Hyaluronsäuregele zur Druckregulierung in der Glaukomtherapie

Die Herstellung von Hydrogelen aus HA erfordert zunächst eine chemische Modifizierung, sodass die einzelnen HA-Moleküle durch Vernetzer verknüpft werden können und ein Hydrogel bilden. Hierzu wurde HA mit unterschiedlichen Molekulargewichten (MW_HA) nach Shu et al. [29] thioliert, sodass zur anschließenden Gelbildung Vernetzer mit Acrylatgruppen verwendet werden können. In den folgenden Versuchen kam Hyaluronsäure mit einem Thiolierungsgrad (TG) von typischerweise 15–65 % und N,N’-Methylenbis(acrylamid) (MBA) als Vernetzer zum Einsatz. Die HA wurde zur besseren Beobachtung durch Fluoreszenzmikroskopie z. T. noch zusätzlich mittels N-Hydroxysuccinimid/1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid(NHS/EDC)-Chemie mit Fluoresceinamin markiert (Markierungsgrad FG ≈ 1 %). Um einen Verbleib der Gele auf bzw. innerhalb des Implantats zu garantieren, müssen diese kovalent mit dem Implantatmaterial verknüpft werden. Hierzu wurden die Implantatoberflächen mithilfe von (3-Glycidyloxypropyl)-trimethoxysilane (GPS) mit Epoxygruppen modifiziert, an die sowohl natürlich vorkommende Hydroxy- als auch die zusätzlich eingeführten Thiolgruppen der HA binden können (Abb. 1b). Die Vernetzung der HA-Moleküle zum Hydrogel sowie die Immobilisierung wurden nach Optimierung der Einzelschritte zur Vereinfachung der Modifizierung der Implantate in einem Schritt durchgeführt (Abb. 1b). Es konnten sowohl Titanimplantate (nicht gezeigt) als auch die für die Folgeversuche als Modellstents dienenden Glasröhrchen mit HA-Gelen bestückt werden (Abb. 2.) Die Hydrogele waren sowohl mit bloßem Auge sichtbar als auch ggf. im Fluoreszenzmikroskop. Gele, die in nicht silanisierten Röhrchen vernetzt wurden, entwichen aufgrund der fehlenden Immobilisierung schon bei leichtem Druck aus dem Röhrchen. Dies zeigt deutlich, dass eine kovalente Bindung der Gele an das Implantatmaterial essenziell ist, um als Ventil den Überdruck im Auge zu regulieren.

Der Flüssigkeitsfluss durch die gelgefüllten Implantate wurde näher untersucht, um den Mechanismus aufzuklären. Hierzu wurden transparente Modellstents aus Glas, bei denen die gleiche Oberflächenchemie wie an Titanstents verwendet werden kann, herangezogen. Die 10 mm langen Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 0,5 mm wurden, wie oben beschrieben, mit GPS silanisiert, und anschließend wurde das HA-Gel (TG = 18 %, 15 mg/ml HA, MW_HA = 60 kDa) im Inneren vernetzt und immobilisiert. Die Verteilung der Flüssigkeit beim Passieren des Implantats wurde im Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Hierzu wurde eine Fluoresceinlösung mithilfe einer Spritze durch den mit einem HA-Gel gefüllten Stent gedrückt (Abb. 3a). In der Mitte des Hydrogels bildete sich reproduzierbar und reversibel ein „Kanal“, durch den die Flüssigkeit floss (Abb. 3b). Um das Verhalten des Gels genauer zu beobachten, wurde im nächsten Schritt ein fluoreszenzmarkiertes Gel (TG = 18 %, 15 mg/ml HA, MW_HA = 60 kDa, FG ≈ 1 %) verwendet. Unter einem manuell erzeugten Flüssigkeitsdruck einer physiologischen Salzlösung („balanced saline solution“ [BSS]) konnte im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden, wie das Gel komprimiert wurde und sich in der Mitte ein Kanal bildete, der sich bei nachlassendem Druck wieder verschloss (Abb. 3c–f). Dieser Vorgang war durch die elastischen Eigenschaften des HA-Hydrogels reversibel und konnte mehrfach wiederholt werden. Es konnte nicht für alle Proben eine Kanalbildung gezeigt werden. Bei einigen Proben kam es zu keinem Flüssigkeitsfluss, und bei sehr hohen Drücken entwich das Gel aus den Röhrchen. Um einen reproduzierbare Kanalbildung und damit einen Flüssigkeitsfluss zu gewährleisten, wurde die Präparation der Hydrogele dahingehend verändert, dass entlang der mittleren Längsachse des Gels die Vernetzung des Hydrogels aufgelöst wurde, sodass sich anschließend entlang dieser Linie in allen Röhrchen ein Kanal bildete. Die Vernetzung des Hydrogels wurde entweder mechanisch durch eine Glasfaser oder über einen Laser unterbrochen.

Um Druckmessungen an den HA-Gel modifizierten Modellstents durchzuführen und damit den Einfluss unterschiedlicher Gel- und Implantatparameter zu untersuchen, wurden 2 Versuchsaufbauten konzipiert: eine schnelle Methode mithilfe der Zugprüfmaschine BOSE Electroforce III 3200 (BOSE ElectroForce Systems Group, Friedrichsdorf, Deutschland), mit der der Einfluss der HA-Konzentration und der Stentlänge an mehreren Proben gemessen werden konnte, und eine auf hydrostatischem Druck basierende Methode, die erlaubte, den realen Gleichgewichtsdruck für die Ventilfunktion der HA-Gele zu bestimmen (Abb. 4).

Für die BOSE wurden die Proben an eine flüssigkeitsgefüllte Spritze angeschlossen, und anschließend wurde der Ausgleichsdruck ermittelt, bei dem sich ein konstanter Flüssigkeitsfluss bei Verschiebung des Spritzenkolbens ergab (Abb. 5a, b). Mehrfachmessungen an einer Probe zeigten, dass der Ausgleichsdruck reproduzierbar ist, jedoch ein „Aktivierungsdruck“ notwendig ist, um das Hydrogel zu komprimieren, sodass sich der oben beschriebene Kanal für die Ventilfunktion bilden kann (Abb. 5a, c). Der Ausgleichsdruck wurde dann abhängig von Röhrchengeometrie und Geleigenschaften ermittelt. Zunächst wurde die Röhrchenlänge bei gleichbleibender Gelzusammensetzung untersucht. Hier zeigte sich, dass sich für längere Röhrchen ein höherer Ausgleichsdruck ergab (Abb. 5d). Wurden höhere HA-Konzentrationen und damit kompaktere HA-Gele mit höherer Rückstellkraft, bedingt durch die räumliche Begrenzung, eingesetzt, stieg der Ausgleichsdruck ebenfalls mit steigender HA-Konzentration.

Der Druck, bei dem sich der Kanal wieder schließt bzw. der den realen Gleichgewichtsdruck darstellt, konnte mit dieser Methode nicht bestimmt werden. Dieser wurde anschließend in Langzeitmessungen mithilfe einer Flüssigkeitssäule über den hydrostatischen Druck ermittelt. Hierzu wurden aus technischen Gründen Glasmodellstents mit 1 cm Länge und einem Durchmesser von 0,5 cm benutzt. Diese wurden mit HA-Gelen (TG = 52 %, 15 mg/ml HA, MW_HA = 100 kDa) gefüllt und vor dem Schwellen in BSS mit 100 µm oder 200 µm-Glasfasern entlang der Mittelachse des Glasröhrchens durchstoßen. Für diese Gele ergaben sich Gleichgewichtsdrücke nahe des erwünschten Augeninnendrucks von ca. 2000 Pa (Abb. 6). Die Röhrchen konnten reproduzierbar mehrfache Überdrücke regulieren und waren dabei über mehrere Tage stabil.