Forensische DNA-Methylierungsanalyse

Von 3 freiwilligen Probanden aus Deutschland (chronologisches Alter: 23,49 Jahre [weiblich]; 43,99 Jahre [männlich] und 44,87 Jahre [weiblich]) wurde Blut in Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA)-Röhrchen entnommen. Die Studie wurde von der Ethik-Kommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg genehmigt (Nr. 394/19) und mit dem schriftlichen Einverständnis der Probanden durchgeführt. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurde für jedes der teilnehmenden Labore je ein Tupfer (Fa. Sarstedt, Nümbrecht) mit 100 µl Blut des jeweiligen Probanden angefertigt. Zudem wurden 2 ml EDTA-Blut/Proband direkt mit einem modifizierten Protokoll des QIAamp® DNA Mini Kit (Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert und jedem Labor 100 µl DNA-Extrakt zur Verfügung gestellt. Die Methode zur DNA-Extraktion aus den Wattetupfern und zur Quantifizierung innerhalb der Labore wurde nicht vorgegeben und konnte individuell gewählt werden. Neben den Personenproben erhielten die Labore aus methylierten und unmethylierten DNA-Standards (Fa. Zymo Research Europe, Freiburg, Deutschland) hergestellte Kontroll-DNA-Mischungen (10 % DNAm, 50 % DNAm, 90 % DNAm). Die DNA-Konvertierung erfolgte mithilfe des EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit (Fa. Qiagen) laut Herstellerangaben (Ausnahme in einem Labor: EZ DNA Methylation Kit; Fa. Zymo Research). Die Tupfer, die bereits extrahierte DNA sowie die benötigten Primer und Protokolle wurden an alle Labore gleichzeitig versendet. Zusätzlich erhielten die Labore ein Auswerteformular, um neben den gemessenen DNAm-Werten Informationen zum Versuchsablauf (z. B. eingesetzte Tupfermenge) festzuhalten und damit mögliche Schwankungen besser identifizieren zu können.

Mithilfe des Assays wurden 5 altersabhängige CpG-Positionen analysiert, wobei das Assay und 4 der 5 Positionen vom 1. RV übernommen wurden [11, 18]. Der aktuelle RV wurde um den Marker ELOVL2 erweitert und das Reaktionsvolumen der Multiplex-PCR im Vergleich zum 1. RV halbiert. Die PCR- und der Minisequenzierung-Primer von ELOVL2 wurden der Literatur entnommen [3], wobei der (TG)-Primer-Überhang am 5′-Ende beim Minisequenzier-Primer für das Assay in der Länge angepasst wurde ([TG]₇). Für die Pyrosequenzierung wurden neue Primer erstellt und am „reverse PCR primer“ ein Biotin angehängt (Tab. 1). Durch das finale Assay werden folgende altersabhängige CpG-Positionen (GRCh38.p12) untersucht: PDE4C (chr 19: 18233128), EDARADD (chr 1: 236394371), SST (chr 3: 187669863), KLF14 (chr 7: 130734356), ELOVL2 (chr 6: 11044628). Mit Ausnahme von ELOVL2 handelt es sich hierbei um das Cytosin vom Antisense-DNA-Strang. Sowohl die Singleplex-PCR für die Pyrosequenzierung als auch die Multiplex-PCR für die Minisequenzierung wurden mit dem PyroMark PCR Master Mix (Fa. Qiagen) durchgeführt. Für die Minisequenzierung wurden die PCR-Produkte mithilfe von ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup Reagent (Fa. Thermo Fisher Scientific [TFS], Waltham, MA, USA) oder der rAPid Alkaline Phosphatase (1 U/µl; Fa. Roche, Basel, Schweiz) in Verbindung mit der Exonuclease I (20 U/µl; Fa. New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) enzymatisch aufgereinigt. Die „Single-base-extension“-Reaktion wurde in einem Ansatz von 5,5 µl mit dem SNaPshot™ Multiplex Kit (Fa. TFS) mit 25 Zyklen (10 s bei 96 °C, 5 s bei 55 °C, 30 s bei 60 °C und anschließend 10 min bei 60 °C) durchgeführt und das Sequenzierprodukt mit der rAPid oder Shrimp Alkaline Phosphatase (Fa. TFS) aufgereinigt. Die Sequenzierung erfolgte auf dem 3130/3130xl oder 3500/3500xl Genetic Analyzer (Längenstandard: GeneScan™ 120 LIZ™; Fa. TFS). Die Pyrosequenzierung erfolgte laut Herstellerprotokoll entsprechend dem verwendeten Gerät (PyroMark Q24/Q24 Advanced, PyroMark Q48; alle Fa. Qiagen).

Die DNAm an der jeweiligen Position wurde bei beiden Methoden jeweils aus dem Quotienten der Signale für ursprünglich methylierte und unmethylierte Moleküle berechnet. Die Signale basieren in beiden Fällen auf Fluoreszenzsignalen, wobei es sich bei der Minisequenzierung um relative Fluoreszenzeinheiten („relative fluorescence units“, RFU) der eingebauten farblich markierten Nukleotide handelt und bei der Pyrosequenzierung um quantitative Fluoreszenzsignale, die mit der Menge an freigesetztem Pyrophosphat beim Baseneinbau gekoppelt sind. Bei der Minisequenzierung erfolgt die Berechnung der DNAm manuell und bei der Pyrosequenzierung automatisiert über die Software. Die vollständige Konvertierung aller unmethylierten Cytosine wurde über die Konvertierungseffizienz verschiedener Cytosine außerhalb eines CpG-Kontextes, die unmethyliert vorliegen und somit vollständig konvertiert werden müssten, kontrolliert (Konvertierungseffizienz = 100 % − DNAm%). Da bei der Minisequenzierung nur eine einzelne Basenposition und nicht wie bei der Pyrosequenzierung ein gesamter DNA-Abschnitt sequenziert wird, wurden hier zusätzlich 2 Nicht-CpG-Positionen in den Amplikons von EDARADD und PDE4C analysiert.

Die Extraktion der DNA vom gesamten oder von einem Teil des Tupfers erfolgte in allen Laboren mit kommerziellen Kits, die auf der Säulen- oder „Bead“-Extraktion basieren (Tab. 2). Die DNA-Ausbeute aus den Tupfern zeigte große Schwankungen, wobei mehr DNA aus den auf „magnetic beads“ basierenden Methoden erhalten wurde (Abb. 2a), unabhängig vom Anteil des eingesetzten Tupfers (Abb. 2b). Die direkt versendete DNA wies ebenfalls in den Quantifizierungen Differenzen auf (Mittelwerte mit Standardabweichung: DNA-Extrakt 1: 22,29 ± 8,42 ng/µl, DNA-Extrakt 2: 16,15 ± 5,16 ng/µl, DNA-Extrakt 3: 34,09 ± 12,74 ng/µl), sodass ein Teil der beobachteten Schwankungen bei der DNA-Ausbeute auch auf technische Variationen bei der Quantifizierung zurückzuführen ist. Die Auswertung zeigt zudem, dass Proband 3 bei der Blutabnahme die höchste Anzahl kernhaltiger Leukozyten besaß, da sowohl im versendeten DNA-Extrakt 3 als auch in den DNA-Extraktionen aus Tupfer 3 meist die höchste DNA-Menge erhalten wurde (Abb. 2b).

Der Erfolg der Bisulfitkonvertierung bzw. die „recovery“, also die Menge an erhaltener konvertierter DNA nach der Bisulfitbehandlung, wurde in 7 Laboren untersucht. Dabei maßen 3 Labore die erhaltene einzelsträngige DNA (ssDNA) mithilfe fotometrischer oder fluorometrischer Verfahren. Vier Labore quantifizierten die noch verbliebene doppelsträngige DNA (dsDNA), deren Vorhandensein auf eine unvollständige Konvertierung hinweist, da die DNA nach der Bisulfitkonvertierung einzelsträngig vorliegt. Von keinem der Labore wurden Hinweise auf eine fehlgeschlagene Konvertierung gefunden, jedoch wurde bei der Messung der ssDNA mithilfe des Qubit® (Fa. TFS) in einem Labor im Anschluss der Bisulfitkonvertierung eine höhere DNA-Menge gemessen, als ursprünglich für die Konvertierung genutzt wurde (s. Abschn. „Diskussion“).

Die Überprüfung der Bisulfitkonvertierung anhand der Kontrollmarker in der Minisequenzierung zeigte keine systematischen Probleme bei der Konvertierung selbst. Zwar detektierten 2 Labore an den Kontrollpositionen Nachweis-Peaks für unkonvertierte DNA, diese konnten jedoch als hohe Hintergrundfluoreszenz (Peaks nicht gut von der Basislinie abgrenzbar) bzw. Geräteartefakt (kein Peak bei Wiederholung auf anderem Gerät) identifiziert werden. Bei der Pyrosequenzierung führt die Software die Kontrolle der vollständigen Konvertierung auf Basis voreingestellter Schwellenwerte automatisch durch und gibt dem Anwender auf dieser Basis einen qualitativen Hinweis zum Erfolg der Konvertierung. Manuell kann man zudem die Peak-Höhen im Pyrogramm auswerten, um die Konvertierungseffizienz zu bestimmen.

Anhand der berechneten Konvertierungseffizienz konnte qualitativ kein Unterschied zwischen den verschiedenen Extraktionsverfahren beobachtet werden. Alle Methoden generierten „saubere“ DNA ohne Inhibition für die Bisulfitkonvertierung. Ebenfalls konnten keine Unterschiede zwischen den Ergebnissen der identisch extrahierten Blutproben (DNA-Extrakte 1, 2, 3) und individuell extrahierten Blutproben (Blute 1, 2, 3) festgestellt werden.

Die verwendeten Methoden und Geräte werden im Folgenden am Beispiel der versendeten DNA-Extrakte und nicht der Blutproben verglichen, um den potenziellen Einfluss der abweichenden Extraktionsmethodik auszuschließen. Die Ergebnisse der Minisequenzierung zeigten v. a. bei PDE4C und EDARADD größere Schwankungen im Vergleich zu der Pyrosequenzierung (Abb. 7).

Geräteabhängig (3130 vs. 3500 und Q48 vs. Q24/Q24 Advanced) zeigten sich sowohl in der Mini- als auch der Pyrosequenzierung v. a. in EDARADD Unterschiede; diese waren z. T. in den anderen Markern nur als Tendenz zu beobachten: Die Ergebnisse vom Genetic Analyzer 3500/3500xl lagen im niedrigeren Bereich der mithilfe der Minisequenzierung gemessenen DNAm-Werte. Die PyroMark-Q24/Q24-Advanced-Werte befanden sich eher im oberen Spektrum im Vergleich zu den DNAm-Werten des PyroMark Q48. Ob dies tatsächlich gerätespezifische Effekte sind, lässt sich bei je nur 2 Laboren, die einen Genetic Analyzer 3500/3500xl bzw. PyroMark Q24/Q24Advanced verwendeten haben, nicht feststellen.

Replikatanalysen wurden vereinzelt durchgeführt. Duplikatwerte der DNAm-Analyse wurden für die Minisequenzierung von 3 (Blutproben) bzw. 4 (DNA-Extrakte) Laboren eingereicht und für die Pyrosequenzierung von 4 (Blutproben) bzw. 5 (DNA-Extrakte) Laboren. Es fanden sich laborabhängig verschieden starke Schwankungen in den DNAm-Werten für die Replikate und somit Reproduzierbarkeit der DNAm-Werte. Es wurden sowohl für die Minisequenzierung also auch für die Pyrosequenzierung Schwankungen bis zu 8 DNAm% gemessen. Wie bereits erwähnt, wurde zusätzlich aufgrund einer sehr geringen DNA-Menge in der Zweitanalyse in einem Fall eine Schwankung von 21 DNAm% (Minisequenzierung) festgestellt. Bei den Replikaten der DNA-Extrakte blieben mit einigen Ausnahmen die Schwankungen fast immer unter 5 DNAm%. So wurde bei der Minisequenzierung eine Schwankung von 6 DNAm% (PDE4C) bzw. der Pyrosequenzierung insgesamt 3‑mal ein Unterschied von mehr als 5 DNAm% (9 und 8 % in ELOVL2, 6 % in PDE4C) gemessen. Hierbei scheint es sich jedoch eher um Ausreißer zu handeln.

Das Ziel des RV war, wie im 1. RV, die Untersuchung der technischen Schwankungen bei Verwendung verschiedener Geräte und Methoden. Daher wurden für den RV bereits in verschiedenen Laboren und Studien etablierte altersabhängige DNAm-Marker ausgewählt. Die dadurch erhaltene Kombination der analysierten Positionen wurde bisher nicht in einem Modell für die Altersschätzung berücksichtigt. Um einen Einblick zu erhalten, welchen Effekt die Schwankungen bei den Messungen im 2. RV auf eine Altersschätzung haben könnten, wurde auf Basis von noch nicht publizierten Blut-DNAm-Daten (MPS-Daten auf Basis von 4 der 5 CpG-Positionen sowie bei PDE4C eine Nachbarposition [chr 19: 18233105], wie auch in der Studie von Weidner et al. 2014 [20]) verwendet und damit ein vorläufiges Modell unter Verwendung der „Random-forest“-Regression erstellt. Es ist zu berücksichtigen, dass das Modell auf einer sehr geringen Zahl von Trainingsdaten basiert und nur einen Probanden jünger als Person 2 beinhaltet (16 Probanden zwischen 21 und 60 Jahren). Da alle Labore dieselben Proben analysierten, können die erhaltenen Abweichungen zwischen den Laboren jedoch alleinig auf technische Unterschiede zurückgeführt werden und sind unabhängig von der Genauigkeit des Modells. Da die Altersschätzung unter Nutzung dieses Modells nur einen Einblick über die zu erwartenden Schwankungen bei der Altersschätzung auf Basis der in dem RV erhaltenen DNAm-Werte und der Messschwankungen geben soll, wurde zur Bewertung nicht die mittlere absolute Abweichung zum realen Alter gemessen, sondern die mittlere absolute Abweichung („median absolute deviation“, MAD) zum Mittelwert der Altersschätzungen. Eine Altersschätzung war nur möglich, wenn ein Labor zu einer Probe alle 5 DNAm-Werte detektieren konnte. Wie bereits an den DNAm-Werten erkennbar, ergab sich kein systematischer Unterschied zwischen der Verwendung von Blut oder bereits extrahierter DNA aus Blut (Abb. 8). Zudem zeigte sich, dass mit beiden Detektionsmethoden gute Schätzungen erhalten werden können und technisch bedingte Abweichungen sowohl mit der Pyro- als auch der Minisequenzierung auftreten (Tab. 3).

Vier Labore führten zusätzlich Altersschätzungen mit eigenen Assays und Modellen durch, wobei 2 Labore die Technik der MPS und 2 Labore die Pyrosequenzierung nutzten. Die Modelle für die Altersschätzungen unterschieden sich in den 4 Laboren in Bezug auf die Auswahl und Kombination der Marker sowie Umfang und Auswahl der Probenkollektive für die Ermittlung der Referenzdaten ([8, 10, 16, 17]; Tab. 4). Jeweils mit dem entsprechenden Modell konnte Labor 5 mithilfe der MPS alle Proben und Labor 9 mithilfe der Pyrosequenzierung 5 der 6 Proben innerhalb eines Fehlerbereiches von ± 5 Jahren schätzen. Die Altersschätzung von Labor 4 mithilfe der MPS führte zu einer Überschätzung des Alters aller Proben. Labor 4 verwendete den von Heidegger et al. [10] geschilderten Assay-Prototyp sowie das dort beschriebene statistische Modell in Kombination mit einer laboreigenen, im Vergleich zu Heidegger et al. [10] abgewandelten, Probenaufbereitung. Da ein Einfluss einer methodeninduzierten Verzerrung, insbesondere durch die Bisulfitkonvertierung, noch nicht umfassend evaluiert wurde, wird an dieser Stelle die Wichtigkeit der Überprüfung des statistischen Modells in Bezug auf die laborinternen Abläufe sowie eine ggf. erforderliche Anpassung des Modells hervorgehoben. Dies ist derzeit u. a. Forschungsgegenstand im assoziierten Konsortium. Die Altersschätzungen in Labor 12 wichen z. T. sehr stark vom tatsächlichen Alter ab. Dabei konnte keine Systematik der Abweichung in Bezug auf den untersuchten Probanden oder das Probenmaterial (Extrakt oder Blut) festgestellt werden.

Die erhaltenen Ergebnisse des aktuellen RV beziehen sich nur auf Blutproben. Bei einem anderen Probenmaterial wie Speichel oder Wangenschleimhautabrieben könnten aufgrund der Zellzusammensetzung oder der inhomogenen Verteilung des Zellmaterials (Viskosität beim Speichel, ungleiche Materialantragung bei Wangenschleimhautabrieben) bereits durch das Probenmaterial selbst höhere Schwankungen auftreten. Um das Ausgangsmaterial im diesjährigen RV möglichst homogen zu halten, wurde daher Blut, das zudem in ausreichender Menge von den Probanden erhalten werden konnte, für den RV verwendet. Zusätzlich wurde bereits extrahierte DNA (auch aus Blut der 3 Probanden) an alle Labore versendet, um mögliche Unterschiede bei der Schwankungsbreite der gemessenen DNAm-Werte, bedingt durch die Extraktionen in den Laboren, besser zu identifizieren.

Alle Labore verwendeten in der Forensik etablierte kommerzielle Kits zur DNA-Extraktion, die sich neben den einzelnen Reagenzien vor allen Dingen in der Extraktionstechnik (säulenbasiert oder mithilfe von Magnetic beads) unterschieden. Keines der verwendeten Kits hatte einen inhibitorischen Einfluss auf die Bisulfitkonvertierung; alle untersuchten Proben wurden vollständig konvertiert. Eine inkomplette Konvertierung im Bereich der Primer-Bindungsstelle könnte zum Verlust des Nachweises einzelner Moleküle führen, da diese nicht amplifiziert werden würden. Der generelle Erfolg der PCR und damit auch einer erfolgreichen Konvertierung der DNA kann mithilfe der Gelanalyse nach der PCR überprüft werden. Die Verwendung verschiedener Extraktionstechniken kann jedoch zu Unterschieden bei der DNA-Ausbeute führen, da manche Extraktionsprotokolle auf eine möglichst hohe DNA-Ausbeute abzielen, während andere den Schwerpunkt auf eine Extraktion „sauberer“ DNA mit optimaler Entfernung von Inhibitoren setzen und der oft dadurch höhere Verlust an DNA einkalkuliert wird. Grundsätzlich hat die DNA-Menge, die für eine quantitative DNAm-Analyse eingesetzt wird, einen Einfluss auf die Genauigkeit der DNAm-Analyse. Optimalerweise sollten mindestens 10 ng konvertierte DNA eingesetzt werden [15]. Im aktuellen RV standen 100 µl Blut zur Verfügung, die ausreichend Material für die geplanten Analysen enthalten sollten. Allerdings zeigten sich bei einigen Laboren sehr schwankende und niedrige Extraktionseffizienzen. Diese Ergebnisse machen deutlich, wie wichtig nicht nur das Wissen über die Ausgangsmenge genomischer DNA, sondern auch über die in die PCR eingesetzte Menge konvertierter DNA ist. Da die Konvertierung jedoch ein maximales Volumen von 40 µl DNA-Extrakt erlaubt, könnte eine Elution in ein kleineres Volumen nach der Extraktion von Vorteil sein. Ein Labor beobachtete jedoch auch, dass die Verwendung einer zu hohen Menge an konvertierter DNA in der anschließenden PCR zu Hemmungen führen kann. Für eine wirklich genaue Quantifizierung bisulfitkonvertierter DNA ist jedoch eine für bisulfitkonvertierte DNA spezifische quantitative (q)PCR nötig, die derzeit nicht kommerziell verfügbar ist. Als Näherungswert kann die einzelsträngige DNA direkt oder indirekt über fotometrische oder fluoreszenzbasierte Verfahren gemessen werden. Dass es sich dabei aber tatsächlich nur um Näherungswerte handelt, zeigen die Ergebnisse der fluorometrischen Analyse eines RV-Teilnehmers, der eine größere Menge an konvertierter DNA maß als ursprünglich in die Konvertierung eingesetzt wurde. Dies kann auf eine Unterschätzung der ursprünglich eingesetzten DNA-Menge zurückzuführen sein, aber auch an Rest-dsDNA liegen, die unspezifisch mitgemessen wurde. Zu bedenken ist außerdem, dass diese Methodik keine Aussage über die Degradierung der DNA durch die Bisulfitkonvertierung ermöglicht. Im direkten Vergleich von extrahierter DNA mit den Blutproben finden sich im Mittel über die 3 Personen und alle Labore Abweichungen zwischen den DNAm-Werten aus dem Blut vs. DNA-Extrakt von ± 2,0 DNAm% (Minisequenzierung) und 2,2 DNAm% (Pyrosequenzierung). Vereinzelte Ausreißer konnten beobachtet werden, im Ganzen weisen die Ergebnisse jedoch eine gute Übereinstimmung zwischen Blut und DNA-Extrakt bei beiden Methoden auf.

Schwankungen zwischen erhaltenen DNAm-Werten können durch Messschwankungen bei wiederholter Analyse, die Analyse in unterschiedlichen Laboren mit verschiedenen Geräten und durch methodische Unterschiede entstehen. Schwankungen zwischen den Laboren und den Methoden haben sich auch im 1. RV gezeigt [11]. Eine Analyse von Replikaten, die die Messgenauigkeit innerhalb eines Labors widerspiegelt, erfolgte nur von einigen Laboren. Die erhaltenen Ergebnisse stellen somit vorerst Einzelbeobachtungen dar und müssen verstärkt untersucht werden. Im aktuellen RV wurde zuvor nicht festgelegt, ab welchem Schritt das Replikat durchgeführt werden muss. Bei einer Wiederholung ab der Extraktion ist mit einer größeren Schwankung als bei einer Wiederholung der PCR und Sequenzierung zu rechnen. Zudem wären Triplikate von Vorteil, um Ausreißer von technischen Schwankungen zu unterscheiden. Innerhalb einer Validierung im Labor ist jedoch ein systematischer Vergleich von Mehrfachreplikaten zu verschiedenen Zeitpunkten aus komplett neuen Analysen notwendig, um die im Labor zu erwartenden Schwankungen zu bestimmen.

Bei der Minisequenzierung zeigten sich insbesondere bei PDE4C, EDARADD (Personen 1 und 2) sowie bei ELOVL2 (Personen 1 und 3) höhere absolute DNAm-Schwankungen als bei SST und KLF14 sowie bei Person 2 in ELOVL2 und bei Person 3 in EDARADD mit einem niedrigeren DNAm-Wert. Mit abnehmender Ausgangsmenge an DNA und bei Markern mit einer DNAm um 50 % ist jedoch aus stochastischen Gründen (Binomialverteilung) immer mit höheren Schwankungen zu rechnen [15]. Diese Unterschiede sind auch, jedoch weniger stark ausgeprägt, bei der Pyrosequenzierung zu beobachten. Bei DNAm-Werten im mittlerem Bereich (25–75 %) zeigt sich jedoch, dass die Minisequenzierung gegenüber der Pyrosequenzierung bei ELOVL2 eher einen geringeren DNAm-Wert misst, aber bei den Markern PDE4C und EDARADD mit DNAm-Werten über 25 % einen höheren Wert erreicht (Abb. 7). Dieser Effekt kann durch eine stärkere RFU des roten (unmethyliert bei ELOVL2) im Vergleich zum gelben, und des blauen (methyliert bei PDE4C und EDARADD) im Vergleich zum grünen Farbkanal begründet sein.

Im Vergleich zum 1. RV war bei der Minisequenzierung insgesamt eine geringere Variabilität bei allen Markern festzustellen. Neben dem Erfahrungsgewinn aus dem 1. RV könnte dies v. a. an der Verwendung der gleichen Reagenzien liegen. Bei der Pyrosequenzierung wiesen die Schwankungen keine solche Veränderung auf, was auch daran liegen könnte, dass die Labore, die die Pyrosequenzierung nutzen, bereits im 1. RV identische Reagenzien für die PCR verwendet haben.