Ex-vivo-Stammzellgentherapie an der Haut

EB ist eine monogenetische Erkrankung, bei der genetische Veränderungen bzw. Mutationen in Genen, aus denen Strukturproteine der Haut gebildet werden, zu dessen Verlust der stabilisierenden Funktion führen [6]. Diese Strukturproteine befinden sich innerhalb der sog. Basalmembranzone der Haut, die die Oberhaut (Epidermis) mit der darunterliegenden Lederhaut (Dermis) verankert. Fehlt eines dieser Proteine bzw. ist dessen Funktion eingeschränkt, hat dies eine destabilisierende Wirkung auf die Hautintegrität. Blasen an der Haut und den Schleimhäuten, begleitet von Schmerz und Juckreiz, sind die Folge. Die Hauterkrankung EB kann in 4 Untergruppen unterteilt werden:

Bei den schweren EB-Formen gelten Plattenepithelkarzinome, die präferenziell in chronischen Wunden entstehen, als Hauptgrund für die hohe Mortalitätsrate [18]. Der Schweregrad der Erkrankung steht im engen Zusammenhang mit dem betroffenen Gen bzw. dem daraus resultierenden Protein und die Art und Position der kausalen genetischen Veränderung im Gen. Die häufigste EB-Form EBS macht ca. 85 % aller EB-Fälle aus. Hier sind in der Regel heterozygot vererbte dominant-negative Mutationen in den Keratin-Genen 5 und 14 verantwortlich für die Erkrankung. Die junktionale Form der EB (JEB) mit einer Prävalenz von 1:350.000 bzw. die rezessiv dystrophe Form der EB (DEB, Prävalenz: 1:50.000 bis 1:1.000.000) stellen, wenn man den Phänotyp betrachtet, die schwersten EB-Formen dar [6]. JEB wird rezessiv vererbt und durch Mutationen in den Genen für Laminin (LAMB3, LAMA3, LAMC2) und Integrin (ITGA6, ITGB4) sowie im COL17A1-Gen verursacht. Mutationen im COL7A1-Gen führen zu DEB, wobei die rezessive Form (RDEB) mit einer geringen Expression oder vollständigen Abwesenheit des Kollagen-VII-Proteins in der Haut einhergeht. Das Kindler-Syndrom ist eine seltene EB-Form, die durch rezessive Mutationen im KIND1-Gen verursacht wird, was zur Abwesenheit des Kindlin-1-Proteins in der Haut führt [6].

Die einzige Möglichkeit, die genetische Ursache einer erblichen Erkrankung kausal zu bekämpfen, ist die Durchführung einer somatischen Gentherapie. Erste klinische Studien für die junktionale Form der EB zeigen bereits, dass eine lokale Heilung am Patienten durch die Transplantation von korrigierter Haut möglich ist [2, 11, 17]. Auf dem Weg vom betroffenen Gen zum daraus resultierenden defizienten Protein kann auf verschiedenen Ebenen eine Genkorrektur und somit eine Verbesserung oder Umkehrung des Krankheitsbildes erreicht werden. Als Beispiel ist hier die Genersatztherapie zu nennen.

Die Genersatztherapie ist bis jetzt die einzige klinische Anwendung mit Langzeitwirkung, bei der die Funktion des betroffenen Gens wiederhergestellt werden kann. Bei der klassischen Ex-vivo-Genersatztherapie wird das mutierte Gen durch eine zusätzlich in die Zelle eingebrachte gesunde Genkopie ergänzt, wodurch wieder ein funktionelles Protein gebildet wird. Für Aufsehen sorgte kürzlich eine Transplantation von genetisch korrigierten epidermalen Stammzellen bei einem 7‑jährigen Patienten, der an der Universitätsklinik Bergmannsheil in Bochum behandelt wurde [11]. Bei dem jungen Patienten wurde die junktionale Form der EB diagnostiziert, bei der das LAMB3-Gen mutiert ist. Das LAMB3-Gen kodiert für einen der Komponenten des Laminin-332-Proteins, das zur Stabilität der Haut im Bereich der Basalmembranzone beiträgt [6]. Eine schwere bakterielle Infektion 2015 führte zum Ablösen von über 60 % der Haut des Jungen. Eine in kurzer Zeit initiierte Ex-vivo-Genersatztherapie diente als lebensrettende Maßnahme, bei der über 80 % seiner Haut rekonstruiert werden konnten [11]. Diese klinische Anwendung untermauerte das große Potenzial einer Ex-vivo-Gentherapie für die Behandlung von Patienten, die unter der blasenbildenden Hauterkrankung EB leiden. Auch 3 Jahre nach der Applikation ist die Haut des Patienten an den behandelten Stellen intakt (Dr. Michele De Luca, persönliche Kommunikation).

Aufgrund der vielversprechenden Erkenntnisse, die in den Studien mit JEB-Patienten gewonnen wurden [2, 11, 17], wurde ein ähnlicher Ansatz für die dystrophe Form der EB untersucht [22]. Über Hautbiopsien gewonnene Zellen der Haut wurden mit einem retroviralen Vektor behandelt, der eine komplette COL7A1-Genkopie beinhaltet. Aus den korrigierten Zellen generierte Hautschichten zeigten eine Wiederherstellung der Ankerfibrillen, die für den Zusammenhalt von Epidermis und Dermis wichtig sind und von Kollagen VII aufgebaut werden [21]. Eine erste Phase-I/II-klinische Studie unterstreicht zwar das Potenzial der Applikation, zeigte aber auch eine progressive Verringerung der Kollagen-VII-Produktion innerhalb des ersten Jahres nach der Transplantation [22]. Dieses Phänomen wurde bei den 3 behandelten JEB-Patienten nicht beobachtet, was zur Annahme führt, dass der Erfolg einer Ex-vivo-Genersatztherapie entscheidend vom zu ergänzenden Gen und folglich von der jeweiligen EB-Form abhängt.

Entscheidend für den langfristigen Erfolg einer Ex-vivo-Gentherapie ist die Korrektur von epidermalen Stammzellen der Haut. Die Anzahl der epidermalen Stammzellen nimmt im Alter bzw. durch die wiederkehrenden Blasenbildungen und chronischen Wunden, speziell in den schweren EB-Formen, sukzessive ab. Obwohl ältere EB-Patienten auch weiterhin eine neue Epidermis ausbilden können, wird es mit zunehmendem Alter immer schwieriger, ausreichend epidermale Stammzellen für eine folgende autologe Stammzelltherapie aus der Haut zu gewinnen [4].

Die enormen Kosten, die mit einer Genersatztherapie einhergehen [8], bzw. die theoretischen Gefahren, die von den viralen Vektoren ausgehen, die für die Geneinbringung verwendet werden [9], begünstigen aber die Entwicklung kostengünstigerer bzw. potenziell sicherer gentherapeutischer Anwendungen am Patienten. Aufgrund der Notwendigkeit einer stabilen Einbringung der Genkopie in das Wirtsgenom der Zielzellen wird bei der klassischen Ex-vivo-Genersatztherapie ein integrierender Vektor verwendet. Als Beispiele sind hier das Gammaretrovirus und das Lentivirus anzuführen. Da die virale Integration eher zufällig abläuft, können Gene im Bereich der Integration gestört oder deren Expression beeinflusst werden, wodurch eine Aktivierung von Protoonkogenen potenziell stattfinden kann. Obwohl bislang keine Tumorentwicklung bei den behandelten JEB-Patienten beobachtet wurde [5], bedarf es einer engmaschigen Kontrolle der transplantierten Hautregionen. Zur Jahrtausendwende führte eine gentherapeutische Behandlung mittels eines retroviralen Vektors von 5 an X‑SCID („severe combined immunodeficiency“) erkrankten Kindern zu Fällen von Leukämie [9]. Grund dafür war die virale Integration im Bereich eines Protoonkogenlokus und dessen Transaktivierung.

Moderne Gentherapieansätze basieren auf einer Designer-Nukleasen-vermittelten Genkorrektur, die ganz ohne den Einsatz von viralen Vektoren auskommen kann. Hierbei wird keine zusätzliche Genkopie in die Zelle eingebracht, sondern die Genkorrektur direkt im vorhandenen Erbgut der Zelle vollzogen. Im Gegensatz zur Genersatztherapie, bei der der Großteil an Patienten mit genetischen Veränderungen in einem betroffenen Gen behandelt werden kann, wird bei der über Designer-Nukleasen vermittelten Gentherapie präferenziell mutationsspezifisch und somit patientenspezifisch agiert. Mit anderen Worten: Es werden gentherapeutische Ansätze für definierte Patientengruppen bzw. individuelle Patienten entwickelt. Der Einsatz von Nukleasen als Gentherapiewerkzeuge begann in den 1990er-Jahren mit der Entwicklung von genspezifischen Zinkfingernukleasen, die in weiterer Folge in vielen Einsatzgebieten aufgrund der erhöhten Spezifität und Effizienz von TALENs („transcription activator-like effector nuclease“) [1, 15, 19] verdrängt wurden. Die kürzlich (2012) entdeckten CRISPR („clustered regularly interspaced short palindromic repeats“)/Cas9(„CRISPR associated protein 9“)-Nukleasen stellen aktuell vielleicht die am vielseitigsten einsetzbaren Gene-editing-Werkzeuge dar. Der grundlegende Reparaturmechanismus, der zur Korrektur von Erbschäden (oder Mutationen) führt, wird durch das spezifische Andocken der Nuklease im Bereich der genetischen Veränderung und in weiterer Folge durch das Schneiden der DNA (Desoxyribonukleinsäure) an dieser Stelle initiiert. TALENs sowie die CRISPR/Cas9-Nukleasen wurden bereits für therapeutische Ansätze für ausgewählte Genodermatosen als Gene-editing-Werkzeuge ausgewählt. Darunter fallen die monogenetischen Hauterkrankungen EB [1, 3, 10, 12, 13], epidermolytische Palmoplantarkeratose [14] oder epidermolytische Ichthyose [15]. Gene-Editing mittels Designer-Nukleasen ermöglicht einerseits die Deletion von Genen, in denen eine dominant-negative Mutation den Phänotyp am Patienten verursacht [1, 15], aber auch die potenziell spurenlose Reparatur von Mutationen über die sog. homologe Rekombination (HR) [10, 12, 13].

Analog zur Genersatztherapie ist bei der Designer-Nukleasen-vermittelten Gentherapie eine einmalige Anwendung am Patienten ausreichend, da die Genkorrektur direkt im Erbgut erfolgt und somit langlebig ist. Auch hier werden Hautstammzellen vom Patienten gewonnen und dann folglich unter Zellkulturbedingungen mit den entsprechenden Nukleasen behandelt [16]. Anders als bei der Genersatztherapie, bei der die Zellen mit viralen Partikeln behandelt werden, die die zu ergänzende Genkopie beinhalten, kann hier die Einbringung der Nukleasen in die Zellen z. B. über die Methode der Elektroporation erfolgen [3]. Diese Art der Zellbehandlung geht bis dato mit einer hohen Genkorrektureffizienz und einem vielversprechenden Sicherheitsprofil einher.

Generell ist bei allen Gentherapiewerkzeugen, die das Erbgut verändern, äußerste Vorsicht geboten, und es bedarf vorab einer gründlichen Sicherheitsanalyse der generierten Reparaturmoleküle. Gerade bei Nukleasen ist bekannt, dass diese auch an ungewünschten Orten im Erbgut (oder Genom) schneiden können [7, 12, 13, 24, 25]. Aus diesem Grund wird aktuell intensiv am Einsatz potenziell sicherer Nukleasen [12, 13, 20] bzw. an sensitiveren Analysemethoden [23, 25] gearbeitet, um diese möglichen Nebenwirkungen, auch Off-Targets genannt, im Erbgut aufspüren zu können.

Durch die stetige Entdeckung und Weiterentwicklung von Designer-Nukleasen als gentherapeutische Werkzeuge gewinnt das Schlagwort personalisierte Therapie immer mehr an Bedeutung. Die mutations- und daher patientenspezifische Herstellung von Nukleasen kann in einer relativ kurzen Zeitspanne von wenigen Wochen erfolgen, was vor 10 Jahren noch undenkbar war. Trotz dieser vielversprechenden Entwicklungen im Bereich des Gene-Editing in den letzten Jahren muss man erste klinische Studien für andere schwere Erkrankungen (s. https://​clinicaltrials.​gov/​) abwarten, um wichtige Erkenntnisse zum Thema Effizienz und Sicherheit zu erhalten. Zu diesen Erkrankungen zählen diverse Krebsformen wie Leukämie oder Tumoren des Magen-Darm-Traktes, die erbliche Erkrankung des roten Blutfarbstoffes β‑Thalassämie oder HIV(„human immunodeficiency virus“)-Infektionen.

Zusammenfassend kann die Genersatztherapie als Pionier der Ex-vivo-Gentherapie für Genodermatosen gesehen werden. Speziell bei der junktionalen Form der EB konnten in 3 unabhängigen Studien eine hohe Effizienz und Sicherheit gezeigt werden [2, 11, 17], wobei ein langfristiges Follow-up notwendig ist, um etwaige Nebenwirkungen der Behandlung studieren zu können. Erste Experimente und Studien haben aber gezeigt, dass jedes zu korrigierende Gen bzw. die Vererbung (dominant oder rezessiv) der vorliegenden Mutation einen wesentlichen Einfluss auf die Durchführung einer autologen Ex-vivo-Genersatztherapie hat. Gerade bei diesem Punkt kommen Designer-Nukleasen wie CRISPR/Cas9 ins Spiel, die punktuell die Korrektur von genetischen Veränderungen induzieren können. Obwohl Gene-Editing noch nicht in der Klinik praktiziert wird, liefern erste Studien im Labor vielversprechende Resultate. Neben der Effizienz der Methode ist im Hinblick auf eine klinische Anwendung v. a. die Sicherheit ein wichtiger Aspekt. Die Wahl der oben genannten Gentherapiemethode hängt von der Genodermatose und von der Art der Mutation ab. Die gewählte Therapiemethode soll aber 2 wesentliche Punkte im Endeffekt vereinen können: Effizienz und Sicherheit!