Bewertung der Qualität menschlicher Oozyten und Embryonen

Eine dunkle oder eine zu dünne oder zu dicke Zona pellucida, ein zu großer perivitelliner Spalt (PVS) (Abb. 3) sowie unregelmäßige Formen der Eizelle haben zwar keinen nachgewiesenen Einfluss auf die Fertilisation, jedoch auf die Qualität des entstehenden Embryos und dessen Implantationspotenzial nach Anwendung der ICSI-Methode (Xia 1997; Alikani et al. 1995; Shen et al. 2006). Hier werden nach der Applikation des ICSI-Verfahrens vermehrte Degenerationen beobachtet (Hamamah 2005; Balaban und Urman 2006).

Balaban et al. (1998) erkennen zwar, dass etwa 3 % aller gewonnenen Eizellen eine abnormale Form besitzen, diese jedoch die Fertilisationsrate und die Embryoqualität nicht beeinflussen, was auch weitere Studien bestätigten (Yakin et al. 2007). Dennoch bleibt dieser Aspekt kontrovers diskutiert (Rienzi et al. 2008).

Auch zwischen der Morphologie des Polkörpers und der Fähigkeit der Eizelle zur Fertilisation und im weiteren zu einer normalen Teilung zeigen Studien eine Korrelation (Choi et al. 1996). Ritter-Eichenlaub et al. (1995) zeigten sogar, dass anhand der Morphologie des ersten Polkörpers das post-ovulatorische Alter der befruchteten Eizelle bestimmt werden kann (Ritter-Eichenlaub et al. 1995). Während einige Autoren berichten, dass sowohl Implantations- als auch Schwangerschaftsraten höher ausfallen, wenn bei Embryotransfers anhand der Morphologie des ersten Polkörpers selektiert wird (Ebner et al. 1999; Balaban et al. 2001), zeigen hingegen neuere Studien, dass die Morphologie des ersten Polkörpers keine prognostische Aussagekraft hat für die weitere Fertilisation oder die embryonale Entwicklung (De Santis et al. 2005; Ciotti et al. 2004; Verlinsky et al. 2003).

Von großer Bedeutung für die Teilungs- und Implantationsfähigkeit einer befruchteten Eizelle bleibt hingegen der zytoplasmatische Reifegrad der Eizelle.

Eine Abnormalität des Zytoplasmas führt zu unregelmäßigen, in ihrer Vitalität beeinträchtigten Embryonen, deren Implantationspotenzial reduziert ist. Somit steht in der klinischen Tätigkeit des Embryologen die Evaluierung des Reifegrades einer Eizelle anhand ihres Aussehens (Textur) im Vordergrund (De Sutter et al. 1996).

Morphologische Bewertungen der Eizellqualität nach lichtmikroskopischer Betrachtung gehören zu den gängigen Routineverfahren in IVF-Laboren.

Dennoch sollen neuere Techniken zur Bewertung der zytoplasmatischen Eizellqualität hier nicht unerwähnt bleiben. Die technische Entwicklung von Mikroskopen mit polarisiertem Licht ermöglicht das sogenannte „Zona-Imaging“: die Zona pellucida, als trilaminare Struktur während der Eizellentwicklung sezerniert, erlaubt Rückschlüsse auf die Eizellqualität. Auch die Betrachtung und Bewertung des Spindelapparates und seiner Position sind damit möglich geworden (Montag et al. 2009).

Kritisch anzumerken sei jedoch, dass diese polarisationsmikroskopischen Analyseverfahren zeitaufwendig sind und auch Temperaturschwankungen mit sich bringen, auf die der Spindelapparat und auch die Oozyte sensibel reagieren. Des Weiteren bleibt die Datenlage bezüglich höherer Implantations- bzw. Schwangerschaftsraten nach diesem Verfahren bis heute uneindeutig.

Mit der Fertilisierung in vitro beginnt für den Embryologen ein weiteres Stadium in der Betrachtung und Beurteilung der Oozyte. Dieses liegt in einem zeitlichen Abstand von in der Regel 16–18 Stunden nach Insemination (IVF) oder Injektion der Samenzelle (ICSI), so dass sich im Klinikablauf die Arbeitsbezeichnung „Tag 1 nach Gewinnung“ durchgesetzt hat. Hier gilt es nochmals das Zytoplasma und weiter das Vorhandensein von zwei (Abb. 4) oder mehr Vorkernen (paternaler und maternaler Pronukleus) zu beurteilen, was soweit unter einem Lichtmikroskop erfolgen kann. Darüber hinaus ist eine Bewertung der in den Vorkernen enthaltenen Kernkörperchen (Nukleoli) unter einem Umkehrmikroskop (Inverted Microscope) möglich. Für die Bewertung des letztgenannten Parameters wurden verschiedene Scoring-Systeme entwickelt, von denen in der Literatur besonders das nach Tesarik und Greco (1999) und das nach Scott und Smith (1998) Erwähnung fanden. Auch Montag und Van der Ven (2001) betonen aufgrund ihrer multizentrischen, prospektiven Studie die Signifikanz der Bewertung der Pronuklei in diesem Stadium für Implantations- und Schwangerschaftsraten. All diese Scoring-Systeme legen die Morphologie der Eizelle und die Position und Verteilung der Kernkörperchen in den beiden Vorkernen als Parameter zugrunde.

Andere Publikationen wiederum zeigten diesbezüglich nach Anwendung und Vergleich der verschiedenen Scoring-Systeme keinerlei Vorteile (Ludwig et al. 2000; Balaban et al. 2001), zumal das Scoring an sich einen zeitaufwendigen Arbeitsschritt darstellt, der, insbesondere beim Vorliegen mehrerer Zygoten, den nötigen raschen Arbeitsablauf in vitro und außerhalb des Inkubators in die Länge zieht.

Die erste Zellteilung nach Syngamie (etwa 28–36 h) ist dann der nächste Prozessschritt, der für die Bewertung des nunmehr Embryos im 2-Zell-Stadium von Wichtigkeit ist.

Nach den ersten Zellteilungen bleibt die Morphologie des nunmehr embryonalen Zwei- und Vierzellers (Abb. 5 und 6) von enormer Wichtigkeit für die weitere physiologische Entwicklung des Embryos. Wie bereits bezüglich der Oozyten erwähnt, bleibt die lichtmikroskopische, morphologische Beurteilung auch der Embryonen ein Routineverfahren. Untersuchungen zu weiteren nichtinvasiven Markern wie Metabolomics (Devreker 2005), Proteomics (Brewis 1999) und Transcriptomics (Kere und Hofmann 2011) hielten nicht, was sie in ihren Anfängen versprachen, und setzten sich somit in der Praxis nicht durch. Eine zeitgerechte Teilung und die gleichmäßige bzw. symmetrische Größe der entstehenden Blastomeren sind die beiden zu bewertenden Parameter dieser Stadien. Unter dem Lichtmikroskop sollten in den einzelnen Blastomeren auch jeweils eigene Kerne zu sehen sein.

In den Anfängen der klinischen IVF-Praxis wurden drei verschiedene Bewertungsstufen des Embryos angelegt: idealer 4-Zeller (alle 4 Blastomeren in symmetrischer Form und Größe); schöner 4-Zeller (alle 4 Elastomeren gleichmäßig mit max. 10 % Fragmentierung); unregelmäßiger 4-Zeller (4 oder weniger unregelmäßig große Blastomere mit mehr als 10 % Fragmentierung) (Abb. 7) (Trotnow et al. 1981). 1992 dann erarbeiteten Steer et al. (1992) den sogenannten kumulativen Embryoscore (CES) mit 4 ganz ähnlichen Gütekriterien. Durch Multiplikation der Graduierung des Embryos (morphologische Qualität) mit der Anzahl der vorhandenen Blastomeren ergibt sich der jeweilige Embryoscore: beispielsweise bekommt ein idealer 2-Zeller 4 Score; ein idealer 4-Zeller 8 Score, ein idealer 8-Zeller (Abb. 8) wiederum 16 Score. Die Scorewerte der zu transferierenden Embryonen einer Patientin werden addiert und ergeben damit den kumulativen Embryoscore.

Mit dem Aufkommen optimierter Kulturmedien (sequential bzw. 1-step-media) in den vergangenen 10 Jahren konnte die Kulturdauer bis zu Tag 5 bzw. 6 nach Eizellgewinn erweitert werden, womit 50–60 % aller kultivierten Zygoten das Blastozystenstadium (Abb. 9 und 10) erreichen können. In Deutschland dürfen nach wie vor entsprechend dem Embryonenschutzgesetz aus 1991 lediglich drei Zygoten bis zu diesem Stadium weiterentwickelt werden, so dass ihr Prozentsatz bei ca. 20 % liegt. Die Wahrscheinlichkeit unter diesen drei zur Weiterentwicklung erlaubten Zygoten auch drei ausreichend gut entwickelte und geteilte Embryonen im Blastozystenstadium zu erreichen und schließlich zum Transfer zu bringen, liegt demnach in Deutschland signifikant unter dem internationalen Durchschnitt.

Dem klinischen Embryologen obliegt nunmehr die Aufgabe, aus den vorhandenen Embryonen im Blastozystenstadium die optimalen auszuwählen, wozu mittlerweile auch verschiedene Bewertungssysteme vorliegen. International hat sich diesbezüglich das Scoresystem nach Gardner et al. (2000) durchgesetzt und etabliert, das schlussendlich einen „single blastocyst transfer“ als Ziel definiert.

Sowohl letztgenannte als auch zahlreiche weitere Publikationen bekräftigen den Zusammenhang zwischen der Möglichkeit, hochqualitative Blastozysten im Labor zu kultivieren, und dem Erfolg einer ART-Behandlung unter Vermeidung von Mehrlingsschwangerschaften und der damit verbundenen Risiken. Das Vermeiden solcher risikobehafteten Mehrlingsschwangerschaften hat sich mit den immer weiter optimierten ART-Verfahren zu einem der wichtigsten Ziele entwickelt. Um diesem Ziel näher zu kommen, ohne gleichzeitig Abstriche bezüglich der gesamten Schwangerschaftsrate machen zu müssen, erweist sich bei bestimmten Patientinnen der sogenannte „elective single embryo transfer“ als sinnvoll. Als Voraussetzungen hierfür gelten jedoch neben dem relativ jungen Alter der Patientin, das Vorhandensein einer ausreichenden Anzahl von Embryonen, aus denen der klinische Embryologe den mit den besten Entwicklungschancen bis hin zur höchsten Implantationswahrscheinlichkeit auswählen kann. Die Anzahl der gut weiterentwickelten Embryonen geht mit der Frage des Zeitpunkts des Embryotranfers einher: Papanikolaou et al. (2008) konnten in ihrer Metaanalyse zeigen, dass an Tag 3 der Kultivierung sich ausreichend Embryonen zu idealen 8-Zellern entwickelt haben sollten, um die Weiterkultivierung bis hin zum Blastozystenstadium (Tag 5 bzw. Tag 6) zu erwägen und diese die Wahrscheinlichkeit einer später eintretenden klinischen Schwangerschaft signifikant erhöht.

Der Bestimmung der Embryonenqualität kam ohne Frage von Anfang an in ART-Verfahren eine hohe Bedeutung zu; die Kultivierung bis hin zur Blastozyste extendierte dieses Bemühen lediglich zeitlich. In diesem Zusammenhang entwickelte sich das sogenannte Timelapse-Verfahren zu einem weiteren kontrovers diskutierten Bewertungsverfahren der gesamten Stadien der embryonalen Entwicklung in vitro.

Die Entwicklung von Timelapse-Inkubatoren (EmbryoScope™, Miri®, Geri™) bzw. Geräten für videobasierte Überwachung eines Embryos innerhalb eines Standard-Inkubators (PrimoVision™, Eeva™) erlaubt dem Embryologen eine konstante Überwachung und Qualitätsbestimmung der sich entwickelnden Embryonen bei gleichzeitiger Reduzierung von Störungen, wie beispielsweise ständiges Öffnen des Inkubators und das Herausnehmen der Petrischalen. So können beispielsweise Mitosefehler und anschließende Fusionen der Blastomere detektiert werden. Solche Teilungsfehler ändern zwar nicht die Anzahl der Blastomeren, einem der Hauptkriterien bei der Qualitätsbestimmung, aber doch die Entwicklungsfähigkeit des Embryos, und könnten bei einer herkömmlichen punktuellen Kontrolle unentdeckt bleiben (Niakan et al. 2012).

Über diese erwähnten Vorteile des Verfahrens hinaus werden in der Diskussion weitere genannt: so die Möglichkeit einer automatisierten Auswertung durch Algorithmen und einer Reduktion von Varianzen durch verschiedene Labormitarbeiter (Alpha Konsensus 2011).

Demgegenüber dürfen in der Diskussion kritische Anmerkungen nicht fehlen. Als ausgewiesene Nachteile ergeben sich zum einen die unverhältnismäßig hohen Kosten aufgrund der Anschaffung vieler Geräte: Entweder wird ein bereits vorhandener Inkubator komplett für die Timelapse-Beobachtung reserviert werden müssen oder ein neues kombiniertes Gerät angeschafft, was neben den finanziellen Nachteilen enorme räumliche Probleme in Laboren bedeuten kann. Ferner werden spezielle kostenintensive Petrischalen benötigt. Beide Aspekte steigern bei hohen Fallzahlen die Laborkosten deutlich und stellen eine Herausforderung im täglichen Ablauf des Laborbetriebes dar, zumal auch nicht alle Mitarbeiter mit diesem Verfahren betraut werden können. Nicht zu unterschätzen sind die aufwendige Wartungslogistik, da die Hersteller in der Regel Techniker weit anreisen lassen müssen.

Ein schwerwiegender kritischer Aspekt ist die eingeschränkte Sicht einer Timelapse-Kamera auf den sich teilenden Embryo: Während ein klinischer Embryologe unter dem Lichtmikroskop eindeutig diploide von triploiden Zygoten unterscheiden kann, liefern die eindimensionalen Aufnahmen von Timelapse u. a. bei überlappenden Vorkernen keine eindeutigen Sichtergebnisse, so dass dennoch zusätzlich manuell unter dem Lichtmikroskop kontrolliert werden müsste.

Ein weiterer wesentlicher Kritikpunkt bezieht sich auf die spezifisch deutsche Situation mit dem bisher bestehenden Embryonenschutzgesetz. Lediglich drei Zygoten pro Patientin und Zyklus dürfen hier zur Weiterentwicklung gebracht werden. Diesem Fakt steht der oben beschriebene Aufwand in keinem Verhältnis gegenüber.

Ob demnach die beschriebene Präzisierung des Embryomonitorings mit Timelapse tatsächlich zu besseren Schwangerschaftsraten führt, sollten umfassende randomisierte klinische Studien klären (Kirkegaard et al. 2012).