgebungsmonitorings oder eine nach der Kontrolle der Verfahrensweise der betreffenden Prüfung offenkundig fehlerhafte Durchführung sein. Auch der Nachweis von Keimen, die nach der Identifizierung eindeutig Fehlern des bei der Durchführung der Sterilitätsprüfung verwendeten Materials und/oder der angewandten Technik zuzuschreiben sind, können Gründe für eine ungültige Prüfung sein. In diesen Fällen muss sich zur Befundbestätigung eine Wiederholungsprüfung anschließen. Ist bei dieser kein Keimwachstum vorhanden, so kann das Prüfobjekt als steril gelten. Findet sich dagegen bei der zweiten Untersuchung der gleiche Befund wie bei der ersten, so ist die Prüflösung als unsteril anzusehen. Werden bei der Wiederholungsuntersuchung andere Keime als bei der ersten Untersuchung isoliert, muss sich eine zweite Wiederholungsprüfung mit doppelter Probenzahl anschließen.

Bakteriologische Qualitätsprüfung von Therapeutika

Eine primäre bakterielle Verunreinigung von Therapeutika (Flüssigkeiten, Öle, Pulver, Cremes, Salben, feste Körper) kann durch unzureichende Konservierung oder Sterilisation der Präparate bedingt sein. Im klinischen Alltag spielen allerdings Sekundärkontaminationen eine größere Rolle.

Probenentnahme

Die Prüfobjekte werden unter aseptischen Bedingungen, zum Beispiel mit steriler Pipette, sterilem Spatel oder steriler Pinzette, direkt in das Nährmedium eingebracht (Direktbeschickungsmethode). Die Probenmenge richtet sich nach der Füllmenge im Probenbehälter. Nach Ph. Eur. 8 gelten die in Tab. 3 gelisteten Mindestprobenmengen.

Direktbeschickungsmethode

Das Verhältnis Prüfobjekt zu Nährmedium sollte bei flüssigen Stoffen 1:10, bei festen Stoffen 1:100 betragen. Bei Verbandsstoffen, Nahtmaterial und ähnlichem muss das Nährmedium die Proben vollständig bedecken. In der Regel genügen 20–150 ml. Als Nährbouillon verwendet man zum Nachweis von aeroben Bakterien Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon (CSB), zum Nachweis von Anaerobiern Thioglycolatbouillon. Besteht bei den Untersuchungsmaterialien der Verdacht auf antimikrobielle Wirksamkeit, müssen den Nährmedien geeignete Enthemmersubstanzen bzw. Inaktivierungsmittel zugesetzt werden. Da es nicht immer leicht zu ermitteln ist, welche Inaktivierungssubstanz für das Prüfobjekt erforderlich ist, und es auch labortechnisch zu aufwendig wäre, für die unterschiedlichen Untersuchungsmaterialien jeweils eine eigene Enthemmerbouillon vorrätig zu haben, kann man als „Universalenthemmerbouillon“ folgende Zusammensetzung wählen:
Universalenthemmerbouillon
CSB-Trockensubstanz mit Zugabe folgender Enthemmer in der Endkonzentration:
  • 3 % Tween 80 (=Polysorbat)
  • 0,1 % Histidin
  • 0,3 % Lecithin
  • 0,5 % Natriumthiosulfat
Die Bestandteile in Aqua dest. lösen und autoklavieren. Das Natriumthiosulfat aber erst nach Abkühlen auf ≤50 °C als sterile Lösung dazugeben.
Tween 80 bewirkt neben der Inaktivierung von antimikrobiellen Substanzen bei Salben, Cremes und Ölen auch eine Emulgierung. Alternativ ist es auch möglich, vor dem Einbringen in das Nährmedium die Cremes und Salben mit einem geeigneten Emulgator in gepufferter Natriumchloridlösung im Verhältnis 1:100 zu emulgieren. Die Bebrütung der Nährmedien erfolgt zum Nachweis von Bakterien bei 30–35 °C, zum Nachweis von Pilzen bei 20–25 °C. Als Inkubationszeit sollten mindestens 7 Tage, bei Sterilitätsüberprüfungen mindestens 14 Tage eingehalten werden. Während der Bebrütungszeit ist tägliches Aufschütteln der Gefäße bzw. Röhrchen erforderlich. Bei Thioglycolatbouillon darf nur vorsichtig geschüttelt werden, um das anaerobe Milieu aufrechtzuerhalten. Am dritten und fünften Tag werden die Anreicherungsmedien auf Agarplatten ausgeimpft.
Bei Keimwachstum schließt man weitere Subkulturen und Differenzierungen über Selektivplatten sowie biochemische, DNA-Sequenzierungs- oder massenspektrometrische (MALDI-Biotyper) Verfahren zur Identifizierung an.
Wird eine semiquantitative bakteriologische Auswertung eines Prüfobjektes gewünscht, so wird nach Einbringen des Präparates in das Kulturmedium und ggf. nach 20-minütiger Einwirkung mit den Inaktivierungssubstanzen eine definierte Menge der Bouillon (z. B. 100 μl) auf einer Agarplatte ausgespatelt. Zusätzlich erfolgt eine weitere Bebrütung des Prüfobjektes im Kulturmedium zur qualitativen Beurteilung.

Beurteilung

Bei Produkten, die als steril deklariert werden (z. B. Parenteralia oder Augenpräparaten), darf kein Keimwachstum nachgewiesen werden (Anonymous 2014a). Sollte Bakterienwachstum auftreten, so schließen sich ein oder mehrere Kontrolluntersuchung an (Abschn. 4.5).
Präparate, die zur topischen oder lokalen Anwendung, z. B. auf der Haut, in Nase, Rachen oder Ohr, aufgetragen werden, müssen nicht steril sein (Anonymous 2014b). Eine Gesamtkeimzahl von 102 KBE an Bakterien und 101 KBE an Pilzen pro 1 g bzw. pro 1 ml darf aber nicht überschritten werden. Enterobakteriazeen, P. aeruginosa und S. aureus dürfen nicht nachgewiesen werden. Das gleiche gilt für Zubereitungen zur Anwendung zur Inhalation mit Ausnahme von solchen, die steril sein müssen.
Für wässerige Zubereitungen zur oralen Anwendung gelten folgende Keimzahlen als Grenzwerte für vermehrungsfähige Keime pro g bzw. pro ml: 102 KBE bei aeroben Bakterien und 101 KBE bei Pilzen. E. coli darf nicht vorhanden sein (Anonymous 2014b). Für nicht wässerige Zubereitungen zur oralen Anwendung liegen die Grenzwerte um eine Größenordnung höher. Diese gelten auch für Darreichungsformen zur rektalen Anwendung.
Lassen sich natürliche Ausgangsstoffe solcher Zubereitungen nicht antimikrobiell vorbehandeln, gelten als Grenzwerte 104 KBE bei aeroben Bakterien, 102 Enterobakteriazeen sowie 102 KBE bei Hefen und Schimmelpilzen. Dabei dürfen E. coli, Salmonellen und S. aureus nicht vorhanden sein (Anonymous 2014b).
Präparate, die lediglich aus pflanzlichen Drogen bestehen, dürfen, wenn ihnen vor der Anwendung siedendes Wasser zugesetzt wird, höchstens 107 KBE aerobe Bakterien, 102 E. coli bzw. 105 KBE Pilze pro 1 ml oder 1 g aufweisen. Solche Mittel, denen nicht vorher siedendes Wasser zugesetzt wird, dürfen höchstens 105 KBE aerobe Bakterien, 104 KBE Pilze und höchstens 102 Enterobakteriazeen, aber keine E. coli oder Salmonellen enthalten (Anonymous 2014b).

Untersuchung von entmineralisiertem Wasser für die Dialyse und Dialyseflüssigkeit

In Anlehnung an die entsprechenden Monographien des Europäischen Arzneibuchs wird hier zwischen „gereinigtem Wasser“ (Aqua purificata) und „hochgereinigtem Wasser“ (Aqua valde purificata) mit unterschiedlichen Grenzwerten für die Anwendung in verschiedenen Dialyseverfahren unterschieden.

Probenentnahme

Die Häufigkeit der Untersuchungen von entmineralisiertem Wasser (E-Wasser) für die Dialyse und Dialyserflüssigkeit sowie die Abnahmestellen sind im Kap. Dialyse: Hygienische Maßnahmen beschrieben. Die Proben sollen innerhalb von 30 min verarbeitet werden. Ist dies nicht möglich, können die Proben im Kühlschrank bei 4–8 °C maximal 24 h aufbewahrt werden.

Methode

Quantitative Untersuchung
Routinemäßig ist nur eine quantitative Untersuchung mit Spatel- oder Membranfiltrationstechnik unter Verwendung von Trypton-Glukose-Extrakt-Agar (R2A-Agar) notwendig. Üblicherweise werden 0,2 ml Flüssigkeit ausgespatelt und mindestens 30 ml bis maximal 100 ml filtriert. Das Filter mit einer nominalen Porengröße von höchstens 0,45 μm wird auf eine R2A-Agarplatte gelegt. Die Bebrütung erfolgt für 7 Tage bei 22±2 °C (DGHM 2005).

Beurteilung

Als maximal zulässige Keimzahl gilt für die E-Wasserprobe und Dialyseflüssigkeit entsprechend „gereinigtem Wasser“ 100 KBE/ml. Nach Ausspateln dürfen somit maximal 20 KBE pro Agarplatte im E-Wasser bzw. in der Dialyseflüssigkeit angewachsen sein. Coliforme Bakterien oder Pseudomonas aeruginosa sollten in 100 ml nicht nachweisbar sein (DGfN 2006). Bei speziellen neueren Dialyseverfahren (hocheffiziente Hämodiafiltration) werden wie beim „hochgereinigtem Wasser“ wesentlich höhere Anforderungen an die Wasserqualität der Dialyseflüssigkeit mit maximal 0,1 KBE/ml diskutiert (Anonymous 2002). Bei höheren Keimzahlen wird die Untersuchung wiederholt. Es ist sinnvoll, bei der Befundung zusätzlich den Vermerk „Probe entspricht den Qualitätsanforderungen“ anzugeben.

Untersuchung von Trinkwasser

Trinkwasser muss so beschaffen sein, dass eine Schädigung der menschlichen Gesundheit ausgeschlossen ist. Auf die bakteriologische Wasserqualität bezogen heißt das: Jedes Trinkwasser muss frei sein von Krankheitserregern. Man beschränkt sich in der Regel auf den bakteriologischen Nachweis, da virologische Untersuchungen für die Routine zu aufwendig wären. Zusätzlich ist hier jährlich Wasser aus zentralen Warmwasseraufbereitungsanlagen systemisch auf Legionellen zu untersuchen (Abschn. 8; Kap. Legionellosen und andere durch Wasser übertragbare Infektionen: Risikofaktoren, Erreger und Hygienemaßnahmen). Vom Gesundheitsamt angeordnete und gesetzlich geforderte Untersuchungen können nur von Trinkwasserlaboratorien durchgeführt werden, die entsprechend akkreditiert und von den Gesundheitsbehörden auf Landeslisten geführt sind. Aus krankenhaushygienischer Sicht können jedoch Untersuchungen in Risikobereichen oder bei vermuteten Ausbrüchen von durch Wasser übertragene Infektionen angezeigt sein, ohne dass diese von akkreditierten Probennehmern oder Untersuchungseinrichtungen durchgeführt werden müssen.

Probenentnahme

Nach Entfernen von Teilen der Wasserentnahmearmatur, die die mikrobiologische Beschaffenheit der Wasserprobe beeinflussen (z. B. Perlatoren), wird die Entnahmestelle abgeflammt und danach so lange gespült bis keine Nachwirkung des thermischen Verfahrens mehr anzunehmen ist. Man füllt 200–750 ml Wasser kontaminationsfrei in sterile gut verschließbare Glasgefäße. Zum Binden freien Chlors sind pro Liter mindestens 2 mg Natriumthiosulfat vorzulegen. Um Keimwachstum in den Wasserproben zu verhindern, werden die Proben nach Eingang im Kühlschrank bei 5±3 °C gelagert, wenn sie nicht innerhalb von 3 h bearbeitet werden. Die kulturelle Anlage soll innerhalb von 24 h erfolgen.

Quantitative Bestimmung

Bestimmung der Koloniezahl mittels Plattengussverfahren (EN ISO 6222:1999)
Hierzu wird Hefeextraktagar in Reagenzgläsern vor Gebrauch geschmolzen, abgekühlt und bei 45±1 °C im Wasserbad aufbewahrt. Für Verdünnungen wird Peptonwasser verwendet. In Petrischalen werden nicht mehr als 2 ml Probe pipettiert und der flüssige Agar (15–20 ml) zugegeben. Dies wird durch leichte Drehbewegung vorsichtig gemischt. Nach Verfestigung des Agars wird ein Ansatz bei 36±2 °C für 44±4 h und ein weiterer Ansatz bei 22±2 °C für 68±4 h inkubiert. Anschließend werden die Kolonien ausgezählt und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten je 1 ml Probe berechnet. Bei mehr als 300 Kolonien auf den Platten, die mit der höchsten Verdünnungsstufen beimpft wurden, werden die Ergebnisse als >300 angeben. Sind keine Kolonien auf den Platten gewachsen, wird das Ergebnis als „nicht nachgewiesen in 1 ml“ angeben.
Spatelmethode (semiquantitativ und qualitativ)
Nach gutem Durchmischen wird 0,1 ml der Wasserprobe mithilfe eines Drigalski-Glasspatels auf der Oberfläche einer Agarplatte gleichmäßig verteilt. Der Spatelvorgang soll erst beendet werden, wenn die Flüssigkeit vollständig vom Agar aufgenommen worden ist, damit nicht zu viele Keime am Spatel zurückbleiben. Als Nährmedien verwendet man Blutagar oder DST-Agar, jeweils 2 Platten, evtl. MacConkey-Agar. Die Inkubationszeit beträgt für einen Ansatz 48 h bei 36±1 °C und für einen Ansatz 72 h bei 22±2 °C. Gegebenenfalls werden weitere Nährböden zur anschließenden Differenzierung verwendet, z. B. Endoagar speziell für E. coli (Inkubationszeit 24–48 h bei 43 °C). Die untere Nachweisgrenze bei 0,1 ml-Proben liegt bei 10 KBE/ml.
Spiralplattenmethode (semiquantitativ und qualitativ)
Eine definierte Flüssigkeitsmenge (37 μl oder 92 μl) wird mit einem Präzisionsdispenser spiralförmig vom Zentrum zum Rand einer Agarplatte verteilt. Bei gleicher Flüssigkeitsabgabe entsteht eine unterschiedliche Flüssigkeits- und damit Keimverteilung auf der Agarplatte, wodurch ein Verdünnungseffekt von bis zu 1:10.000 erzielt wird. Die untere Nachweisgrenze beim Spiralplater beträgt 10 KBE/ml, die obere Nachweisgrenze 105 KBE/ml. Ausgezählt werden bestimmte Areale einer Agarplatte, die mit einem Faktor multipliziert die Keimzahl pro ml ergeben (Spiralplater Meintrup DWS Laborgeräte, Lähden-Holte).
Membranfiltration (quantitativ und qualitativ)
Mittels Unterdruck (z. B. Fa. Schleicher & Schüll, Vakuumfiltrationsgerät MV 050/0) werden 100 ml der gut durchmischten Wasserprobe durch eine Zellulosemembranfilterscheibe gesaugt (Porengröße des Filters 0,2–0,45 μm, Durchmesser 50 mm). Unter sterilen Bedingungen wird die Zellulosemembran (z. B. Schleicher & Schüll, Membranfilter ME 24/41 st oder ME 25/41 st) luftblasenfrei auf den Nährboden aufgelegt. Die Nährstoffe diffundieren durch die Membran, sodass die auf dem Filter festgehaltenen Keime zu Kolonien wachsen können. Eventuell kann die Filtermembran mit steriler Schere in 2 Teile zerschnitten werden und jeweils ein Teil auf Blutagar und der zweite Teil auf MacConkey-Agar bzw. Endoagar gelegt werden. Die Bebrütung erfolgt bei 36 °C für 48 h.

Spezielle Differenzierungen nach Trinkwasserverordnung

Einzelne Bakterienarten haben als mikrobiologischer Parameter in der Trinkwasserverordnung (TrinkwV) besondere Bedeutung, in der auf die entsprechenden Standardnormen zu ihrer Identifizierung verwiesen wird. Bei behördlich angeordneten Untersuchungen ist strikt danach vorzugehen. Diese sind unter anderem E. coli, coliforme Bakterien und Enterokokken als Indikatoren fäkaler Verunreinigung sowie P. aeruginosa.
Nachweis und Zählung von Escherichia coli und coliforme Bakterien (EN ISO 9308-1:2014)
Der Standardtest basiert auf Membranfiltration, einer anschließenden Subkultur auf einem Selektivagar und der Berechnung der Anzahl der gesuchten Organismen in der Probe.
100 ml Wasser (250 ml für in Flaschen abgefülltes Wasser) filtrieren. Das Filter aus Zelluloseestern (50 mm Durchmesser und Porengröße 0,45 μm) wird auf Laktose-TTC-Tergitol-Agar (mit Natriumheptadecylsulfat) gelegt und bei 36±2 °C für 21±3 h (evtl. Verlängerung bis 48 h) inkubiert. Typische Kolonien, die im Medium eine gelbe Farbentwicklung zeigen, als Laktose-positive Bakterien zählen. Das neuere Verfahren mit dem Chromogenic-Coliform-(CC-)Agar beruht auf dem schnelleren Nachweis von β-Glukuronidase (E. coli mit blauen Kolonien) und β-Galaktosidase (coliforme Bakterien mit violetten Kolonien) mit anschließendem Oxidasetest.
Von repräsentativen Kolonien coliformer Bakterien und E.-coli-Subkulturen auf nicht selektivem Agar für die Bestätigungstests (Oxidase- und Indolbildung) anlegen.
Der Schnelltest erlaubt den Nachweis und die Zählung von E. coli innerhalb von 24 h. Nach Filtration (s. oben) der Probe wird der Filter auf TSA-Medium (Trypton-Soja-Agar) gelegt und bei 36±2 °C 4–5 h inkubiert und anschließend auf ein gallensalzhaltiges TBA-Medium gelegt und weitere 19–20 h bei 44±0,5 °C inkubiert. Die Membran wird auf ein mit Indolreagenz getränktes Filterpapier gelegt und abhängig von der Farbentwicklung für 10–30 min mit einer ultravioletten Lampe bestrahlt. Alle roten Kolonien werden als E. coli gezählt.
Zur Identifizierung von E. coli verlangt die Trinkwasserverordnung den Nachweis von Säure- und Gasbildung aus Laktose bei 36 °C, eine negative Oxidasereaktion, eine positive Indolbildung, die Glukose- (oder Mannit-)Spaltung bei 44 °C zu Säure und Gas sowie eine negative Citratverwertung. Als coliformer Keim gilt ein gramnegatives sporenloses Stäbchen mit Säure- und Gasbildung aus Laktose bei 36 °C, negativer Oxidasereaktion, negativer (oder positiver) Indolbildung und positiver (oder negativer) Citratverwertung. Ausschlaggebendes Unterscheidungskriterium zwischen E. coli und Coliformen ist demnach die Zuckerspaltung bei 44 °C.
Nachweis und Zählung von Enterokokken (EN ISO 7899-2:2000)
Die TrinkwV 2001 fordert eine Mengenangabe. Anstelle der bisherigen Untersuchung auf „Fäkalstreptokokken“ wird jetzt gezielt auf Enterokokken untersucht. Es werden 100 ml Wasser (250 ml für in Flaschen abgefülltes Wasser) filtriert. Das Filter aus Zelluloseestern (50 mm Durchmesser und Porengröße 0,45 μm) wird auf einen Slanetz-Bartley-Agar gelegt und bei 36±2 °C für 44±4 h inkubiert. Erhabene Kolonien, die eine rote, kastanienbraune oder rosafarbene Färbung entweder im Zentrum oder in der gesamten Kolonie aufweisen, müssen bestätigt werden. Dazu wird die Membran mit steriler Pinzette auf eine Enterokokken-Agarplatte (Galle-Äsculin-Azid-Agar), die auf 44 °C vorgewärmt wurde, überführt, ohne den Filter umzudrehen. Die Bebrütung erfolgt 2 h bei 44±0,5 °C. Alle Kolonien, die gelbbraune bis schwarze Färbung aufweisen, werden als Enterokokken gezählt.
Nachweis von Pseudomonas aeruginosa DIN EN ISO 16266:2008
Die Untersuchung auf P. aeruginosa wird bei Wasser gefordert, das in Flaschen oder sonstige Behältnisse abgefüllt wird. 250 ml Wasser werden filtriert, das Filter auf einen cetrimidhaltigen Agar gelegt und bei 36±2 °C für 40±4 h inkubiert. P. aeruginosa wächst mit typischer Farbstoffbildung bzw. Fluoreszenz.

Beurteilung

Als Beurteilungskriterien für die mikrobielle Sauberkeit des Wassers gelten die Koloniezahl und der Nachweis von E. coli oder coliformen Bakterien, d. h. die Gattungen Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Enterokokken, E. coli und coliforme Bakterien dienen als Indikatorkeime für fäkale Verunreinigungen. In der normalen Dickdarmflora des Menschen ist E. coli in einer Konzentration von 106–1010 KBE pro g Stuhl vorhanden. Kleinste Spuren von fäkalen Verunreinigungen im Wasser können so mithilfe von E. coli und coliformen Keimen nachgewiesen werden. Hier besteht auch die Gefährdung der Verunreinigung durch pathogene Darmbakterien, wie beispielsweise Salmonellen.
Laut Trinkwasserverordnung dürfen in 100 ml Trinkwasser weder E. coli noch coliforme Keime oder Enterokokken bei einer Bebrütungstemperatur von 22±2 °C und 36±1 °C enthalten sein.
Nach einer Empfehlung des Umweltbundesamtes darf in Krankenhäusern sowie anderen medizinischen Einrichtungen und Pflegeeinrichtungen P. aeruginosa in 100 ml Trinkwasser nicht nachweisbar sein.
Für Wasser, das zur Abfüllung in Flaschen oder sonstigen Behältnissen zum Zwecke der Abgabe bestimmt ist, gelten strengere Grenzwerte, da hier bei der Lagerung nach dem Abfüllen und vor dem Verbrauch einer Vermehrung von Bakterien Rechnung zu tragen ist. Hier dürfen in 250 ml keine E. coli oder coliforme Bakterien, Enterokokken und keine P. aeruginosa enthalten sein.
Folgende Grenzwerte gelten für die Koloniezahl pro ml Wasser:
  • Trinkwasser: 100 KBE/ml bei 22±2 °C und 100 KBE/ml bei 36±1 °C
  • Wasser zur Abfüllung in Flaschen oder sonstige Behältnisse: 100 KBE/ml bei 22±2 °C und 20 KBE/ml bei 36±1 °C

Nachweis von Legionellen im Wasser

Der kulturelle Nachweis erfordert immer die Anlage der Wasserproben auf speziellen Legionellenmedien, die erst das Wachstum dieser Bakterien ermöglichen: „Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE-)Agar“ oder als Selektivnährboden für Umweltproben BCYE zusätzlich mit Glycin, Vancomycin, Polymyxin B und Cycloheximid (GVPC-Agar). Nach der Trinkwasserverordnung muss Wasser aus zentralen Erwärmungsanlagen in Einrichtungen mit Patienten, die ein höheres Risiko für Krankenhausinfektionen haben, jährlich auf Legionellen untersucht werden. Dazu zählen neben Krankenhäusern auch Vorsorge- und Rehabilitationseinrichtungen, Einrichtungen für ambulantes Operieren, Dialyseeinrichtungen und Entbindungseinrichtungen.
Es werden orientierende, systemische Untersuchungen von weitergehenden Untersuchungen (z. B. bei überschrittenen technischen Maßnahmewerten) unterschieden, die beide nur von akkreditierten Laboratorien durchzuführen sind. Daneben können aber auch aus krankenhaushygienischer Sicht Untersuchungen zu Informationszwecken in Risikobereichen oder bei vermuteten Ausbrüchen angezeigt sein.

Probenentnahme

Mit der Probenentnahme ist eine Messung der Wassertemperatur durchzuführen. Bei gechlorten Proben werden 0,5 ml 10 % Natriumthiosulfat pro 1000 ml Probe in die sterile Flasche vorgelegt.
Während vor einer Probenentnahme zur systemischen Untersuchung einer Trinkwasserinstallation eine Desinfektion der Auslaufstellen und Spülung der Entnahmearmatur mit 1 bis max. 3 l Trinkwasser erfolgt, kann abhängig von der krankenhaushygienischen Fragestellung davon abgewichen werden. Zur Abklärung von Erkrankungsfällen im Zusammenhang mit Armaturen, wie beispielsweise einer Dusche, kann es sinnvoll sein, eine Probe ohne vorheriges Ablaufenlassen zu nehmen. Bei Hinweisen auf Erwärmung der Kaltwasserleitung sind auch an Kaltwasserentnahmestellen Proben zu entnehmen. Die Beprobung von Mischwasser ist möglichst zu vermeiden, indem ggf. die Eckventile der nicht zu untersuchenden Zuleitungen vor der Probenentnahme geschlossen werden. Gegebenenfalls sind auch Proben aus Leitungsteilen, die stagnierendes Wasser führen, zu nehmen.

Methode

Von der Wasserprobe werden zweimal je 0,5 ml mittels Direktausstrich auf GVPC-Agar untersucht und 100 ml mittels Vakuumfiltration auf Nylon- oder Polycarbonatfilter (0,22–0,45 μm Porengröße) filtriert. Dieses Filter kann direkt auf GVPC-Agarplatten gelegt und bebrütet werden. Um die Nachweissensitivität zu steigern, beispielsweise in Wasserproben von Transplantationseinheiten oder nach Auftreten nosokomialer Legionellosen, können größere (1 l) Volumina filtriert werden. Die Proben werden auf GVPC-Agar inkubiert.
Bei Wasser mit Belastung von Begleitflora muss die Probe durch eine Säurebehandlung dekontaminiert werden (Anonymous 2000). Dazu wird nach Filtration die Membran mit 10 ml Säurelösung (pH 2,2±0,2) überschichtet: Diese besteht aus 3,9 ml 0,2 M HCl und 25 ml 0,2 M KCl. Nach 5 min Einwirkzeit wird die Säurelösung abgesaugt und die Membran mit 10 ml Puffer (z. B. Ringerlösung 1:40) gespült.
Die Agarplatten werden bei 36±1 °C und erhöhter Luftfeuchtigkeit (5 % CO2) über 10 Tage bebrütet und in Abständen von 2 Tagen auf ein Wachstum Legionellen-verdächtiger Kolonien hin beurteilt. Solche Kolonien werden in Replika auf BCYE-Agar und auf Blutagar übertragen und während 2 Tagen bei 36±1 °C bebrütet. Alle Kolonien, die auf BCYE-Agar, nicht aber auf Blutagar oder anderen Cystein-defizienten Medien wachsen, werden vorläufig als Legionellen betrachtet. Die genaue L. pneumophila-Spezies-Identität sollte durch einen serologischen Test (Immunfluoreszenz: MonoFluo Legionella pneumophila IFA Test Kit, Bio-Rad 32514) oder mittels Massenspektrometrie bestätigt werden. Für die Identifizierung nahezu aller Legionella spp. ist der PCR-Nachweis des „macrophage infectivity potentiator“-Gens (mip) etabliert (Ratcliff et al. 1998), der über eine DNA-Sequenzierung auch die Identifizierung der selteneren Non-Pneumophila-Spezies ermöglicht.

Beurteilung

Zur Interpretation von Befunden gibt es hinsichtlich eines Infektionsrisikos keine einheitlichen, sachlich ausreichend begründbaren Grenzwerte. Dennoch wird in der Regel Bezug auf das Arbeitsblatt W 551 der Deutschen Vereinigung des Gas- und Wasserfaches (DVGW) zu „Trinkwassererwärmungs- und Leitungsanlagen; Technische Maßnahmen zur Verminderung des Legionellenwachstums“ und auf die Empfehlungen des Umweltbundesamtes genommen (Schaefer et al. 2011). Hier wird in Krankenhäusern zwischen Hochrisiko- und Normalbereichen unterschieden. Danach liegt in Risikobereichen der Zielwert bei 0 KBE pro 100 ml und ab 1 KBE/100 ml sind unverzüglich Nutzungseinschränkungen oder endständige Filtration sowie weitergehende Untersuchungen einzuleiten. In Normalbereichen sowie anderen medizinischen und Pflegeeinrichtungen gilt ein Zielwert von <100 KBE pro 100 ml. Bei Konzentration darüber sind kurzfristige Kontrollen zu wiederholen und bei wiederholt bestätigten Befunden Sanierungsmaßnahmen erforderlich. Im Bereich mit besonders gefährdeten Patienten darf Legionellen-haltiges Wasser nicht für die Patientenpflege verwendet werden (Kap. Legionellosen und andere durch Wasser übertragbare Infektionen: Risikofaktoren, Erreger und Hygienemaßnahmen). Präventions- und Sanierungsmaßnahmen sind an anderer Stelle beschrieben (Kap. Technische Hygiene).

Untersuchung von Badewasser aus Therapie- und Bewegungsbecken

Die wichtigsten Keime, die im Beckenwasser und dem Reinwasser vorkommen können, sind Enterobakteriazeen, Pseudomonaden, Enterokokken, Staphylokokken, Legionellen, Mykobakterien und Hefen. Reinwasser ist das aufbereitete Wasser nach Zugabe des Desinfektionsmittels.

Probenentnahme

Häufigkeit und Abnahmestellen von Becken- und Reinwasser sind in Kap. Physiotherapie: Hygienische Maßnahmen beschrieben. Zum Auffangen des Wassers werden sterile, gut verschließbare Gefäße verwendet.

Methode

Die bakteriologische Untersuchung wird, wie unter Abschn. 6.2 beschrieben, durchgeführt.

Beurteilung

Badewasser muss so beschaffen sein, dass von ihm keine Schädigung der menschlichen Gesundheit durch Krankheitserreger ausgeht. Dies gilt für Schwimm- oder Badebeckenwasser ebenso wie für Bewegungsbäder. Bei Reinwasser darf die Koloniezahl 20 KBE/ml bei 20±2 °C und bei 36±1 °C nicht überschreiten. Bei Badewasser liegt der Grenzwert für beide Inkubationstemperaturen bei 100 KBE/ml. In 100 ml dürfen kein E. coli, keine coliformen Keime und kein P. aeruginosa enthalten sein. E. coli und coliforme Keime dienen als Indikatorkeime für fäkale Verunreinigung durch die Badenden, P. aeruginosa ist Indikatorkeim für mangelnde Wartung der Filter. Darüber hinaus dürfen in Beckenwasser keine Legionellen pro 1 ml bei 36±1 °C nachweisbar sein.

Untersuchung von raumlufttechnischen (RLT-)Anlagen

Der Aufbau von RLT-Anlagen sowie die Messgeräte und -verfahren zur Luftkeimzahlbestimmung sind in Kap. Technische Hygiene beschrieben.

Luftkeimzahlbestimmung

Nährmedien
Als Nährmedien dienen Columbia-Blut-Agarplatten (CBA), Caseinpepton-Sojapepton-Agarplatten (CSA), MacConkey-Agarplatten (McC), Agarfolien (Standard-Nutrient-Agar), Sabouraud-Glukose-(2 %-)Agarplatten, Enthemmeragarplatten (Abschn. 1.3), Tryptonsojabouillon, Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon (CSB) und PBS-Puffer.
Sedimentationsverfahren
Die Sedimentationsplatten werden nach 30- bis 60-minütiger Exposition verschlossen und bis zu 7 Tage bei 25–27 °C inkubiert.
Impingementverfahren
Bei dieser Methode wird ein definiertes Luftvolumen durch eine Nährbouillon bzw. Pufferlösung geleitet. Von dieser Lösung werden je 100 μl Flüssigkeit zur Keimzählung auf die CBA-/CSA-Platte bzw. Sabouraud-Glukose-(2 %-)Agarplatte ausgespatelt und bei 36±1 °C bzw. 20–25 °C inkubiert. Die Restflüssigkeit wird mittels Membranfiltration (Filter je nach Volumengröße auswählen, Porengröße 0,45 μm, Durchmesser 25 mm oder 50 mm) untersucht. Die Filter werden unter aseptischen Bedingungen halbiert. Die eine Hälfte wird auf die CBA-/CSA-Platten gelegt und 48–72 h bei 36±1 °C zum Nachweis aerober Keime inkubiert. Die andere Hälfte wird auf eine Sabouraud-Glukose-Agarplatte gelegt und 3–5 Tage bei 20–25 °C zum Nachweis von Pilzen inkubiert.
Impaktionsverfahren mit dem Reuter-Centrifugal-Sampler
Um das Austrocknen der Keime zu verhindern, sollte nicht länger als 5–6 min untersucht werden. Bei 5 min ergibt dies einen Luftdurchsatz von 200 l. Die Agarfolien werden anschließend 7 Tage bei 25–27 °C inkubiert. Die Keimzahl pro m3 Luft berechnet sich als KBE mal 25 pro Minute. Die Zahl 25 errechnet sich aus der Geschwindigkeit, der axialen Komponente der Geschwindigkeit, der Querschnittsfläche des Ringspaltes, dem durch den Ringspalt geblasenen Volumen und dem Umrechnungsfaktor auf 1 m3 Luft.
Impaktionsverfahren mit dem Schlitzsammler
Die Agarplatte wird 7 Tage bei 25–27 °C oder 48–72 h bei 36±1 °C inkubiert. Das Gerät fördert im Normalbetrieb einen Luftstrom von 50 l/min.
Filtrationsverfahren
Nach dem Luftdurchsatz (mittlere Ansauggeschwindigkeit 1,25 m/s) werden die Gelatinefilter auf Columbia-Blut-Agarplatten gelegt und 48–72 h bei 36±1 °C inkubiert. Die Kolonien werden ausgezählt und die Keimzahl auf das angesaugte Luftvolumen bezogen.

Beurteilung

Sedimentationsverfahren
Dieses Verfahren erfasst lediglich die in einem bestimmten Expositionszeitraum auf den aufgestellten Agarplatten sedimentierenden Keime. Dies liefert orientierende Ergebnisse. Aus der Keimzahl auf einer bestimmten Agarfläche lässt sich beispielsweise hochrechnen, wie viele Staphylokokken innerhalb einer bestimmten Zeit auf 1 m3 OP-Fläche sedimentieren. Das Verfahren ist auch gut geeignet zur Routinekontrolle in Sterilräumen, zum Beispiel Laminar-Air-Flow-Bänken.
Impingementverfahren
Bei diesem Verfahren ist die Zählung der einzelnen Keime exakter, da die Konglomerate zerteilt werden, doch muss darauf hingewiesen werden, dass die Keimausbeute geringer ist. Bei Verwendung von Nährlösung muss anschließend eine rasche Verarbeitung gewährleistet sein.
Impaktionsverfahren
Die einzelnen Geräte für das Impaktionsverfahren haben Vor- und Nachteile. Bei der Aufschleudermethode erzielt man jedoch eine relativ hohe Keimausbeute. Bei dem RCS-Gerät muss darauf hingewiesen werden, dass mit der angesaugten Luftmenge ein Gemisch von wieder zurückgeschleuderter Luft und Absaugluft gemessen wird. Die Richtwerte für dieses Verfahren sind in Tab. 4 zusammengestellt.
Tab. 4
Richtwerte beim Impaktionsverfahren
Filterklasse der 3. Filterstufe
Luftkeimzahl
(KBE/m3)
Richtwert
Grenzwert
S-Filter (H14)
4
10
R-Filter (H13)
4
10
Filtrationsverfahren
Dieses Verfahren liefert ebenfalls eine gute Keimausbeute. Die Erfassungsgrenze liegt hier bei ≥4 KBE/m3 Luft.

Keimzahlbestimmung im Befeuchterwasser

Von der Gesamtmenge werden etwa 100 ml entnommen, davon je 100 μl zur Keimzählung auf die entsprechenden Platten gespatelt und bei 36±1 °C bzw. 20–25 °C inkubiert. Die Restflüssigkeit wird mittels Membranfiltration (Filter je nach Volumengröße auswählen, Porengröße 0,45 μm, Durchmesser 25 mm oder 50 mm) untersucht. Die Filter werden unter aseptischen Bedingungen halbiert. Die eine Hälfte wird auf die CBA/CAB-Platte gelegt und 48–72 h bei 36±1 °C zum Nachweis aerober Keime inkubiert. Die andere Hälfte wird auf eine Sabouraud-Glucoseagarplatte gelegt und 3–5 Tage bei 20–25 °C zum Nachweis von Pilzen inkubiert. Wurde dem Wasser Desinfektionsmittel zugesetzt, muss die Anlage des Materials auf Agarplatten mit Enthemmer erfolgen (Abschn. 1.3).

Beurteilung

Der Richtwert ist 102 KBE pro ml Wasser und soll nicht mehrmalig überschritten werden. Bei Überschreitung muss eine Kontrolle der Frischwasserzufuhr sowie eine Reinigung und die Desinfektion der Anlage erfolgen.

Untersuchungen in der Küche

Probenentnahme

Als feste Nährmedien dienen RODAC-Columbia-Blutagarabklatschplatten, RODAC-Enthemmer-Agarabklatschplatten, Columbia-Blutagarplatten, Nissui/MacConkey-Agarplatten, Cetrimidagarplatten und Enthemmeragarplatten (Abschn. 1.3). Als flüssige Nährmedien werden Caseinpepton-Sojapepton-Bouillon (CSB) oder Thioglycolatbouillon (ggf. mit Enthemmer) verwendet.

Methode

Bei den Abstrichuntersuchungen werden die Tupfer direkt auf Blut- oder Enthemmerplatten abgerollt und in der entsprechenden Bouillon angereichert (Anreicherung nur bei gezielter Suche nach bestimmten Erregern, z. B. Salmonellen). Die Agarplatten werden 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert. Die Bouillon wird bis zu 5 Tage bei 36±1 °C inkubiert und bei Trübung auf die entsprechende Agarplatte ausgeimpft und 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert und die gewachsenen Kolonien differenziert.
Bei der gezielten Probenentnahme, wobei es sich meist um Flüssigkeiten handelt, werden 100 μl Flüssigkeit auf die entsprechenden Agarplatten ausgespatelt und zur anschließenden Keimzählung 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert. Die Restflüssigkeit wird mit der Membranfitration (Filter je nach Volumengröße auswählen, Porengröße 0,45 μm, Durchmesser 25 mm bzw. 50 mm) verarbeitet. Die Filter werden auf die entsprechende Platte gelegt und 24–48 h bei 36±1 °C inkubiert.
Bei gezielter Suche nach bestimmten Erregern wird die Anreicherungsbouillon nach Bebrütung über Nacht auf Selektivmedien ausgestrichen und wieder bei 36±1 °C für 24–48 h inkubiert. Bei Suche nach Pilzen müssen die Nährmedien 3–5 Tage bei 20–25 °C inkubiert werden.

Beurteilung

Bedeutung und Interpretation mikrobiologischer Küchenuntersuchungen werden in Kap. Krankenhausküchen: Hygienische Maßnahmen diskutiert.

Untersuchungen in der Milchküche

Muttermilch

Bei Verdacht auf Mastitis wird Muttermilch nach Desinfektion der Brustwarzen in sterilen Behältern (getrennt für die rechte und linke Brust) aufgefangen und möglichst sofort bakteriologisch untersucht. Bringen gesunde Mütter für ihre (kranken) Kinder abgepumpte Milch von zu Hause in die Klinik, wird lediglich eine Probe aus der Gesamtmilchmenge untersucht (Kap. Neonatologie und Pädiatrie: Hygienische Maßnahmen).

Pulvernahrung

Untersucht werden Proben von in der Milchküche zubereiteter Nahrung aus industriell hergestellter Pulvernahrung. Die Untersuchung solcher Proben ist wie auch bei Muttermilch routinemäßig nicht erforderlich, ggf. aber bei Frühgeborenennahrung unter bestimmten Bedingungen sinnvoll (Kap. Neonatologie und Pädiatrie: Hygienische Maßnahmen).

Methode

Es werden jeweils 0,1 ml Milch auf Columbia-Blutagar ausgespatelt und bei 36±1 °C 18–24 h inkubiert. Auf MacConkey-Agarplatten werden 0,05 ml Milch ausgespatelt und ebenfalls bei 36±1 °C 18–24 h inkubiert. Anschließend erfolgt die Keimzählung und die laborübliche Differenzierung.

Beurteilung

Allgemein akzeptierte Grenzwerte für zulässige Keimzahlen in Muttermilch oder Pulvernahrung gibt es nicht (zur Interpretation der Befunde Kap. Neonatologie und Pädiatrie: Hygienische Maßnahmen). Ein pragmatischer Vorschlag lautet, dass Milch mit Nachweis von Enterobakteriazeen oder mit einer Keimzahl von >100.000/ml verworfen wird. Bei einer Keimzahl von unter 10.000 KBE/ml wird sie unbehandelt verfüttert. Bei Keimzahlen zwischen 10.000 und 100.000 KBE/ml wird sie pasteurisiert, wenn β-hämolysierende Streptokokken oder S. aureus nachgewiesen werden, nicht aber beim Nachweis von sonstigen Hautkeimen.

Überprüfung thermischer Desinfektionsverfahren in Reinigungs- und Desinfektionsautomaten

Die Überprüfung von Reinigungs- und Desinfektionsautomaten und Taktwaschanlagen für die Aufbereitung von Instrumenten und beispielsweise Beatmungsschläuchen sowie anderen Gegenständen (z. B. Sekretauffanggläser, Waschschüsseln) wird an kontaminierten Testobjekten (in der Regel Schrauben und Schläuche) durchgeführt (Kap. Medizinprodukte: Sichere und umweltschonende Aufbereitung).

Testobjekte

Als Testobjekte werden Schrauben aus Edelstahl (z. B. DIN 84 M 6×20) und ca. 7 cm lange Schläuche (6 mm Lumen; Hersteller: W. Rüsch & CoKG, Waiblingen) verwendet (Empfehlung des ehemaligen BGA für die Prüfung von thermischen Desinfektionsverfahren in Reinigungsautomaten).

Kontamination der Testobjekte

Pro Maschine werden mindestens 5 Schrauben und, falls in der Maschine auch Schläuche aufbereitet werden, außerdem 5 Schläuche als Testobjekte verwendet, die mit E. faecium ATCC 6057 (DSM-Nr.: 2146) in einer Keimzahl von 105–106 KBE pro Testobjekt kontaminiert werden. Dafür wird der Testkeim auf Blutagarplatten bei 36±1 °C 48 h inkubiert. Anschließend werden die Kolonien von 3–4 Agarplatten mit einem sterilen Tupfer abgenommen und in 6 ml Pferdeblut suspendiert. Mit dieser Suspension werden die Schrauben und Schläuche kontaminiert und in Petrischalen 24 h über CaCl2 getrocknet. Kontaminierte Prüfobjekte können bei −20 °C bis zum Gebrauch gelagert werden.
Kontrolle der Ausgangskeimzahl
Jeweils eine Schraube und ein Schlauch werden zur Kontrolle der Ausgangskeimzahl verwendet. Dazu schüttelt man das Testobjekt in 10 ml NaCl, legt eine Verdünnungsreihe an und spatelt auf Blutagar verschiedene Mengen (20 μl und 100 μl) aus.

Prüfung der Testobjekte nach Desinfektion

Nach der Desinfektion werden Schrauben und Schläuche in Röhrchen mit TSB mit Enthemmer gegeben und 7 Tage bei 36±1 °C inkubiert. Bleibt die Bouillon nach dieser Zeit klar, ist kein Wachstum erfolgt, sodass man von einer Reduktion der Keimzahl um 5 Log10-Stufen ausgehen kann, was die erforderliche Keimzahlreduktion für ein Desinfektionsverfahren ist (Kap. Medizinprodukte: Sichere und umweltschonende Aufbereitung). Kommt es zu einer Trübung der Bouillon, wird ein Ausstrich auf CASO-Agar mit Enthemmer angefertigt. Wächst nach Inkubation der Testkeim an, war das Desinfektionsverfahren nicht ausreichend wirksam.

Überprüfung thermischer Desinfektionsverfahren in Geschirrspülmaschinen

Mehrtankspülmaschinen müssen eine Desinfektionsleistung mit einer Keimreduktion um 5 Log-Stufen haben. Zur Prüfung wird ein vergleichsweise hitzeresistenter E.-faecium-Stamm (ATCC 6057) verwendet, mit dem Prüfkörper kontaminiert werden. Neben der aufwendigeren quantitativen Vorgehensweise nach DIN 10510 mit einer Kontamination mit 107–108 KBE je Prüfkörper kann die mindest-erforderliche Keimreduktion vereinfacht auch wie folgt überprüft werden.

Kontamination der Prüfkörper

Als Prüfkörper werden Metallplättchen (10×1 cm) verwendet, die mit E. faecium ATCC 6057 als Bioindikator kontaminiert werden (Abschn. 13.1 für die Anzüchtung des Testkeims). Mit Kochsalz-Pepton-Lösung und mithilfe eines sterilen Spatels werden die Kolonien von der Agarplatte abgeschwemmt, in ein steriles Röhrchen gegeben und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in RAMS (0,6 % Rinderalbumin, 1,0 % Mucin, 3,0 % Maisstärke, wobei die Substanzen für die Herstellung einzeln in Aqua dest. konzentriert gelöst und sterilisiert werden) suspendiert. Pro Metallplättchen werden 0,1 ml des in RAMS suspendierten Testkeims aufgetragen. Dies entspricht einer Kontamination mit 105–106 KBE pro Metallplättchen (Abschn. 13.2 für die Kontrolle der Ausgangskeimzahl auf den Testobjekten).

Prüfung der Testobjekte nach dem Spülgang

Nach Beendigung des Spülzyklus werden die Metallplättchen in leere sterile Röhrchen gegeben und ca. 20 ml TSB mit Enthemmer zugegeben, sodass die Metallplättchen vollständig bedeckt sind. Die Röhrchen werden 2 Tage bei 36±1 °C inkubiert. Bleibt die Bouillon nach dieser Zeit klar, ist die für eine Desinfektion erforderliche Keimzahlreduktion erreicht (Abschn. 12.3, ebenso für das weitere Vorgehen bei Trübung).

Überprüfung von Sterilisatoren

Dampfsterilisatoren werden mit Sporen von Geobacillus stearothermophilus, Heißluftsterilisatoren mit Sporen von Bacillus atrophaeus (früher B. subtilis) überprüft. Die Sporenpäckchen werden nach Entnahme aus dem Sterilisator in TSB eingelegt und 7 Tage bei 55–60 °C (G. stearothermophilus) bzw. 30–35 °C (B. atrophaeus) inkubiert (Kap. Medizinprodukte: Sichere und umweltschonende Aufbereitung). Bei Trübung der Bouillon werden Subkulturen auf Blutagarplatten angelegt, um ein Wachstum der Testsporen zu bestätigen bzw. eine Kontamination auszuschließen.

Überprüfung von Endoskopen

Die Abstriche von Ventilen und Eingängen werden in TSB mit Enthemmer gegeben, und die Kanäle werden mit 0,9 % NaCl durchgespült (Kap. Endoskopie: Hygienische Maßnahmen). Die Proben werden 5 Tage bei 36±1 °C inkubiert. Positive Proben werden auf Blutagarplatten ausgestrichen und die Kolonien differenziert.
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