Klinisch-bioinformatische Analyse bei Intelligenzminderung

Eine effiziente Stufendiagnostik würde idealerweise mit dem Test beginnen, der im Verhältnis zur erwartenden Diagnosequote am günstigsten ist. Bei ID beginnt man in der Regel mit der Zytogenetik, in der strukturelle Chromosomenstörungen abgeklärt werden. Ist diese Analyse unauffällig, wird mit der Sequenzierung von einzelnen Genen oder kleinen Gen-Panels fortgefahren. Als letzte Stufe im einheitlichen Bewertungsmaßstab (EBM) der Kassenärztlichen Bundesvereinigung (KBV) ist die Mutationssuche in >25 kb vorgesehen, die üblicherweise als Exom-Analyse (WES) vorgenommen wird, sich aber natürlich auch als Genom-Analyse (WGS) realisieren ließe. Der jeweilige Geldwert, der in der Gebührenordnung pro Analyse erstattet wird, spiegelt nicht die realen Kostenstrukturen wider, die zudem von Labor zu Labor stark variieren. Bei der WES ist für die Kosten entscheidend, auf welcher Sequenzier-Plattform gearbeitet wird. Die Rohdatengenerierung auf einem NextSeq ist beispielsweise mehr als doppelt so teuer wie auf einem NovaSeq, der wiederum ein hohes Probenaufkommen voraussetzt und mit deutlich höheren Investivkosten verbunden ist. Die meisten niedergelassenen Humangenetiker und viele universitäre Standorte können daher nicht konkurrenzfähig Trio-Exome sequenzieren, was sich bereits jetzt zuungunsten der Patienten auswirkt. Wenn bei der Datenerzeugung stärker in partnerschaftlichen Verbünden zusammengearbeitet würde, so hätte dies vermutlich auch eine Produktivitätssteigerung in der klinischen Bioinformatik und einen zügigeren Umstieg auf die WGS zur Folge, die die Lücke bei der Mutationssuche im nicht kodierenden Bereich schließen würde. Die WGS bietet zudem den Datensatz, der alle Analysen aus der Zytogenetik erlauben würde und darüberhinaus die Detektion von Strukturvarianten im Bereich 20 bp–2 kb ermöglichen würde.

Interessanterweise könnte schon jetzt in der Übergangsphase zu WGS die parallele Datengenerierung von WES und „array-based comparative genomic hybridization“ (Array-CGH) wirtschaftlich sinnvoll sein, wenn die potenzielle Einsparung an Arbeitszeitkosten für die Befunderstellung über denen der zusätzlichen Rohdatengenerierung liegt. Dies kann an einem Gedankenbeispiel veranschaulicht werden: Wenn Ihnen eine Liste hochqualitativer Varianten aller Größenordnungen (circa 30.000 SNVs („single nucleotide variants“) und Indels von 1–20 bp aus der WES und 10–20 Insertionen, Duplikationen und Deletionen >2 kb aus der Array-CGH) von einem Trio (Patient plus nicht betroffene Eltern) vorläge und Sie die Diagnosequote in einer vorgegebenen Analysezeit maximieren müssten, wie würden Sie vorgehen? Ein Abgleich mit Datenbanken, die pathogene Mutationen enthalten, lässt sich gut automatisieren und kann insbesondere bei den rezessiven IDs schnell einen Treffer landen. Bei den weiteren seltenen Varianten lohnt sich zunächst ein Blick auf bekannte pathogene Mutationen in Datenbanken und de novo Mutationen (DNMs) aus WES und Array-CGH; diese stellen die häufigste Ursache bei ID dar und sind üblicherweise auf eine geringe Anzahl im Indexpatienten beschränkt. Die Interpretation ist zudem vergleichsweise einfach, da bereits eines der ACMG-Kriterien starker Evidenz für Pathogenität erfüllt ist [3]. Labore mit ausgefeilten Prozessabläufen berichten davon, dass sich auf diese Weise circa die Hälfte der Fälle, in denen letztlich eine molekulargenetische Diagnose benannt werden kann, in unter einer halben Stunde lösen lassen [4]. Bei den restlichen Fällen ist insbesondere eine effiziente und umfassende Kommunikation über den Phänotyp zwischen dem einsendenden Kliniker und dem Labor entscheidend. Nur in wenigen Labors erfolgt eine elektronische Auftragsvergabe, bei der auch Phänotypinformation zum Beispiel aus dem Klinikinformationssystem (KIS) übertragen wird, sodass viel Zeit beim Datenimport und der Ergänzung unvollständiger Angaben verloren geht. Eine gute KIS/Labor-Informationssystem(LIMS)-Integration spart nicht nur Arbeitszeit in der Diagnostik, sondern ist auch die Grundlage für Phenom-weite Assoziationsstudien, die bei Varianten unklarer Signifikanz und insbesondere ungelösten Fällen von großem wissenschafltichen Interesse sein werden.

Die zum Teil frei zugänglichen Datenbanken wie ClinVar, LOVD und HGMD umfassen derzeit schon über 75.000 pathogene Mutationen, die monogenen Krankheitsbildern zugeordnet sind [3, 4]. Anhand der phänotypischen Auffälligkeiten des Patienten, die die Indikationsstellung begründen, kann die Abfrage zudem auf Krankheitsgene beschränkt werden, für die vergleichbare Symptome bereits beschrieben wurden. Umfangreiche Feature-Gen-Zuordnungen stellt die Human Phenotype Ontology [5] zur Verfügung (https://​hpo.​jax.​org/​app/​download/​annotation). Wenn in dieser Datenbank-Abfrage auch alle im Labor als pathogen befundeten Mutationen berücksichtigt werden, lassen sich in den folgenden Filterschritten zudem alle generierten Datensätze verwenden und die Genotyp-Frequenz-Filter stringenter einstellen. Man braucht also keine Sorge haben, dass eine pathogene bereits befundete Mutation fälschlicherweise herausgefiltert wird, nur weil sie in der hauseigenen Datensammlung gehäuft aufgetreten ist.

Sollte sich der Fall nicht mithilfe pathogener Mutationsdatenbanken lösen lassen, so steht als Nächstes die Suche nach DNMs an. Bei gut eingestellter Pipeline liegt der Erwartungswert einer Einzelbasensubstitution oder eines kleinen Indels im Exom nahe an der „wahren Basisrate“ von 1 DNM pro Individuum der Allgemeinbevölkerung (Mutationsrate von 1,2*10⁻⁸/bp mal Größe der Zielregion mal 2 für diploid, ca. 60–100 Mb, je nach „enrichment kit“). Der wichtigste Kniff für hochqualitative „DNM calls“, insbesondere bei Indels, ist neben einem guten „realignment“ ein Abgleich mit „variant calls“ von Proben, die mit der gleichen Pipeline prozessiert wurden. Dies ist erstaunlicherweise selbst bei nur einigen Hundert verfügbaren Kontrollen bereits effektiver als ein Filter mit „Genome Aggregation Database“ (gnomAD) [6].

Bei diesen großen, aus über 100.000 Individuen aggregierten Daten ist es aufgrund von Sequenzier-Artefakten und Mosaiken außerdem zu empfehlen, eine DNM erst zu verwerfen, wenn sie häufiger als fünf Mal beobachtet wurde. So wird das Risiko reduziert, dass eine Variante, die als Mosaik nicht krankheitsverursachend ist und daher in gesunden gnomAD-Kontrollen auftreten könnte, herausgefiltert wird.

In einer Kohorte von Patienten mit ID spiegelt die Differenz der beobachteten DNM-Rate zur Basisrate übrigens auch annähernd die Diagnosequote wider, die mittels De-Novo-Analyse erzielt werden kann. In vielen ID-Kohorten beträgt diese Rate ca. 1,3–1,5, d. h. es müssen in der Regel pro Fall weniger als 2 De-novo-Mutationen begutachtet werden, um damit bis zu 50 % der Fälle zu diagnostizieren. Wenn wie bereits erwähnt in diese Analyse ebenfalls noch die De-novo-Mikrodeletionen und -Duplikationen aus der Array-CGH eingeschlossen werden, die äußerst selten in der gesunden Bevölkerung anzutreffen sind, ist die Diagnosequote bei kaum verändertem Arbeitsaufwand entsprechend höher.

Bioinformatisch deutlich anspruchsvoller ist die Analyse von Varianten, wenn kein Trio zur Analyse zur Verfügung steht oder von einem rezessiven Erbgang ausgegangen wird.

Dennoch können für Varianten in Genen, für die der Vererbungsmodus des Krankheitsphänotyps sowie dessen Prävalenz bekannt ist, Allel-Frequenz- oder besser noch Genotyp-Frequenz-Filter passgenau eingestellt werden. Es sollte dabei beachtet werden, dass die Schwellenwerte hierbei immer auf die Subpopulationen anzuwenden sind. Eine Variante, die zum Beispiel in der finnischen Bevölkerung in 10 aus 1000 homozygot anzutreffen ist, verursacht auch in keiner anderen Subpopulation ID, selbst wenn sie in der gesamten gnomAD-Kohorte nur einen Anteil von unter 0,0001 hat. Auf diese Weise verbleiben von zum Beispiel initial ca. 2000 in SysID [7] gelisteten ID-Genen üblicherweise deutlich weniger als 100 Kandidaten übrig [2].

In die Priorisierung dieser Gene sollte die Information von populationsgenetischer, molekularer und phänotypischer Ebene einfließen. Methoden des maschinellen Lernens sind gut geeignet, Scores unterschiedlicher Vorhersagewerkzeuge, wie zum Beispiel MutationTaster, „combined annotation dependent depletion“ (CADD) oder Phenomizer zu verarbeiten [8‐10]. Zu einer ganz wichtigen Ressource für die Interpretation von DNMs in noch nicht beschriebenen ID-Genen sind auch die „pLI scores“ geworden. Mit diesen Werten, die aus den Abweichungen von beobachteten zu erwarteten „nonsense“-Mutationen im gnomAD-Datensatz berechnet wurden, lässt sich die Wahrscheinlichkeit einer Haploinsuffizienz abschätzen [11]. Wenn der Phänotyp rezessiv in Erscheinung tritt, ist die zu erwartende Abreicherung an „loss of function“-Mutationen deutlich geringer, sodass der Ansatz von Samocha et al. [11] bei diesen Genen gute Vorhersagen erst bei Kohortengrößen weit über eine Million liefern würde.

In der PEDIA(Prioritization of Exome Data by Image Analysis)-Studie (www.​pedia-study.​org) fließt erstmals neben den bereits genannten Scores auch ein Ähnlichkeitswert aus der computergestützten Gesichtsanalyse ein. Bislang wird hierfür das künstliche neuronale Netzwerk DeepGestalt eingesetzt, welches auch in Face2Gene Verwendung findet [12]. Eine weitere Initiative, die einen ähnlichen Ansatz des maschinellen Lernens verwendet, ist Minerva&Me (https://​www.​minervaandme.​com/​).

In der PEDIA-Studie wurden über 600 molekulargenetisch gelöste Fälle zusammengetragen, um einen frei zugänglichen Trainingsdatenset zu bilden. Insgesamt sind darin 105 unterschiedliche monogene Erkrankungen vertreten, davon mehr als die Hälfte mit ID, die sich alle mittels Exom-Analyse diagnostizieren ließen. Wir haben diese Daten zum Training eines Klassifikators verwendet, der im Testmodus über 98 % der krankheitsverursachenden Mutationen an erster Stelle listet [13].

Der Beitrag der einzelnen Eingabewerte zum PEDIA-Score veranschaulicht deren Bedeutung in der Diagnosefindung. Auch wenn faziale Auffälligkeiten in der PEDIA-Studie bislang ein Einschlusskriterium darstellten, ist das optimale Gewicht der Gesichtsanalyse am PEDIA-Score von knapp einem Drittel doch beachtlich und unterstreicht den Wert der Dysmorphologie. Interessanterweise ließen sich hierbei keine Unterschiede in der Performanz zwischen rezessiven und dominanten Formen der ID beobachten. Diese nächste Generation der Phänotypisierungswerkzeuge (next-generation phenotyping, NGP) ermöglicht es nun erstmals auch Ähnlichkeiten zu quantifizieren und die zunehmend hinderliche Unterscheidung zwischen syndromaler und nicht-syndromaler ID damit zu beenden. In der DDD-Studie war der Anteil, der bis dahin ungelösten Patienten mit Mutationen in „syndromalen“ Genen überraschend hoch und es wäre interessant zu untersuchen, ob der PEDIA-Ansatz auch auf dieser Kohorte mit milden fazialen Auffälligkeiten in ähnlichem Maße die Performanz steigern könnte [14].

Die zentrale Aufgabe der klinischen Bioinformatik ist es, den Entscheidungsprozess in der Diagnostik, der meist ein Zusammenspiel von Genetikern, Klinikern anderer Fächer und Biologen darstellt, zu unterstützen. Diese unterschiedlichen Expertenmeinungen stützen sich meist auf unterschiedliche Evidenzen und lassen sich daher statistisch betrachtet mittels Bayes verknüpfen [15]. Mit computergestützter Bildanalyse lässt sich nun erstmals auch das ACMG-Kriterium PP4 „using phenotype to support variant claims“ anhand von Gesichtsaufnahmen quantifizieren. In Zusammenschau aller Evidenzen wird der Grad der Glaubwürdigkeit, dass eine Mutation krankheitsverursachend ist, aus allen zur Verfügung stehenden Scores berechnet. Die Güte eines solchen Ansatzes lässt sich auch anhand großer Patientenkollektive ermitteln und würde dadurch die Konsensbildung erleichtern, an welchem Punkt aus einem Diagnostikfall ein Forschungsfall werden darf. Wenn kostendeckend gearbeitet werden soll, müsste bei den aktuellen Vergütungsmöglichkeiten ein Diagnostikbefund für Array-CGH plus WES in unter 3 Stunden erstellt werden. Die beschriebenen bioinformatischen Analyseansätze können maßgeblich dazu beitragen, dass bei der Indikationsstellung Intelligenzminderung eine hohe Diagnoserate erreicht wird. Wenn mit einer wohldefinierten SOP („standard operating procedure“) bereits 98 % aller lösbaren, also über 50 % aller vorstelligen Fälle befundet werden können, ist es akzeptabel einem „clinician scientist“ den Rest für eine zeitaufwendigere Nachbereitung zu überlassen. Im Rahmen von Translate NAMSE gibt es hierfür ein klares Stufenkonzept von Fallkonferenzen und Reanalysen, in dem zusätzlich alternative bioinformatische Workflows zur Anwedung kommen. Am Ende steht die Abfrage von Datenbanken wie Matchmaker und VarWatch zur Beurteilung von Varianten unklarer Signifikanz und zur Identifikation neuer Gen-Phänotyp-Beziehungen im Forschungskontext [16].