Reproduktionsmedizin
Autoren
Safaa Al-Hasani und Klaus Diedrich

Bewertung der Qualität menschlicher Oozyten und Embryonen

Die Erkennung der Viabilität der menschlichen Metaphase-II-Oozyten ist in der Literatur des letzten Jahrzehnts ein kontrovers diskutiertes Thema. Die Entwicklung der Oozyten während der follikulären Maturation ist entscheidend für ihre Fähigkeit, eine normale Fertilisation sowie die folgenden embryonalen Entwicklungsschritte zu durchlaufen. Die komplette physiologische Reifung der Eizelle erfordert konzertiert ablaufende nukleäre und zytoplasmatische Prozesse, um optimale zelluläre Bedingungen herzustellen. Abweichungen von diesen optimalen Prozessen führen zu Eizellen, deren Qualitätseinschränkungen sich in verschiedenen Dysmorphien ausdrücken und im weiteren Verlauf dann unter Umständen nicht zu der gewünschten Implantation führen.
Die Erkennung der Viabilität der menschlichen Metaphase-II-Oozyten ist in der Literatur des letzten Jahrzehnts ein kontrovers diskutiertes Thema.
Die Entwicklung der Oozyten während der follikulären Maturation ist entscheidend für ihre Fähigkeit, eine normale Fertilisation sowie die folgenden embryonalen Entwicklungsschritte zu durchlaufen. Die komplette physiologische Reifung der Eizelle (Abb. 1) erfordert konzertiert ablaufende nukleäre und zytoplasmatische Prozesse, um optimale zelluläre Bedingungen herzustellen. Diese Qualitätsmerkmale beschreibt umfassend die Arbeit von Montag et al. (2009). Abweichungen von diesen optimalen Prozessen führen zu Eizellen, deren Qualitätseinschränkungen sich in verschiedenen Dysmorphien ausdrücken und im weiteren Verlauf dann unter Umständen nicht zu der gewünschten Implantation führen.
Die Bestimmung der Oozytenqualität erfolgte bei der Durchführung der IVF-Technik zunächst anhand der Bewertung der Morphologie des Kumulus-Korona-Komplexes direkt nach der Eizellgewinnung. In vielen Studien wurden verschiedene Skalen entwickelt, um die nukleäre und zytoplasmatische Reifung der Eizelle zu identifizieren. Erst mit der Etablierung der ICSI-Methode, bei der die mechanische und enzymatische Entfernung des umgebenden Kumulus-Korona-Komplexes erforderlich ist, wurde die direkte Visualisierung der Eizelle und somit auch die exakte Klassifizierung der Morphologie und des Reifegrades der Eizelle mit einer höheren Präzision als zuvor möglich. Sowohl extrazytoplasmatische als auch zytoplasmatische (Abb. 2) Veränderungen ließen sich jetzt erkennbar machen.
Zu den extrazytoplasmatischen Abnormalitäten zählen beispielsweise irreguläre Formen der Eizelle, eine Abnormalität der Zona pellucida oder des ersten Polkörpers sowie Dysmorphismen des perivitellinen Spalts (PVS).
Zytoplasmatische Abnormalitäten zeigen sich u. a. in einer Granulierung oder Fragmentierung bzw. einer Abweichung von der Homogenität des Zytoplasmas sowie im Vorhandensein von refraktilen Körpern, Vakuolen, glatten endoplasmatischen Reticula (smooth endoplasmic reticulum) oder Vesikeln (Abb. 2).
Ursachen für morphologische Veränderungen der Oozyten können sowohl intrinsische Faktoren, wie z. B. das Alter der Patientin oder genetische Defekte, als auch extrinsische Faktoren, wie z. B. die hormonelle Stimulation und der ovarielle Respond auf die kontrollierte ovarielle Stimulation (controlled ovarian stimulation, COS), sein (Rashidi et al. 2005; Ng et al. 2001).
Diese Eizelldysmorphismen sind die meistbeobachteten und sollen neben der Vorstellung der neueren zur Verfügung stehenden Techniken bei eben der Bewertung von nukleärer und zytoplasmatischer Reife und Qualität der Oocyten in diesem Abschnitt in den Fokus gestellt werden.

Abweichungen der Eizellmorphologie

Extrazytoplasmatische Abweichungen

Eine dunkle oder eine zu dünne oder zu dicke Zona pellucida, ein zu großer perivitelliner Spalt (PVS) (Abb. 3) sowie unregelmäßige Formen der Eizelle haben zwar keinen nachgewiesenen Einfluss auf die Fertilisation, jedoch auf die Qualität des entstehenden Embryos und dessen Implantationspotenzial nach Anwendung der ICSI-Methode (Xia 1997; Alikani et al. 1995; Shen et al. 2006). Hier werden nach der Applikation des ICSI-Verfahrens vermehrte Degenerationen beobachtet (Hamamah 2005; Balaban und Urman 2006).
Balaban et al. (1998) erkennen zwar, dass etwa 3 % aller gewonnenen Eizellen eine abnormale Form besitzen, diese jedoch die Fertilisationsrate und die Embryoqualität nicht beeinflussen, was auch weitere Studien bestätigten (Yakin et al. 2007). Dennoch bleibt dieser Aspekt kontrovers diskutiert (Rienzi et al. 2008).
Auch zwischen der Morphologie des Polkörpers und der Fähigkeit der Eizelle zur Fertilisation und im weiteren zu einer normalen Teilung zeigen Studien eine Korrelation (Choi et al. 1996). Ritter-Eichenlaub et al. (1995) zeigten sogar, dass anhand der Morphologie des ersten Polkörpers das post-ovulatorische Alter der befruchteten Eizelle bestimmt werden kann (Ritter-Eichenlaub et al. 1995). Während einige Autoren berichten, dass sowohl Implantations- als auch Schwangerschaftsraten höher ausfallen, wenn bei Embryotransfers anhand der Morphologie des ersten Polkörpers selektiert wird (Ebner et al. 1999; Balaban et al. 2001), zeigen hingegen neuere Studien, dass die Morphologie des ersten Polkörpers keine prognostische Aussagekraft hat für die weitere Fertilisation oder die embryonale Entwicklung (De Santis et al. 2005; Ciotti et al. 2004; Verlinsky et al. 2003).

Zytoplasmatische Abweichungen

Von großer Bedeutung für die Teilungs- und Implantationsfähigkeit einer befruchteten Eizelle bleibt hingegen der zytoplasmatische Reifegrad der Eizelle.
Eine Abnormalität des Zytoplasmas führt zu unregelmäßigen, in ihrer Vitalität beeinträchtigten Embryonen, deren Implantationspotenzial reduziert ist. Somit steht in der klinischen Tätigkeit des Embryologen die Evaluierung des Reifegrades einer Eizelle anhand ihres Aussehens (Textur) im Vordergrund (De Sutter et al. 1996).
Ein dunkles oder granuliertes Zytoplasma, sogenannte refraktile Körper, Spots oder die Bildung einer oder mehrerer Vakuolen oder Vesikeln im Zytoplasma haben eine verminderte Fertilisationsrate bzw. eine verminderte Embryoqualität zur Folge und zeigen damit einen Einfluss auf die Implantationsraten (Giovanni et al. 2004; Xia 1997; De Sutter et al. 1996).

Intrinsische und extrinsische Ursachen von Eizelldysmorphismen

Einfluss des Patientinnenalters auf Oozytengröße und chromosomale Aberrationen

Klein et al. (1996) beobachteten bei Frauen ab dem 40. Lebensjahr, dass 79 % der aus nicht stimulierten Zyklen gewonnenen Eizellen aneuploid waren, während bei Frauen unter 25 Jahren die Rate aneuploider Eizellen bei etwa 17 % lag. Übergroße oder zu kleine Eizellen sind in der Regel diploid oder aneuploid. Balakier et al. (2002) zeigten, dass unbeleuchtete übergroße Oozyten meist einen abnormalen, diploiden Chromosomensatz aufweisen, eine oder zwei Metaphaseplatten besitzen (mit 46 oder 2 × 23 Chromosomen) sowie einen oder zwei Polkörper. Nach ovarieller Stimulation mit Gonadotropinen lassen sich hingegen solche Größenabweichungen bei Eizellen (giant oocytes) nur selten beobachten.
Für den Fall, dass der klinische Embryologe dennoch solche Größenabweichungen beobachten sollte, besteht die eindeutige Empfehlung des EHSRE-Konsensuspapiers aus dem Jahr 2010/11 (Alpha Scientists in Reproductive Medicine, ESHRE Special Interest Group Embryoology 2011), an diesen Eizellen keine ICSI durchzuführen, da in der Regel aus ihnen triploide Zygoten entstehen.
Im europäischen und nicht-europäischen Ausland werden u. a. aus diesem Grund für Patientinnen mit Kinderwunsch ab einem bestimmten Alter Eizellspenden empfohlen, um unnötigen Aborten und fötalen Fehlbildungen vorzubeugen (Klein et al. 1996).

Einfluss der ovariellen Stimulation auf die Qualität sowie das morphologische Erscheinungsbild von Oozyten

Insgesamt bleibt die Eizellqualität stark abhängig von der Art der hormonellen Stimulation, die, erfolgt sie nicht patientinnen- und zeitgerecht, durchaus zu abnormalen Reifungsprozessen führen kann (De Cassia et al. 2010).
Eine exzessive ovarielle Stimulation und in der Folge superphysiologische Effekte wie hyperöstrogene oder zu hohe E2-Werte können ebenso wie eine zu früh vorgenommene Ovulationsinduktion negative Auswirkungen auf die Eizellqualität haben (Pena et al. 2002; Baart et al. 2007).
Von Palermo et al. (1996) erhobene Daten bekräftigen diesen negativen Effekt eines falschen ovariellen Stimulationsprotokolls auf die Entwicklung und Qualität der Eizellen. Überdosierte Gonadotropine haben sowohl Effekte auf die Zona pellucida als auch auf die Beschaffenheit des perivitellinen Spalts (Granularität des PVS) (Hassan-Ali et al. 1998). Mikkelsen und Lindenberg (2001) sehen einen vergrößerten PVS als Hinweis auf eine Überreifung der Oozyte.

Neuere Techniken zur Bewertung der Eizellqualität

Morphologische Bewertungen der Eizellqualität nach lichtmikroskopischer Betrachtung gehören zu den gängigen Routineverfahren in IVF-Laboren.
Dennoch sollen neuere Techniken zur Bewertung der zytoplasmatischen Eizellqualität hier nicht unerwähnt bleiben. Die technische Entwicklung von Mikroskopen mit polarisiertem Licht ermöglicht das sogenannte „Zona-Imaging“: die Zona pellucida, als trilaminare Struktur während der Eizellentwicklung sezerniert, erlaubt Rückschlüsse auf die Eizellqualität. Auch die Betrachtung und Bewertung des Spindelapparates und seiner Position sind damit möglich geworden (Montag et al. 2009).
Kritisch anzumerken sei jedoch, dass diese polarisationsmikroskopischen Analyseverfahren zeitaufwendig sind und auch Temperaturschwankungen mit sich bringen, auf die der Spindelapparat und auch die Oozyte sensibel reagieren. Des Weiteren bleibt die Datenlage bezüglich höherer Implantations- bzw. Schwangerschaftsraten nach diesem Verfahren bis heute uneindeutig.

Bewertungsparameter für Eizellen im Vorkernstadium und Embryonen

Fertilisierte Eizellen im Pronukleusstadium (Zygote)

Mit der Fertilisierung in vitro beginnt für den Embryologen ein weiteres Stadium in der Betrachtung und Beurteilung der Oozyte. Dieses liegt in einem zeitlichen Abstand von in der Regel 16–18 Stunden nach Insemination (IVF) oder Injektion der Samenzelle (ICSI), so dass sich im Klinikablauf die Arbeitsbezeichnung „Tag 1 nach Gewinnung“ durchgesetzt hat. Hier gilt es nochmals das Zytoplasma und weiter das Vorhandensein von zwei (Abb. 4) oder mehr Vorkernen (paternaler und maternaler Pronukleus) zu beurteilen, was soweit unter einem Lichtmikroskop erfolgen kann. Darüber hinaus ist eine Bewertung der in den Vorkernen enthaltenen Kernkörperchen (Nukleoli) unter einem Umkehrmikroskop (Inverted Microscope) möglich. Für die Bewertung des letztgenannten Parameters wurden verschiedene Scoring-Systeme entwickelt, von denen in der Literatur besonders das nach Tesarik und Greco (1999) und das nach Scott und Smith (1998) Erwähnung fanden. Auch Montag und Van der Ven (2001) betonen aufgrund ihrer multizentrischen, prospektiven Studie die Signifikanz der Bewertung der Pronuklei in diesem Stadium für Implantations- und Schwangerschaftsraten. All diese Scoring-Systeme legen die Morphologie der Eizelle und die Position und Verteilung der Kernkörperchen in den beiden Vorkernen als Parameter zugrunde.
Je gleichmäßiger die Verteilung der Kernkörperchen in den beiden Vorkernen ist, desto höher liegt die Chance auf Implantation (Borini et al. 2005).
Andere Publikationen wiederum zeigten diesbezüglich nach Anwendung und Vergleich der verschiedenen Scoring-Systeme keinerlei Vorteile (Ludwig et al. 2000; Balaban et al. 2001), zumal das Scoring an sich einen zeitaufwendigen Arbeitsschritt darstellt, der, insbesondere beim Vorliegen mehrerer Zygoten, den nötigen raschen Arbeitsablauf in vitro und außerhalb des Inkubators in die Länge zieht.
Die erste Zellteilung nach Syngamie (etwa 28–36 h) ist dann der nächste Prozessschritt, der für die Bewertung des nunmehr Embryos im 2-Zell-Stadium von Wichtigkeit ist.

Der embryonale Zwei- und Vierzeller

Nach den ersten Zellteilungen bleibt die Morphologie des nunmehr embryonalen Zwei- und Vierzellers (Abb. 5 und 6) von enormer Wichtigkeit für die weitere physiologische Entwicklung des Embryos. Wie bereits bezüglich der Oozyten erwähnt, bleibt die lichtmikroskopische, morphologische Beurteilung auch der Embryonen ein Routineverfahren. Untersuchungen zu weiteren nichtinvasiven Markern wie Metabolomics (Devreker 2005), Proteomics (Brewis 1999) und Transcriptomics (Kere und Hofmann 2011) hielten nicht, was sie in ihren Anfängen versprachen, und setzten sich somit in der Praxis nicht durch. Eine zeitgerechte Teilung und die gleichmäßige bzw. symmetrische Größe der entstehenden Blastomeren sind die beiden zu bewertenden Parameter dieser Stadien. Unter dem Lichtmikroskop sollten in den einzelnen Blastomeren auch jeweils eigene Kerne zu sehen sein.
Eine als gut zu bewertende geteilte Eizelle sollte frei von Fragmentationen der Blastomere sein – eine erhöhte Blastomerfragmentation bedeutet eine eher negative Implantationsfähigkeit des weiterentwickelten Embryos (Ciray et al. 2005).
In den Anfängen der klinischen IVF-Praxis wurden drei verschiedene Bewertungsstufen des Embryos angelegt: idealer 4-Zeller (alle 4 Blastomeren in symmetrischer Form und Größe); schöner 4-Zeller (alle 4 Elastomeren gleichmäßig mit max. 10 % Fragmentierung); unregelmäßiger 4-Zeller (4 oder weniger unregelmäßig große Blastomere mit mehr als 10 % Fragmentierung) (Abb. 7) (Trotnow et al. 1981). 1992 dann erarbeiteten Steer et al. (1992) den sogenannten kumulativen Embryoscore (CES) mit 4 ganz ähnlichen Gütekriterien. Durch Multiplikation der Graduierung des Embryos (morphologische Qualität) mit der Anzahl der vorhandenen Blastomeren ergibt sich der jeweilige Embryoscore: beispielsweise bekommt ein idealer 2-Zeller 4 Score; ein idealer 4-Zeller 8 Score, ein idealer 8-Zeller (Abb. 8) wiederum 16 Score. Die Scorewerte der zu transferierenden Embryonen einer Patientin werden addiert und ergeben damit den kumulativen Embryoscore.

Das Blastozystenstadium

Mit dem Aufkommen optimierter Kulturmedien (sequential bzw. 1-step-media) in den vergangenen 10 Jahren konnte die Kulturdauer bis zu Tag 5 bzw. 6 nach Eizellgewinn erweitert werden, womit 50–60 % aller kultivierten Zygoten das Blastozystenstadium (Abb. 9 und 10) erreichen können. In Deutschland dürfen nach wie vor entsprechend dem Embryonenschutzgesetz aus 1991 lediglich drei Zygoten bis zu diesem Stadium weiterentwickelt werden, so dass ihr Prozentsatz bei ca. 20 % liegt. Die Wahrscheinlichkeit unter diesen drei zur Weiterentwicklung erlaubten Zygoten auch drei ausreichend gut entwickelte und geteilte Embryonen im Blastozystenstadium zu erreichen und schließlich zum Transfer zu bringen, liegt demnach in Deutschland signifikant unter dem internationalen Durchschnitt.
Dem klinischen Embryologen obliegt nunmehr die Aufgabe, aus den vorhandenen Embryonen im Blastozystenstadium die optimalen auszuwählen, wozu mittlerweile auch verschiedene Bewertungssysteme vorliegen. International hat sich diesbezüglich das Scoresystem nach Gardner et al. (2000) durchgesetzt und etabliert, das schlussendlich einen „single blastocyst transfer“ als Ziel definiert.
Sowohl letztgenannte als auch zahlreiche weitere Publikationen bekräftigen den Zusammenhang zwischen der Möglichkeit, hochqualitative Blastozysten im Labor zu kultivieren, und dem Erfolg einer ART-Behandlung unter Vermeidung von Mehrlingsschwangerschaften und der damit verbundenen Risiken. Das Vermeiden solcher risikobehafteten Mehrlingsschwangerschaften hat sich mit den immer weiter optimierten ART-Verfahren zu einem der wichtigsten Ziele entwickelt. Um diesem Ziel näher zu kommen, ohne gleichzeitig Abstriche bezüglich der gesamten Schwangerschaftsrate machen zu müssen, erweist sich bei bestimmten Patientinnen der sogenannte „elective single embryo transfer“ als sinnvoll. Als Voraussetzungen hierfür gelten jedoch neben dem relativ jungen Alter der Patientin, das Vorhandensein einer ausreichenden Anzahl von Embryonen, aus denen der klinische Embryologe den mit den besten Entwicklungschancen bis hin zur höchsten Implantationswahrscheinlichkeit auswählen kann. Die Anzahl der gut weiterentwickelten Embryonen geht mit der Frage des Zeitpunkts des Embryotranfers einher: Papanikolaou et al. (2008) konnten in ihrer Metaanalyse zeigen, dass an Tag 3 der Kultivierung sich ausreichend Embryonen zu idealen 8-Zellern entwickelt haben sollten, um die Weiterkultivierung bis hin zum Blastozystenstadium (Tag 5 bzw. Tag 6) zu erwägen und diese die Wahrscheinlichkeit einer später eintretenden klinischen Schwangerschaft signifikant erhöht.
Der Bestimmung der Embryonenqualität kam ohne Frage von Anfang an in ART-Verfahren eine hohe Bedeutung zu; die Kultivierung bis hin zur Blastozyste extendierte dieses Bemühen lediglich zeitlich. In diesem Zusammenhang entwickelte sich das sogenannte Timelapse-Verfahren zu einem weiteren kontrovers diskutierten Bewertungsverfahren der gesamten Stadien der embryonalen Entwicklung in vitro.
Die Entwicklung von Timelapse-Inkubatoren (EmbryoScope™, Miri®, Geri™) bzw. Geräten für videobasierte Überwachung eines Embryos innerhalb eines Standard-Inkubators (PrimoVision™, Eeva™) erlaubt dem Embryologen eine konstante Überwachung und Qualitätsbestimmung der sich entwickelnden Embryonen bei gleichzeitiger Reduzierung von Störungen, wie beispielsweise ständiges Öffnen des Inkubators und das Herausnehmen der Petrischalen. So können beispielsweise Mitosefehler und anschließende Fusionen der Blastomere detektiert werden. Solche Teilungsfehler ändern zwar nicht die Anzahl der Blastomeren, einem der Hauptkriterien bei der Qualitätsbestimmung, aber doch die Entwicklungsfähigkeit des Embryos, und könnten bei einer herkömmlichen punktuellen Kontrolle unentdeckt bleiben (Niakan et al. 2012).
Über diese erwähnten Vorteile des Verfahrens hinaus werden in der Diskussion weitere genannt: so die Möglichkeit einer automatisierten Auswertung durch Algorithmen und einer Reduktion von Varianzen durch verschiedene Labormitarbeiter (Alpha Konsensus 2011).
Demgegenüber dürfen in der Diskussion kritische Anmerkungen nicht fehlen. Als ausgewiesene Nachteile ergeben sich zum einen die unverhältnismäßig hohen Kosten aufgrund der Anschaffung vieler Geräte: Entweder wird ein bereits vorhandener Inkubator komplett für die Timelapse-Beobachtung reserviert werden müssen oder ein neues kombiniertes Gerät angeschafft, was neben den finanziellen Nachteilen enorme räumliche Probleme in Laboren bedeuten kann. Ferner werden spezielle kostenintensive Petrischalen benötigt. Beide Aspekte steigern bei hohen Fallzahlen die Laborkosten deutlich und stellen eine Herausforderung im täglichen Ablauf des Laborbetriebes dar, zumal auch nicht alle Mitarbeiter mit diesem Verfahren betraut werden können. Nicht zu unterschätzen sind die aufwendige Wartungslogistik, da die Hersteller in der Regel Techniker weit anreisen lassen müssen.
Ein schwerwiegender kritischer Aspekt ist die eingeschränkte Sicht einer Timelapse-Kamera auf den sich teilenden Embryo: Während ein klinischer Embryologe unter dem Lichtmikroskop eindeutig diploide von triploiden Zygoten unterscheiden kann, liefern die eindimensionalen Aufnahmen von Timelapse u. a. bei überlappenden Vorkernen keine eindeutigen Sichtergebnisse, so dass dennoch zusätzlich manuell unter dem Lichtmikroskop kontrolliert werden müsste.
Ein weiterer wesentlicher Kritikpunkt bezieht sich auf die spezifisch deutsche Situation mit dem bisher bestehenden Embryonenschutzgesetz. Lediglich drei Zygoten pro Patientin und Zyklus dürfen hier zur Weiterentwicklung gebracht werden. Diesem Fakt steht der oben beschriebene Aufwand in keinem Verhältnis gegenüber.
Ob demnach die beschriebene Präzisierung des Embryomonitorings mit Timelapse tatsächlich zu besseren Schwangerschaftsraten führt, sollten umfassende randomisierte klinische Studien klären (Kirkegaard et al. 2012).

Zusammenfassung

Nach wie vor bleibt trotz aller genannten neueren alternativ vorgeschlagenen Verfahren die lichtmikroskopische Beurteilung der Eizell- und Zygotenqualität bis zum Blastozystenstadium im IVF-Labor die gängige. In Deutschland verhindert das Embryonenschutzgesetz die Weiterkultivierung und Selektion der Embryonen, so dass nach der lichtmikroskopischen Beurteilung der Embryonen im Vorkernstadium überzählige kryokonserviert oder verworfen werden. Im internationalen Ausland schaffen liberalere Regelungen und Gesetze andere Voraussetzungen für die klinische Praxis, aufgrund der allein schon höhere Erfolgsraten bei ART-Behandlungen vorzuweisen sind.
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