Update zu Empfehlungen des Expertenpanels Epilepsie und Genetik der Deutschen Gesellschaft für Epileptologie (DGfE)

Die Klassifikation der Pathogenität von Genvarianten erfolgt im Regelfall anhand der Kriterien des American College of Medical Genetics (ACMG) [5]. Dabei spielen große Populationsdatenbanken eine wesentliche Rolle. Varianten, die zu häufig in gesunden Kontrollen vorkommen, sind weniger wahrscheinlich krankheitsursächlich bei Patienten als seltene Varianten. Die genaue Definition, wann eine Variante „zu häufig“ ist, bleibt krankheits- und genabhängig sowie Gegenstand aktueller Diskussionen [6‐8]. In jedem Fall muss die Pathogenität einer Variante angezweifelt werden, wenn sie sehr häufig (> 5 %) beobachtet wird (ACMG-Kriterium BA 1). Inzwischen stehen zur Beurteilung einige neue oder aktualisierte Datenbanken zur Verfügung: gnomAD v4.1.0 (730.947 Exome und 76.215 Genome), Regeneron Genetics Center Million Exome (RGC-ME; 983.578 Exome), und AllOfUs (245.388 Genome) [9‐11]. Da es sich um separate Populationen mit diversen ethnischen Hintergründen handelt, bieten diese Datenbanken komplementäre Informationen auch in zuvor unterrepräsentierten Bevölkerungsgruppen.

Einen weiteren zentralen Stellenwert hat die Frage, ob die Variante sich in einem Gen mit bereits beschriebener Krankheitsassoziation (d. h. einem gesicherten Zusammenhang mit Epilepsie) befindet. Andernfalls kann die Variante in der klinischen Routine nicht als (wahrscheinlich) pathogen klassifiziert werden, sondern müsste auf Forschungsbasis weiter exploriert werden. Oft wird für die Frage nach Krankheitsassoziationen die Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) verwendet, die Assoziationen werden jedoch nicht immer sorgfältig geprüft [12]. Der Goldstandard ist die Verwendung der Clinical Genome Resource (ClinGen), deren Epilepsie-Expertenpanel auch in den letzten Jahren aktiv weiter an der Kuratierung neuer Assoziationen gearbeitet hat [13]. Besonders wichtig sind diese Kuratierungen, um Fehlinterpretationen von Varianten zu verhindern, die in Genen liegen, deren Assoziation mit Epilepsie inzwischen widerlegt wurde (z. B. CHRNA7, CACNB4, CLCN2, SCN9A u. v. m.). Auf Variantenebene kann ein Vergleich mit bereits beobachteten Varianten in ClinVar erfolgen, dann jedoch unter Rücksichtnahme darauf, dass die dort berichteten Klassifikationen voneinander abweichen können („conflicting evidence“) und z. T. aus älteren Quellen stammen [14].

Eine weitere Ressource für epilepsiespezifische Krankheitsassoziationen sind Genlisten. Dies sind literaturbasierte Auswertungen von Genen, die mit epileptischen Anfällen oder Epilepsie assoziiert sein können. Neu sind hier die Arbeiten von Macnee et al. (738 Gene), Oliver et al. (Genes4Epilepsy, 1040 Gene), und Zhang et al. (China Epilepsy Gene 1.0 Projekt, 1506 Gene) [15‐17]. Die genauen Definitionen und der Konfidenzgrad der einzelnen Assoziationen sind dabei variabel. Besonders wertvoll sind neue genspezifische Ressourcen („Portale“), die sorgfältig kuratierte Varianten und zusätzliche klinische, funktionelle und genetische Daten zu einzelnen Fällen enthalten (Link: https://lal-portals.shinyapps.io/Neurogenetics-Gene-Portals/).

Zur Klassifikation der Pathogenität sind prädiktive Algorithmen hilfreich, sofern sie validiert und konsistent interpretiert werden (ACMG-Kriterien: PP3, BP4). Diese Algorithmen nutzen verschiedene Methoden des maschinellen Lernens und werden anhand von Informationen aus der Evolution, Sequenz und Struktur der jeweiligen Proteine trainiert. In einer rezenten Arbeit haben Montanucci et al. eine Reihe von modernen Algorithmen speziell an Varianten in Epilepsie-assoziierten Genen verglichen. Die höchste Genauigkeit zeigten AlphaMissense (Fläche unter der ROC-Kurve [AU-ROC]: 0,88–0,95; 37733863) und REVEL (AU-ROC: 0,88–0,93; 27666373) [18]. Für diese Algorithmen haben Pejaver und Bergquist verschiedene Referenzwerte berechnet, die eine Einordnung der Evidenzstärke für Pathogenität von moderat bis hin zu (sehr) stark erlauben [19, 20].

Varianten in einem bekannten Hotspot, d. h. einer Region mit einer Häufung bekannter pathogener Varianten, oder in funktionell relevanten Domänen sind eher krankheitsursächlich (ACMG-Kriterium: PM1). Besonders nützlich ist hier die Visualisierung der regionalen Toleranz für Varianten, d. h. des Unterschieds zwischen der Anzahl erwarteter und beobachteter Varianten in bestimmten Proteinabschnitten als Ausdruck der negativen Selektion. Speziell für die Anwendung in Epilepsie-assoziierten Genen wurde ursprünglich der „missense tolerance ratio“ (MTR) entwickelt [21]. Dieser wurde zwischenzeitlich an einem unabhängigen Datensatz aktualisiert und auf 3D-Strukturinformationen von AlphaFold 2 angewendet [11, 22]. Beide Tools erlauben benutzerfreundliche Visualisierungen.

Vor allem bei Varianten in Ionenkanälen oder Transportern ist nicht nur die Pathogenität relevant, sondern auch der Effekt auf die Proteinfunktion. Von dieser Information ist v. a. die Präzisionstherapie abhängig [23, 24]. Inzwischen gibt es eine Reihe von Algorithmen, die den funktionellen Varianteneffekt in Ionenkanälen vorhersagen [25‐29]. Diese Algorithmen sind jedoch noch experimentell und ausdrücklich nicht für die klinische Anwendung validiert. Die Beurteilung des Varianteneffekts sollte nie nur auf diesen Algorithmen beruhen, sondern immer alle verfügbaren Informationen berücksichtigen. Experimentelle Funktionsanalysen sind weiterhin der Forschung vorbehalten und nicht Teil der klinischen Diagnostik.

Mit der zunehmenden Fülle verfügbarer Informationen und Tools wird es zunehmend schwerer, die klinische und molekulare Epilepsiegenetik als gesamtes Feld zu überblicken. Hinzu kommt die immer häufigere Fragestellung nach der Re-Interpretation von Varianten unklarer Signifikanz (VUS), die immerhin in etwa einem Drittel der Fälle (22,5–32,6 %) berichtet werden [30]. An ersten Zentren bilden sich daher interdisziplinäre Variantenkonferenzen – analog beispielsweise epilepsiechirurgischer Fallkonferenzen – zur gemeinsamen Entscheidungsfindung. Beteiligte Berufsgruppen können Humangenetik, Bioinformatik und Neurologie sein. In Deutschland existieren solche Strukturen beispielsweise im Rahmen der Deutschen Akademie für seltene neurologische Erkrankungen (DASNE) als molekulare Therapieboards, die zusätzlich potenzielle präzisionsmedizinische Maßnahmen evaluieren. Neben der Reevaluierung der Pathogenität können hier auch Empfehlungen zu weiteren Testungen ausgesprochen werden (z. B. funktionelle Validierung, Reanalyse, Segregationsanalysen).

Die Varianteninterpretation in der Epilepsiegenetik erfordert ein integriertes Vorgehen mit modernen Tools, klinischer Expertise und strukturierter Diskussion. Die hier vorgestellten Ressourcen helfen dabei, Varianten differenzierter einzuordnen und tragen so zu einem besseren Verständnis von Genetik und Phänotyp bei – im Sinne einer sicheren, fundierten und zukunftsorientierten Diagnostik (siehe Infobox 1).

Nachdem über viele Jahre Panelsequenzierungen standardmäßig in der Diagnostik durchgeführt wurden, konnten zahlreiche Projekte den Mehrwert einer Exomsequenzierung und der Analyse aller proteinkodierender Regionen aufzeigen [34, 35]. In der Tat konnten Studien einen signifikanten klinischen Nutzen einer möglichst breit angelegten Analysestrategie (inklusive Analyse auf strukturelle Varianten und solche der mitochondrialen DNA) bei der genetischen Diagnostik auch im Erwachsenenalter zeigen [36]. Mitochondriale Erkrankungen können sowohl durch Defekte der nukleären DNA als auch der mitochondrialen DNA verursacht werden. Sowohl die Exom- als auch die Genomsequenzierung erfassen die mitochondriale DNA, sodass diese ohne zusätzliche Sequenzierkosten analysiert werden kann [37]. Hier gilt es jedoch zu beachten, dass pathogene Varianten in der Blut-DNA einen niedrigen Heteroplasmiegrad aufweisen können – was z. B. typisch beim MELAS-Syndrom ist – und somit die Testung eines anderen Gewebes erforderlich ist. Insbesondere zeigt sich also bei klinisch komplexen Krankheitsbildern ein Zusatznutzen einer genomweiten Analyse, da häufig klinisch die ätiologische Einordnung schwierig ist, z. B. kann bei einer DEE ebenfalls eine primäre Mitochondriopathie ursächlich sein, welche durch eine schmale Panelsequenzierung verpasst werden würde [38]. Ein weiterer hoch relevanter Zusatznutzen ist die Möglichkeit der Reanalyse der Daten, die in ca. 10 % der Fälle bei hochgradigem Verdacht auf eine monogene Krankheit nach 2 Jahren eine Diagnose liefern kann, meist, da in der Zwischenzeit neue Gen-Erkrankungs-Assoziationen etabliert werden konnten [39]. Die Epilepsy Genetics Initiative konnte mit einer zusätzlichen Lösungsrate von ca. 6 % durch Reanalysen von Exomdaten ähnliche Ergebnisse generieren [40].

Die Genomsequenzierung liefert – im Vergleich zur Exomsequenzierung – eine bessere Abdeckung der kodierenden Bereiche und analysiert sämtliche Regionen des Genoms, auch solche, die nicht für Proteine kodieren. Auch wenn initiale Studien keinen eindeutigen Mehrwert der WGS gegenüber einer WES zeigen konnten, da auch Varianten, die durch eine reine WES-Reanalyse gefunden worden wären [41, 42], miteinbezogen wurden, werden in der nahen Zukunft die vermehrte Listung von nicht kodierenden Varianten in Varianten-Datenbanken wie ClinVar und verbesserte In-silico-Vorhersageprogramme für nicht kodierende Varianten den Mehrwert demonstrieren. Varianten in der „small nuclear RNA“ RNU4‑2 sind mit einer der häufigsten monogenen Entwicklungsstörungen assoziiert, wobei diese Assoziation erst auf der Basis von großen Kohorten, die mittels Genomsequenzierungen untersucht wurden, im Jahr 2024 etabliert werden konnte [43]. Nachdem die Kosten für eine Genomsequenzierung durch den Einsatz moderner Sequenziermaschinen deutlich gesunken sind, sollte sie daher als Goldstandard gelten. Ein flächendeckender Einsatz in universitären Zentren wird derzeit im Modellvorhaben Genomsequenzierung nach SGB V, § 64e evaluiert [2].

Insbesondere im Bereich der Betreuung von neonatologischen Patienten mit Anfällen, aber auch darüber hinaus kann eine schnelle genetische Diagnostik für die Prognoseabschätzung und somit die Therapie entscheidend sein. In der international multizentrischen Studie Gene-STEPS konnten bei 43/100 Patienten mit infantilen und neonatalen Anfällen molekulargenetische Diagnosen mittels „rapid genome sequencing“ (rWGS) gestellt werden, was unmittelbare therapeutische Konsequenzen in 56 % der gelösten Fälle ermöglichte [44]. Im deutschsprachigen Raum wird eine rWGS-Diagnostik bisher lediglich in Studien, z. B. der Baby Lion Studie mit Zentrum in Hannover, durchgeführt, möglicherweise kann in der Zukunft eine Durchführung über das Modellvorhaben Genomsequenzierung erfolgen. Aktuelle Bearbeitungszeiten im Rahmen der Routineversorgung bei dringenden Fällen betragen etwas unter 2 Wochen.

Die Standarduntersuchung bei dem Verdacht auf monogene Epilepsien ist also die Genomsequenzierung, welche als Short-read-Genomsequenzierung (srWGS) durchgeführt wird. Dies bedeutet, dass kurze DNA-Fragmente sequenziert und sekundär bioinformatisch wieder zusammengeführt werden, um eine komplette Abdeckung des Genoms zu erreichen. Hier bestehen methodische Limitationen, so z. B. ist die Detektion von Varianten in homologen Regionen erschwert [45]. Aus diesem Grund ist z. B. die Diagnose einer spinalen Muskelatrophie aus Short-read-WGS mit Standardmethoden nicht möglich. Weiterhin sind die Detektion bestimmter Repeat-Expansionen sowie das Auflösen komplexer struktureller Varianten aus den Daten nicht möglich. Diese Limitationen kann die Long-read-Genomsequenzierung (lrWGS) überwinden [45]. Derzeit stehen 2 Plattformen der Firmen Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Vereinigtes Königreich) und PacBio (Menlo Park, Kalifornien, Vereinigte Staaten) zur Verfügung. Bisher sind noch keine umfangreichen Kohortenstudien publiziert, die einen direkten Vergleich zwischen srWGS und lrWGS durchgeführt haben, insbesondere nicht im Bereich der Epilepsien. Bisher veröffentlichte Arbeiten zeigen jedoch, dass die lrWGS strukturelle Varianten und Repeat-Expansionen besser auflösen kann [46]. Zusätzlich erlauben beide lrWGS-Technologien die Analyse von DNA-Modifikationen und insbesondere der DNA-Methylierung. Letztere zeigt bei Imprinting-Störungen wie dem Angelman-Syndrom ein abnormes, pathogenes Muster [45]. Insofern kann bei hochgradigem Verdacht auf eine monogene Epilepsie nach unauffälliger srWGS eine lrWGS sinnvoll sein, wobei vergleichende Kohortenstudien abgewartet werden müssen, um zu entscheiden, ob eine primäre lrWGS eine srWGS ersetzen sollte. Eine lrWGS ist in bestimmten akademischen humangenetischen Instituten bereits etabliert und wird z. B. für bestimmte Fragestellungen auch im Modellvorhaben Genomsequenzierung nach SGB V, § 64e durchgeführt.

Eine RNA-Sequenzierung kann bei unauffälliger DNA-Sequenzierung oder bei Nachweis von Varianten mit möglichem Spleißdefekt die Möglichkeit einer molekulargenetischen Diagnose liefern. Die RNA-Sequenzierung aus Patientenzellen kann verschiedene zelluläre Pathologien nachweisen, um Rückschlüsse auf eine monogene Krankheit zu ziehen: (1.) Aberrante Expression (aberrante RNA-Mengen des kodierenden Gens): Beispielsweise könnte eine Promotordeletion zur reduzierten Transkription eines Gens führen, was durch eine reduzierte Expression in der RNA-Sequenzierung nachgewiesen werden kann (2.) Aberrantes Spleißen: Pathogene intronische Varianten werden häufig in den diagnostischen Analysen verpasst, führen jedoch in der Regel zu einem Spleißdefekt, z. B. das Überspringen eines Exons. Dieses aberrante Spleißen kann durch die Sequenzierung der RNA nachgewiesen werden. (3.) Monoallelische Expression: Häufig führen Spleißvarianten zu Transkripten die vorzeitige Stopcodons enthalten und daher sofort mittels „nonsense mediated decay“ abgebaut werden. In solchen Fällen kann bei heterozygotem Vorliegen lediglich die RNA des anderen Allels nachgewiesen werden, nicht jedoch der Spleißdefekt. Beim Vorliegen heterozygoter Polymorphismen kann bei Expression in allen Transkripten der Rückschluss auf eine monoallelische Expression gezogen werden [47]. Die Hauptlimitation der RNA-Sequenzierung liegt darin, dass das entsprechende Krankheitsgen im Untersuchungsmaterial exprimiert sein muss. In der Regel wird ein Transkriptom aus peripheren mononukleären Blutzellen oder aus primären Fibroblasten, die über eine Hautbiopsie gewonnen werden, sequenziert. Für eine Normalisierung der Daten ist eine Kontrollkohorte von ca. 50 bis 100 Datensätzen erforderlich, weshalb z. B. auch eine Diagnostik an anderen Geweben, wie z. B. Hirngewebe, erschwert ist [48]. Während die meisten Ionenkanäle, die mit monogenen Epilepsien assoziiert sind, nicht in Blut oder Fibroblasten exprimiert sind, kann eine RNA-Sequenzierung zahlreiche Gene, die an der Hirnentwicklung beteiligt und somit mit epileptischen Enzephalopathien assoziiert sind, erfassen und somit Hinweise auf Diagnosen liefern (z. B. CDKL5, SLC25A22, STXBP1 …). Im Bereich der Stoffwechselerkrankungen geht man davon aus, dass eine zusätzliche RNA-Sequenzierung die diagnostische Ausbeute um ca. 10 % erhöhen kann [49]. Wie groß der zusätzliche Nutzen bei den unterschiedlichen Gruppen der monogenen Epilepsien ist, muss in prospektiven Studien untersucht werden.

Ebenso wie für die RNA-Sequenzierung wird für die Proteomanalyse frisches Gewebe benötigt, wofür sich ebenfalls kultivierte Patientenfibroblasten sehr gut eignen [50]. Die Detektion der Proteinmengen bringt in solchen Fällen einen Mehrwert, in denen eine genomische Variante nicht zu aberrantem Spleißen oder einer aberranten Expression, sondern zu einem instabilen Protein führt. Das ist für eine Vielzahl an pathogenen Missense-Varianten der Fall. Die Detektion erfolgt klassischerweise mittels Tandemmassenspektroskopie [51]. In jedem Fall muss das entsprechende Protein im Analysegewebe exprimiert sein, damit mittels Proteomics Diagnosen gestellt werden können. Über eine heterogene Kohorte konnte gezeigt werden, dass der Einsatz von Proteomics den diagnostischen Yield nach Exomsequenzierung um ca. 20 % erhöht [52]. Inwiefern dies für Epilepsien zutrifft, ist derzeit noch nicht untersucht.

Traditionell stehen in der Epilepsiegenetik v. a. Keimbahnvarianten im Fokus, die entweder familiär oder de novo auftreten und ab der Gamete in jeder Zelle des Körpers detektiert werden können. In den letzten Jahren haben jedoch zunehmend auch somatische Varianten an Relevanz gewonnen. Diese entstehen als postzygotische Ereignisse z. B. in neuronalen Vorläuferzellen und sind daher auch nur im betroffenen Gewebe (d. h. der epileptogenen Läsion) nachweisbar. Die Größe der Läsion, etwa der Unterschied zwischen einer fokal-kortikalen Dysplasie und der Hemimegalenzephalie, ist dabei direkt abhängig vom Zeitpunkt der Variante [67]. Die Sequenzierung von epileptogenen Läsionen führt in 35–85 % der Fälle, abhängig von der Histopathologie und Sequenziertechnologie, zum Nachweis einer somatischen Variante in einem von 19 bis 21 Genen [68].

Die wichtigsten durch somatische Varianten verursachten Läsionen und ihre assoziierten Gene sind dabei die kortikalen Malformationen, v. a. die fokal-kortikale Dysplasie Typ II (MTOR und andere Gene der PI3K-AKT-mTOR-Signalkaskade) und die milde Fehlbildung der kortikalen Entwicklung und oligodendroglialer Hyperplasie (SLC35A2), sowie die epilepsieassoziierten Tumoren inklusive Gangliogliom (BRAF, v. a. die rekurrente Variante p.V600E) und dysembryoplastischen neuroepithelialen Tumors (FGFR1) [69‐71]. Auch bei der mesialen Temporallappenepilepsie könnte pathogenen somatischen Genvarianten eine größere Bedeutung zukommen als bisher angenommen [72].

Dabei hat der Nachweis einer genetischen Ätiologie aus reseziertem Hirngewebe eine unmittelbare klinische Relevanz: Eine genetische Diagnose verbessert die Diagnosesicherheit der Histopathologie, v. a. bei subtilen Veränderungen oder seltenen Entitäten, und hat damit direkten Einfluss auf die Prognose [73]. Zudem korrelieren spezifische Genvarianten mit dem postoperativen Outcome oder der Malignität (z. B. PTPN11 oder EGFR in Gangliogliomen) [69, 74, 75]. Aus den Ergebnissen genetischer Diagnostik an reseziertem Hirngewebe können im Falle eines Versagens der chirurgischen Therapie möglicherweise Schlüsse für die weitere Therapie gezogen werden. Allerdings steckt die diesbezügliche Präzisionsmedizin noch in den Anfängen. Während die Wirksamkeit des mTOR-Inhibitors Everolimus als ASM bei tuberöser Sklerose nachgewiesen wurde (EXIST-3) [76], gibt es bisher keine großen Studien, die zeigen, dass mTOR-Inhibitoren bei fokalen kortikalen Dysplasien auf dem Boden somatischer pathogener Genvarianten in Genen des mTOR-Pfades besonders wirksam sind [77, 78]. An anderen, ähnlichen zielgerichteten Therapien wird geforscht.

Die Detektion von somatischen Varianten in epileptogenen Läsionen ist die sprichwörtliche „Nadel im Heuhaufen“. Der Anteil von Zellen mit der jeweiligen Variante liegt typischerweise unter 5 %, teilweise < 1 % [79]. Einerseits genügt dies, um dennoch schwere epileptische Anfälle zu verursachen. Andererseits ergeben sich hieraus erhebliche technische Herausforderungen in der Probengewinnung, Aufbereitung, Sequenzierung und Auswertung [68]. Als Folge dessen hat die Sequenzierung von Hirngewebe bisher nicht die klinische Routineanwendung erreicht. Erst in diesem Jahr wurde ein klinisches Genpanel verfügbar (Universitätsklinikum Leipzig). Exom- oder genomweite Analysen, die zusätzlich auch strukturelle Varianten inklusive Kopienzahlvarianten erfassen könnten, oder Einzelzellanalysen sind aufgrund der damit verbundenen Kosten bisher noch der Forschung vorbehalten [70, 80].

Alle zuvor genannten Analysen erfolgen aus bereits reseziertem Hirngewebe. Eine vielversprechende Zukunftsperspektive ergibt sich aus der präoperativen Sequenzierung von Geweberesten an Tiefenelektroden. Dieser minimalinvasive Ansatz könnte zur besseren präoperativen Diagnostik beitragen und Präzisionstherapien auch bei Patienten ermöglichen, die nicht operiert werden können [81‐83]. Andere Detektionsmethoden (z. B. aus Liquor oder Blut) sind bisher noch in frühen Forschungsstadien.

Zukünftig ist zu erwarten, dass die Sequenzierung von Hirngewebe eine zusätzliche Modalität in der prä- und postoperativen Versorgung von Epilepsiepatienten sein wird. Erste Anbieter für die epilepsiespezifische somatische Variantendetektion sind bereits verfügbar. Die Implementierung und Auswertung erfordert interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Epileptologie, Neuropathologie, Neurochirurgie, Genetik, und Bioinformatik. Mit sinkenden Sequenzierkosten und verbesserten Analysen wird diese Technologie zunehmend für die klinische Routine zugänglich gemacht werden (vergleiche Infobox 4).